一种用于谷氨酸棒杆菌基因改造的新型质粒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种在谷氨酸棒杆菌基因组中同时实现基因敲除与过表达并不带有任何抗性标记的新新型质粒，属于基因工程领域。本发明中所公开的新型质粒，能在谷氨酸棒杆菌基因组中同一时间内实现基因敲除和另一基因的过表达而不带有任何抗性标记。插入在谷氨酸棒杆菌基因组中的过表达的基因在宿主中能够稳定的遗传并表达。另一方面，该方法运用双交换同源重组原理获得目的重组菌株，这克服了单交换同源重组过程中低重组效率的缺点，从而大大提高获得目的重组菌株的机率。该方法的提出，将有利于对谷氨酸棒杆菌的基因工程改造，减少了因引入抗性标记基因的影响。
【专利说明】一种用于谷氨酸棒杆菌基因改造的新型质粒及其应用
【技术领域】[0001]本发明涉及一种在谷氨酸棒杆菌基因组中实现基因敲除和过表达的新型质粒及其应用，尤其是一种通过一次重组同时实现基因敲除和过表达而不带任何抗性标记，属于基因工程【技术领域】，。
【背景技术】
[0002]谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是从土壤中分离出的非治病菌。该菌在经济上具有重要作用，已被广泛用于工业发酵生产各种氨基酸，如L-谷氨酸和 L-赖氨酸(Georgi 等，2005，Lysine and glutamate production by Corynebacteriumglutamicum on glucose, fructose and sucrose: Roles of malic enzyme andfructose-1, 6-bisphosphatase.Metab.Eng.7 (4):291-301 和 Becker 等，2011，Fromzero to hero-design-based systems metabolic engineering of Corynebacteriumglutamicum for L-1ysine production.Metab.Eng.13(2):159-168.)。随着直接作用于DNA技术的发展以及谷氨酸棒杆菌全基因组的解析，利用基因工程手段改良谷氨酸棒杆菌成为可能，并逐渐取代经典的随机突变育种(Tauch等，2003，Plasmids inCorynebacterium glutamicum and their molecular classification by comparativegenomics.J.Biotechnol.104(1-3):27-40
[0003]利用表达质粒介导的氨基酸合成途径中关键性酶基因的过表达是目前对谷氨酸棒杆菌进行基因改造的主要手段(Ikeda和Katsumata，1998，A novel system withpositive selection for the chromosomal integration of replicative plasmid DNAin Corynebacterium glutamicum.Microbiol.144 (Pt7): 1863-1868)。然而，利用表达质粒介导基因的过表达必将在谷氨酸棒杆菌细胞内引入抗性基因(如氨苄青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因等)，为了维持质粒的稳定，发酵过程中需向培养基中添加一定浓度的抗生素。发酵过程中添加抗生素存在一些不利因素:⑴增加成本；⑵改变谷氨酸棒杆菌的生理机能；⑶增加人们对抗生素恐慌(Tauch等，2002，The alanine racemase gene air is analternative to antibiotic resistance genes in cloning systems for industrialCorynebacterium glutamicum strains.J.Biotechnol.99(I):79-91 ；Zhou 等，2009，Areusable method for construction of non-marker large fragment deletionyeast auxotroph strains: A practice in Torulopsis glabrata.J.Microbial.Meth.76 (I): 70-74)。因此，去除表达质粒介导基因的过表达，将目的基因插入到基因组中过表达是未来谷氨酸棒杆菌利用基因工程手段改造的主要趋势。
[0004]含有一段基因组中DNA片段和抗性基因的非复制型质粒已经被构建并成功运用在谷氨酸棒杆菌菌株改良中(Correia等，1996，Targeted integration of foreigngenes into repetitive sequences of the Brevibacterium lactofermentum genome.FEMS Microbiol.Lett.142(2-3):259-264 和 Amador 等，2000， A Brevibacteriumlactofermentuml6S rRNA gene used as target site for homologous recombination.FEMS Microbiol.Lett.185 (2): 199-204)。该非复制型质粒可以将携带的需表达的目的基因插入到基因组中，而不需要表达质粒的介导。然而目的菌株的获得是通过单交换同源重组，该重组方法获得目的菌株的概率低(Ikeda和Katsumata, 1998, A novel system withpositive selection for the chromosomal integration of replicative plasmid DNAin Corynebacterium glutamicum.Microbiol.144(Pt7): 1863-1868)。另一方面，所获得的目的菌株还携带有抗性基因。
[0005]在本发明中，我们构建了新型的非复制型pK18mobsacB_ AA::B,该质粒含有两端基因组中DNA片段，电转到谷氨酸棒杆菌细胞中通过双交换同源重组获得目的菌种，从而大大提闻目的菌种得率。另一方面，利用该质粒获得的目的菌种不带有如何抗生素标记基因。作为应用实例，我们在谷氨酸棒杆菌中成功实现了 Pck基因的敲除和IysC基因的过表达。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是构建一种新型非复制型质粒，该质粒电转到谷氨酸棒杆菌中能同时实现基因敲除及基因过表达而不带有任何抗性标记。
[0007]本发明的技术方案:一种新型非复制型质粒pK18mobsacB-AA::B (以非复制型质粒 pK18mobsacB_ A pck::1ysC 为例)。
[0008]含有卡那霉素抗性基因kan ；
[0009]含有鹿糖致死基因sacB ；
[0010]含有谷氨酸棒杆菌基因组中pck基因的上游一段序列(1212bp)和下游一段序列(1220bp)；
[0011 ] 含有Ptac-lysC-rrnBTlT2表达框，该表达框由一个在大肠杆菌和棒杆菌中具有转录启动功能的tac启动子，来自谷氨酸棒杆菌中IysC基因的SD序列，来自谷氨酸棒杆菌基因组中IysC操纵子，在大肠杆菌和棒杆菌中具有转录终止功能的rrnBTlT2组成。
[0012]新型非复制型质粒pK18mobsacB_ AA::B (以非复制型质粒pK18mobsacB- A pck::1ysC 为例)构建方法:
[0013]第一步，以Corynebacterium glutamicum ATCC13032 基因组为模板，pck-L-F 和pck-L-R为模板，通过PCR反应扩增1212bp的pck-L左臂片段，在PCR产物的5’和3’端分别引入HindIII和SalI限制性酶切位点。用限制性内切酶HindIII和SalI分别酶切pck-L片段和非复制型质粒pK18mobsacB,纯化后将两者酶连，由此得到质粒大小为6931bp的另一非复制型质粒，命名为pK18mobsacB-pck_L ；
[0014]第二步，以Corynebacterium glutamicumATCC13032 基因组为模板，pck-R-F 和pck-R-R为模板，通过PCR反应扩增1220bp的pck-R右臂片段，在PCR产物的5’和3’端分别引入SalI和XbaI限制性酶切位点。用限制性内切酶SalI和XbaI分别酶切pck_R片段和非复制型质粒pK18mobsacB-pck-L,纯化后将两者酶连，由此得到质粒大小为8151bp的另一非复制型质粒，命名为pK18mobsacB_ Apck ；
[0015]第三步，以Corynebacterium glutamicum ATCC13032 基因组为模板，IysC-F 和IysC-R为模板(注=IysC-F序列中含有谷氨酸棒杆菌SD序列)，通过PCR反应扩增1226bp的IysC操纵子，在PCR产物的5’和3’端分别引入EcoRI和NheI限制性酶切位点。用限制性内切酶EcoRI和NheI分别酶切IysC操纵子和表达型质粒pDXW_8，纯化后将两者酶连，由此得到质粒大小为10774bp的另一表达型质粒，命名为pDXW-8-lysC ；
[0016]最后，以表达型质粒pDXW-8-lysC为模板，Ptac-F和Ptac-R为模板，通过PCR反应扩增1226bp的Ptac-lysC-rrnBTlT2表达框，在PCR产物的5，和3，端引入SalI限制性酶切位点。用限制性内切酶SalI分别酶切Ptac-lysC-rrnBTlT2表达框和非复制型质粒pK18mobsacB_ Apck,用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化,纯化后将两者酶连，由此得到质粒大小为10098bp的另一非复制型质粒，命名为pK18mobsacB_ Δ pck::1ysC0
[0017]获得目的菌株的方法(以获得pck基因敲除和IysC基因过表达的菌株为例):
[0018]第一步,非复制型质粒pK18mobsacB_ Δ pck::1ysC转化进入细胞内；
[0019]第二步，通过一次同源重组(B卩非复制型质粒上的pck-L与谷氨酸棒杆菌基因组中pck-L同源重组)使非复制型质粒结合到谷氨酸棒杆菌基因组中，筛选在卡那霉素抗性平板能正常生长的菌株；
[0020]第三步，挑选一株在卡那霉素抗性平板上的菌株在不含有抗生素的LBG液体培养基中培养24h,使该非复制型质粒pK18mobsacB_Apck::1ysC与谷氨酸棒杆菌基因组发生第二次同源重组(即非复制型质粒上的pck-R与基因组中pck-R同源重组)，去除基因组中的卡那霉素抗性基因，筛选在含有10%蔗糖浓度的LB平板上生长的菌株。
[0021]第四步，利用引物Ptac-F和Ptac-R对10%蔗糖浓度的LB平板上的菌落进行菌落PCR,以确定非复制型质粒pK18mobsacB_ Δ pck::1ysC与谷氨酸棒杆菌基因组在pck基因位点成功的发生双交换同源重组。
[0022]最后，挑选目的重组菌株，在不含有任何筛选标记(如卡那霉素或10%的蔗糖标记)的LBG培养基中连续培养30代，测定相应基因编码的酶活。酶活变化不大的重组菌株即为遗传性能稳定的目的重组菌株。
[0023]所述新型质粒同样适用于在对蔗糖和卡那霉素抗性敏感的革兰氏阴性或阳性菌株中的应用。
[0024]本发明所公开的方法，能在谷氨酸棒杆菌基因组中同一时间内实现基因敲除和另一基因的过表达而不带有任何抗性标记，插入在谷氨酸棒杆菌基因组中的过表达的基因在宿主中能够稳定的遗传并表达。该方法运用双交换同源重组原理获得目的重组菌株，这克服了单交换同源重组过程中低重组效率的缺点，从而大大提高获得目的重组菌株的机率。该方法所获得的目的菌株不含有任何抗性标记，可以同时实现一个基因敲除和另一个基因的过表达。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1非复制型质粒pK18mobsacB-AA::B的构建过程图(图中El，E2和E3分别表示不同的限制性内切酶)。
[0026]图2对谷氨酸棒杆菌基因组进行基因操作过程图。
【具体实施方式】
[0027]实施例1非复制型质粒pK18mobsacB_AA::B的构建(以非复制型质粒pK18mobsacB- Δ pck::1ysC 为例)[0028]非复制型质粒pK18mobsacB_ AA::B的构建如图1所不。以Corynebacteriumglutamicum ATCC13032基因组为模板，pck-L-F和pck-L-R为模板，通过PCR反应扩增1212bp的pck-L片段，在PCR产物的5’和3’端分别引入HindIII和SalI限制性酶切位点。用限制性内切酶HindIII和SalI分别酶切pck-L片段和非复制型质粒pK18mobsacB，纯化后将两者酶连，由此得到质粒大小为6931bp的另一非复制型质粒，命名为 pK18mobsacB-pck_L ；
[0029]以 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 基因组为模板，pck-R-F 和 pck-R-R为模板，通过PCR反应扩增1220bp的pck-R片段，在PCR产物的5’和3’端分别引入SalI和XbaI限制性酶切位点。用限制性内切酶SalI和XbaI分别酶切pck_R片段和非复制型质粒pK18mobsacB-pck-L,纯化后将两者酶连，由此得到质粒大小为8151bp的另一非复制型质粒，命名为pK18mobsacB_ A pck ；
[0030]以Corynebacterium glutamicum ATCC13032 基因组为模板，IysC-F 和 IysC-R 为模板(注=IysC-F序列中含有SD序列)，通过PCR反应扩增1226bp的IysC操纵子，在PCR产物的5’和3’端分别引入EcoRI和NheI限制性酶切位点。用限制性内切酶EcoRI和NheI分别酶切IysC操纵子和表达型质粒pDXW-8，纯化后将两者酶连，由此得到质粒大小为10774bp的另一表达型质粒，命名为pDXW-8-lysC ；
[0031]以表达型质粒pDXW-8-lysC为模板，Ptac-F和Ptac-R为模板，通过PCR反应扩增1226bp的Ptac-lysC-rrnBTlT2表达框，在PCR产物的5’和3’端引入SalI限制性酶切位点。用限制性内切酶Sal I分别酶切Ptac-1ysC-rrnBTIT2表达框和非复制型质粒卩1(18111(^83013-八卩01^用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化,纯化后将两者酶连，由此得到质粒大小为10098bp的另一非复制型质粒，命名为pK18mobsacB_ A pck::1ysC0
[0032]构建过程中使用的引物序列如表1，PCR反应条件如表2。
[0033]表1.PCR扩增所需引物序列(下划线为酶切位点；粗斜体为SD序列)
[0034]
【权利要求】
1.一种用于谷氨酸棒杆菌基因改造的新型质粒，该非复制型质粒为pK18mobsacB- Δ pck::lysC,包括如下特征: O含有卡那霉素抗性基因kan及鹿糖致死基因sacB ； 2)含有一段由pck基因一段上游序列和一段下游序列组成的缺失Apck基因片段； 3)含有一个Ptac-lysC-rrnBTlT2 表达框。
2.根据权利要求1所述的新型质粒，其特征在于所述非复制型质粒的出发质粒为pK18mobsacB。
3.根据权利要求1所述的新型质粒，其特征在于所述Ptac-lysC-rrnBTlT2表达框由一个在大肠杆菌和棒杆菌中具有转录启动功能的tac启动子，来自谷氨酸棒杆菌基因的SD序列，来自谷氨酸棒杆菌基因组中IysC操纵子，在大肠杆菌和棒杆菌中具有转录终止功能的rrnBTlT2组成。
4.根据权利要求1所述的新型质粒在谷氨酸棒杆菌中的应用方法，其特征在于包括如下步骤: 1)质粒构建a).以谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032基因组为模板，pck-L-F和pck-L-R为引物，通过PCR反应扩增pck_L左臂片段，在PCR产物的5’和3 ’端分别引入限制性酶切位点,用限制性内切酶构建非复制型质粒pK 18mob sacB-p ck-L ；b).以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，pck-R-F和pck-R-R为引物，通过PCR反应扩增pck-R右臂片段，在PCR产物的5’和3’端分别引入限制性酶切位点。用限制性内切酶S分别酶切pck-R片段和非复制型质粒pK18mobSaCB-pCk-L，纯化后将两者酶连构建非复制型质粒pK18mobsacB-Apck ;c).以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板，IysC-F和IysC-R为引物，构建表达型质粒pDXW-8-lysC ；d).以表达型质粒pDXW-8-lysC为模板，Ptac-F和Ptac-R为模板，PCR反应扩增Ptac-lysC_rrnBTlT2表达框，将其插入非复制型质粒 pK18mobsacB_ Δ pck 中，构`建非复制型质粒 pK18mobsacB_ Δ pck::1ysC ； 2)第一次同源重组将非复制型质粒pK18mobsacB-Apck::1ysC电转到谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，然后卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆菌株； 3)第二次同源重组在不含抗生素的LBG液体培养基中培养24h，使整合到谷氨酸棒杆菌中的pK18mobsacB-Apck::1ysC质粒序列自身发生第二次同源重组,敲除卡那霉素抗性基因，然后在含有10%蔗糖浓度的LB平板上筛选阳性克隆菌株。
5.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于所述步骤I)中IysC-F序列中含有谷氨酸棒杆菌基因的SD序列。
6.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于所述步骤I)中非复制型质粒中Apck基因片段是含有谷氨酸棒杆菌中pck基因左右两臂的序列而中间序列缺失的基因片段。
7.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于所述步骤2)中非复制型质粒是通过Apck基因片段基因上一个左臂或右臂与谷氨酸棒杆菌基因组中pck基因的同源序列发生同源重组，使非复制型质粒整合到到谷氨酸棒杆菌基因组中。
8.根据权利要求4所述的应用方法，其特征在于所述步骤3)中第二次同源重组是通过整合到谷氨酸棒杆菌中的Apck基因片段上一个左臂或右臂与基因组中的同源序列发生重组。
9.根据权利要求1所述的新型质粒在对蔗糖和卡那霉素抗性敏感的革兰氏阴性或阳性菌株中的应用。·
【文档编号】C12N15/77GK103710375SQ201310742881
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】张伟国, 钱和, 徐建中 申请人:江南大学