一种转基因大豆食用油荧光定量pcr检测的方法
【专利摘要】本发明属于生物检测【技术领域】，具体为一种转基因大豆食用油荧光定量PCR检测的方法。针对食用油脂中核酸含量低、破坏严重、DNA序列片段短的特点，本发明利用DNA提取试剂盒法加核酸富集处理步骤，有效地从大豆食用油中提取到可用于PCR扩增反应的DNA模板，设计并筛选了能有效扩增DNA模板的引物，通过实时荧光定量PCR技术定性检测出了大豆的内源基因以及外源调控序列，为食用油原料是否转基因的检验提供了一种稳定有效的方法。本发明的方法也适用经过高温处理（烹饪）以后的食用油。
【专利说明】—种转基因大豆食用油荧光定量PCR检测的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测【技术领域】，具体涉及一种转基因大豆植物油的荧光定量PCR检测方法。
【背景技术】
[0002]大豆是重要的食用油、食用蛋白和饲用蛋白原料，世界上对大豆的需求与日俱增，为此人们应用转基因技术对大豆的遗传特性进行定向改造，使之具有营养成分高，产量高，抗虫等优良性状。随着基因工程技术的发展，转基因大豆等农作物以其良好的抗逆性、高产量、相对较低的生产成本，很快占据了世界市场，实现了其市场化和商品化。然而这些转基因作物及其食品对生态环境及人类健康是否安全，始终是公众关切的大问题。据此，国际和国内先后出台了转基因农产品标识管理政策，以保护消费的知情权和选择权。按照2002年中国农业部出台的相关规定，我国市场上的转基因食用油必须进行明确标识。为此就需要有与之相配的转基因食用油的检测方法。而油脂因为已经经过压榨或者萃取分离，其中DNA的成分很少，且结构不完整，难以适用通用的DNA检测技术。目前，市场上大豆的转基因技术是采用35S启动子和目的基因同时转入的策略，国际通用的方法也是以PCR技术为平台，通过特异扩增转基因调控原件花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、胭脂碱合酶NOS终止子以及目的基因抗除草剂基因CP4-EPSPS来筛选检测转基因食品。但食用油经过高温、高压、萃取等步骤高度精炼以后，核酸严重破坏，含量极低，提取非常困难，因此如何高效提取精炼油中的DNA始终是转基因检测的瓶颈难点。尽管油脂中转基因成分的检测已有相关国家标准出台，但周红霞等通过多次实验发现，标准中介绍的方法并不能完全有效地提取出油脂中的DNA。他们参照并改进前人介绍的方法，用CTAB法加核酸富集处理步骤，从15-20ml的油样中提取到了能够用于后续PCR检测的DNA，提高了 DNA提取的有效性，但PCR扩增产物的电泳检测效果不佳，可能是由于提取到的核酸量非常少而影响了 PCR的扩增效果。本发明在前人研究的基础上，用改进的CTAB提取试剂盒法加核酸富集处理步骤，稳定高效地提取出了大豆食用油中适用于荧光定量PCR扩增的DNA，采用灵敏的SYBR Green I实时荧光定量PCR技术为转基因大豆食用油DNA的提取和检测提供一种稳定有效的方法。并采用实际的烹饪温度处理食用油，验证本方法对烹饪过的大豆油也同样适用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种转基因大豆食用油荧光定量PCR检测的方法，并确证对于高温处理后的食用油检测也同样适用。
[0004]本发明提供的转基因大豆食用油的分子检测方法，用tRNA、18S、Lec、35S、NOS引物对油样DNA进行SYBR Green I实时荧光定量PCR检测，只要tRNA、18S、Lectin基因中有一个基因片段被扩增出来，就可确认提取到了食用油DNA，这种方法极大提高了 DNA的检出率，降低了假阴性结果，用35S和NOS引物扩增用来判断所用油样是否转基因。具体步骤如下:(1)用CTAB植物基因组DNA提取试剂盒(选购自北京艾德莱生物科技有限公司)提取食用油中的微量DNA。即将食用油中的核酸富集到CTAB裂解液中，通过试剂盒操作纯化裂解液中的DNA，并将DNA储存在洗脱缓冲液EB中，存放在2_8°C ； 提取的具体操作步骤为:对于某种大豆食用油，取两支50ml的试管，每管加入2ml试剂盒中的裂解液PL以及40ml食用油，颠倒混匀，45°C，250r/min震荡lh，10000r/min离心5min,去油相，在水相中再加入油相40ml，重复上述操作4次，将两支试管中第4次离心后保留的水相按每管600ul分装到2ml EP管中，每管加入600ul氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒充分混匀几分钟，13000rpm离心5min，然后按试剂盒后续操作说明进行。从DNA提取后，所有实验均设阳性对照和空白对照；
(2)针对大豆的内源基因tRNA、18S、Lectin设计一系列扩增不同长度片段的引物，筛选出一套扩增效果最好的引物，得到tRNA、18S、Lectin三对扩增大豆食用油DNA效果最好的引物；
引物为:
tRNA: F:5’ - CGAAATCGGTAGACGCTACG-3’ (SEQ.1D.N01)
R:5’ -TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3’ (SEQ.1D.N02)
18S: F:5’ -ATGATAACTCGACGGATCGC-3， (SEQ.1D.N03)
R:5’ -CTTGGATGTGGTAGCCGTTT-3’ (SEQ.1D.N04)
Lec: F 5’ - ATAAGAATGCGGCCGCGGCTTGCCTTCTTTCTC-3’ (SEQ.1D.N05)
R 5’ -CAATGGAATCCGAGGAGTCCCTTCGATCTGTCACATTT-3’ (SEQ.1D.N06)；
(3)设计大豆外源基因35S启动子引物、NOS终止子引物，分别为:
35S: F:5' -CTAACAGAACTCGCCGTAAAGA -3’ (SEQ.1D.N07)
R:5' -AGATAGCTGGGCAATGGAAT -3’(SEQ.1D.N08)
NOS: F 5’ -GTTCATTTCATTTGGAGAGGGATCGTTCAAACATTTGG-3’ (SEQ.1D.N09)
R 5’ -ACTCTTGTGGTGTTTGTGGCGATCTAGTAACATAGATGA-3’ (SEQ.1D.NOlO)；
(4)按照常规方法提取非转基因大豆的基因组DNA进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入tRNA、18S、Lec引物进行扩增(扩增的参数如下:扩增反应体积为25 μ 1，2 XPremixEx Taq 12.5 μ I,浓度为10 μ mol/L的正向引物0.5 μ 1，浓度为10 μ mol/L的反向引物
0.5μ l,ddH20 9.5 μ I, DNA模板2.0 μ 1，扩增反应条件:96°C IOmin 预变性；96°C 15s，引物的退火温度30s，72°C 15s，循环数36);
(5)扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制tRNA、18S、Lectin基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线；
(6)对含有带35S启动子和NOS终止子序列质粒的细菌进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入35S启动子和NOS终止子引物进行PCR扩增(扩增的参数如下:扩增反应体积为 25 μ 1，2XPremix Ex Taq 12.5 μ I,浓度为 10 μ mol/L 的正向引物 0.5 μ 1，浓度为10 μ mol/L的反向引物0.5 μ 1，ddH20 9.5 μ I, DNA模板2.0 μ 1，扩增反应条件:96°CIOmin预变性；96°C 15s，引物的退火温度30s, 72°C 15s,循环数36);测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，并绘制35S启动子和NOS终止子引物的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线；
(7)用CTAB植物基因组DNA提取试剂盒(选购自北京艾德莱生物科技有限公司)提取待检测大豆食用油中的微量DNA，然后向DNA提取液中分别加入tRNA、18S、Lec、35S和NOS引物，进行扩增，每个引物重复3次；扩增后，测定DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的各基因的定量PCR标准曲线，估计提取液中DNA的含量，从而判断是否从食用油中提取出了可供PCR检测的DNA，各内源基因的损失情况以及样品是否为转基因大豆食用油。
[0005]本发明还模拟实际的烹饪操作，用上述的提取方法和实时荧光定量PCR检测方法探索加热处理对食用油中DNA含量的影响。即加热处理后的大豆食用油同样适用本发明方法。例如:
(1)对食用油分别进行处理:160°Clmin,160°C 3min,160°C 5min，微波炉中火加热3min,微波炉中高火加热3min, 121度高压灭菌；
(2)按照前述提取方法提取经过加热处理的食用油的DNA，并对提取到的DNA进行检测；将加热处理后的油的DNA拷贝数与加热未处理的油的DNA拷贝数进行对比，从而判断各加热处理对油中DNA含量的影响；
(3)根据加热对油中DNA含量的影响，确证对高温处理后的食用油的检测本发明依然有效。
[0006]本发明具有的优点和效果如下: 本发明所设计的食用油DNA的提取方法成本低，操作简单，从食用油中稳定高效地提取出了可供荧光定量PCR检测的DNA。针对食用油中核酸含量极低、破坏严重、DNA序列片段短的特点，设计了适用于扩增大豆食用油DNA的一系列引物，得到了较好的扩增效果，极大提高了提取的食用油DNA的检出率。采用SYBR Green I实时荧光定量PCR技术，使得检测灵敏，准确，简单，可靠。模拟实际的烹饪操作，验证加热处理对食用油中DNA含量的影响，验证本发明的方法对于高温处理后的油样也适用。
【具体实施方式】
[0007]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0008]实施例1大豆食用油DNA的提取 材料:大豆食用油
东北大豆(做阴性对照)
试剂:CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒选购自北京艾德莱生物科技有限公司；步骤:对于每种食用油，取两支50ml的试管，每管加入2ml试剂盒中的裂解液PL以及40ml食用油，颠倒混匀，45°C, 250r/min震荡lh, 10000r/min离心5min,去油相,在水相中再加入油相40ml，重复上述操作4次，将两支试管中第4次离心后保留的水相按每管600ul分装到2ml EP管中，每管加入600ul氯仿/异戍醇(24:1),颠倒充分混匀几分钟，13000rpm离心5min，然后按试剂盒后续操作说明进行。即将320ml食用油中的核酸富集到4ml的CTAB裂解液中，通过试剂盒操作纯化裂解液中的DNA，最后将DNA储存在IOOul洗脱缓冲液EB中，存放在2-8 °C。
[0009]用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒按照操作说明提取东北大豆的基因组DNA，用作阴性对照。
[0010]实施例2 tRNA、18S、Lectin、35S、NOS 基因的 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR检测方法。
[0011]所用油样:购自超市与网络商城的大豆食用油30份。
[0012]将已经提取到的大豆基因组DNA稀释10倍、100倍、1000倍，分别用tRNA、18S、Lec引物扩增上述浓度梯度，每个浓度设3个重复，得到每个基因扩增的标准曲线。
[0013]将含有带35S启动子序列质粒的细菌稀释10倍、100倍、1000倍，分别用35S、N0S引物扩增上述浓度梯度，每个浓度设3个重复，得到35S、N0S启动子扩增的标准曲线。
[0014]扩增反应体积为25μ1, 2 X Premix Ex Taq 12.5 μ 1，浓度为10 μ mol/L的正向引物0.5 μ 1，浓度为10 μ mol/L的反向引物0.5 μ l，ddH20 9.5 μ I, DNA模板2.0 μ 1，扩增反应条件:96°C IOmin预变性；96°C 15s，引物的退火温度30s，72°C 15s，循环数36。
[0015]分别用tRNA、18S、Lectin、35S、N0S基因引物扩增提取的30个油样DNA，以水作空白对照，根据标准曲线判断是否从油样DNA扩增出以上基因片段，从而确定是否提取出了油样DNA以及鉴别油样是否含转基因成分。
[0016]结果:以在36个循环内是否读取得到CT指为标准，判断是否得到阳性扩增。对于tRNA,得到阳性扩增率为60% ;对于18S，得到阳性扩增率为100% ;对于Lectin，得到阳性扩增率为46.7%。综上所述，可以判定所有油样的DNA都被提取出来，所有样本的DNA提取液中都含有18S基因片段。而其他基因有部分样本没有阳性扩增，可能是由于这种基因破坏比较严重，含量很低，引物的扩增效率不同，或者虽然有扩增但是低于实验设定的CT阈值。但是综合分析可以肯定所有样本都提取到了 DNA。
[0017]对于35S启动子与NOS终止子，获得了同样的结果。标识为转基因的样本的阳性扩增率为100%，标识为非转基因的样本的阳性扩增率为86.7%，未标识的样本的阳性扩增率为100%，东北大豆阴性对照的阳性扩增率为0%。
[0018]说明市面上绝大部分大豆食用油，包括明确标识为非转基因的，实际上均为转基因大豆食用油或者混有转基因大豆成分。
[0019]实施例3:加热处理对食用油中DNA含量的影响
对大豆油分别进行以下处理:160°C lmin,160°C 3min,160°C 5min，微波炉中火加热3min，微波炉中高火加热3min，高压灭菌，未处理对照。提取处理后的油样DNA，分别用tRNA、18S、Lectin、35S、NOS基因引物扩增上述7个油样，用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测，并根据标准曲线对比处理后和未经处理的油样DNA含量的变化，以及不同加热程度对油中DNA含量的影响。
[0020]结果:对于每个基因，未处理对照所提取出的基因片段浓度都不是最高的，即处理后基因的浓度并不比不处理的低，样品存在的差异可能只是由于提取效率不同导致，但也可以反映出来以上处理对基因稳定性及浓度的影响不大。同一温度，处理时间不同对基因稳定性及浓度也无明显影响；相同时间用不同温度处理，对基因稳定性及浓度无明显影响；短时间内高压处理对基因片段的浓度的也无明显影响。由此可见，在一般条件下，油中的基因序列可稳定存在，长期保存，使得转基因植物油的基因鉴别方法更加可靠。而且在一般烹饪条件下(温度一般不高于160度，时间不长于5min)，植物油中的基因片段仍可存在，可适用本发明的方法来检测是否转基因。
【权利要求】
1.一种转基因大豆食用油荧光定量PCR检测的方法，其特征在于具体步骤为: (1)用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取大豆食用油中的DNA； (2)设计并筛选得到扩增tRNA基因的一对引物，扩增18S基因的一对引物，扩增Lectin基因的一对引物，分别为:
tRNA: SEQ.1D.NOl
SEQ.1D.N02
18S: SEQ.1D.N03
SEQ.1D.N04
Lec: SEQ.1D.N05
SEQ.1D.N06 (3)设计大豆外源基因35S启动子引物、NOS终止子引物，分别为:
35S: SEQ.1D.N07
SEQ.1D.N08
NOS:SEQ.1D.N09
SEQ.1D.NOlO (4)提取非转基因东北大豆的基因组DNA，进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入tRNA、18S、Lec引物进行扩增； (5)扩增后，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，该Ct值与拷贝数的自然对数呈线性关系，据此绘制tRNA、18S、Lectin基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线； (6)对含有带35S启动子和NOS终止子序列质粒的细菌进行梯度稀释，然后向各稀释液中加入35S启动子和NOS终止子引物进行扩增，测定各稀释液中相关荧光标记物的Ct值，并绘制35S启动子和NOS终止子引物的SYBR Green I实时荧光定量PCR标准曲线； (7)向DNA提取液中分别加入tRNA、18S、Lec、35S和NOS引物，进行扩增，每个引物重复3次；扩增后，测定DNA提取液中相关荧光标记物的Ct值，然后根据上述绘制的各基因的定量PCR标准曲线，估计提取液中DNA的含量，从而判断是否从食用油中提取出了可供PCR检测的DNA，各内源基因的损失情况以及样品是否为转基因食用油。
2.根据权利要求1所述的转基因大豆食用油荧光定量PCR检测的方法，其特征在于，所述大豆食用油经过加热处理。
3.根据权利要求1所述的转基因大豆食用油荧光定量PCR检测的方法，其特征在于，所述用CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒提取大豆食用油中DNA的步骤为:将食用油中的核酸富集到CTAB裂解液中，通过试剂盒操作纯化裂解液中的DNA，并将DNA储存在洗脱缓冲液EB中，存放在2-8 °C。
【文档编号】C12Q1/68GK103642934SQ201310743102
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】皮妍, 段昱竹, 蒋科技, 张丹, 卢大儒, 乔守怡 申请人:复旦大学