专利名称：多重荧光定量rt-pcr同时检测新甲型h1n1及人季节性h1n1和h3n2流感病毒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术应用领域。本发明是用基于多重荧光定量RT-PCR技术同时 检测人新甲型Hmi及人季节性Hmi和H3N2流感病毒HA基因。用于各级疾病预防控制机 构，流感检测网络实验室，哨点医院对人新甲型Hmi及人季节性Hmi和H3N2流感病毒的 同时检测和监测。
背景技术：
新甲型Hmi流感(原称人感染猪流感病毒)是一种新的甲型Hmi病毒引起的急 性呼吸道传染病，具有较强的传染性，可通过近距离飞沫和接触传播，这种新型病毒是美国 于2009年4月在人体中首次检出的。随后，该病毒在世界范围内蔓延开来。序列研究表明， 该病毒是由人、禽和猪源流感病毒重配的产物。目前，人们对该病毒的毒力、传染性等特征 有限的认识使得开发快速检测及分型技术来筛查可疑病例，从而实现对疫情蔓延的控制以 及及时的抗病毒治疗显得尤为迫切。早期有关流感病毒分型研究使用荧光定量RT-PCR、芯片、流式细胞仪和测序等方 法做为终端检测系统，但这些方法大多不能检测新甲型Hmi流感病毒。尽管有些方法得 到进一步发展，但仍依赖于昂贵的设备，并且灵敏度也不高。目前已经开发了四种荧光定 量RT-PCR技术包括HPA (HI) ν (英国卫生防护机构)、CDC (HI) ν (美国疾控中心)、HPA (Ni) ν(英国卫生防护机构)和S-OIV(国家病毒参比实验室，爱尔兰)虽然可以检测新甲型Hmi 流感病毒和季节性流感病毒，但这些方法都是多管多重荧光定量RT-PCR，操作繁琐，时间较 长，成本较高。国内达安基因公司和科华公司等开发的荧光定量RT-PCR检测新甲流的试剂 已得到了中国FDA的批准，不过这些方法都没有包括检测季节性Η3Ν2，不能实现单管同时 检测2种季节性流感和新甲型流感。本专利成功建立了一套4重荧光定量RT-PCR方法可 实现单管同时检测新甲型Hmi流感病毒、人季节性Hmi流感病毒、人季节性Η3Ν2流感病 毒，并对该法的特异性和灵敏度做了分析，整个反应不到2个小时。利用阳性临床标本进行 验证，结果表明该方法和WHO推荐的方法的检测结果完全符合。这将为提高我国流感监测 网络实验室和哨点医院的监测能力，实现对发热病人的快速筛查提供了有力的技术保障。
发明内容
1.以WHO公布的引物序列为参考，从NCBI上下载已知序列使用CLUSTAL X软件进 行序列比对，选取对于针对各个靶病毒高度保守而对于其它型别高度特异的基因区段，由 Primer I^remierS设计四重引物和探针，如表一表一各引物和探针序列TABLE 1. RT-PCR Primers and probes designed for this study
权利要求
1. 一种用于同时检测人新甲型Hmi流感病毒、人季节性甲型Hmi流感病毒和人季节 性甲型H3N2流感病毒HA基因的多重荧光定量RT-PCR技术，其中包括用于人新甲型Hmi 流感病毒、人季节性甲型Hmi流感病毒和人季节性甲型H3N2流感病毒HA基因检测的引物 和探针及荧光标记。
2.权力要求1所述的多重荧光定量RT-PCR技术的引物和探针包括表1所列的基因序 列及其每种序列的互补序列或变体和标记的荧光。
3.权力要求1所述的多重荧光定量RT-PCR检测技术包括人新甲型Hmi流感病毒、人 季节性甲型Hmi流感病毒和人季节性甲型H3N2流感病毒及其变异株。
4.权力要求3所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，流感检测网络实 验室，哨点医院用于人新甲型Hmi流感病毒、人季节性甲型Hmi流感病毒和人季节性甲型 H3N2流感病毒HA基因的同时检测和监测。
5.权力要求ι所述的同时检测人新甲型Hmi流感病毒、人季节性甲型Hmi流感病毒 和人季节性甲型H3N2流感病毒HA基因的多重荧光定量RT-PCR技术的反应程序和检测程 序。
全文摘要
本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，流感检测网络实验室，哨点医院等用于对发热病人咽拭子等标本的人新甲型H1N1流感病毒及人季节性H1N1和H3N2流感病毒HA基因的同时检测和监测。具体通过计算机软件分析人新甲型H1N1流感病毒及人季节性H1N1和H3N2流感病毒HA基因的保守序列，分别设计出两条相对应的引物和探针，进行单管多重(4重)荧光定量RT-PCR(包括内参基因)，整个反应不到2个小时。本发明克服了常规多管多重荧光定量RT-PCR方法操作繁琐，时间较长，成本较高的缺点，对于追踪新甲流和季节性流感可能的共感染和重组提供了良好的工具，其高特异、高灵敏、快速的特点为实现对大量流感疑似病例的快速准确筛查提供了有力的技术支撑。
文档编号C12R1/93GK102086476SQ200910224080
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月4日 优先权日2009年12月4日
发明者李德新, 王淼, 秦萌, 聂凯, 舒跃龙, 董小平, 马学军 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所