专利名称：定量pcr的多波长荧光检测方法及其装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于定量PCR的多波长荧光检测方法及其装置。
背景技术：
定量PCR检测系统工作原理是使反应物在指定的变性温度、退火温度和延伸温 度之间自动循环的仪器，通过变性、退火和延伸的温度循环可在短时间内将靶DNA扩增数 百万倍。 定量PCR检测系统通过使用不同波长的激发光照射试管，当试管中的试剂被激发 出特定波长荧光时，用光学传感器，如PMT (光电倍增管)、PD (光敏二极管)、APD (雪崩光电 二极管)等采集到荧光强度信号并及时传送到计算机进行实时数据显示和分析。
随着现代PCR技术发展，有时需要在同一管或同次实验内实现多种染料荧光的检 测，以适应试剂添加物(参照物、试剂集成度增加)不断增多的需要。 目前主流定量PCR检测系统(Real time PCR，实时荧光定量PCR)的多波长扫描工 作模式是采用激发光滤光片轮和荧光滤光片轮。其特征是使用步进电机，以机械传动方 式逐一选择需要的激发光滤光片和荧光滤光片。此模式下，滤光片轮的重复定位精度受运 动机构限制，其可靠性由于运动而降低。要实现多波长检测，必须依次切换滤光片组，依次 控制激发光，每次只有一种波长的发光光工作，其总检测时间相当长。以4通道为例，标准
96孔板扫描一般都需要20s以上。由于试剂酶活性受到时间和温度的显著影响，因此时间 的延长将不可避免地引起试剂荧光衰减和降解，并影响定量PCR的检测结果。
针对单个PCR试管和96孔全裙板的研究表明，间隔1个标准模块孔位(96x0. 2ml 试管用，即激发光束间距18mm)时，激发光之间的串扰基本在O. 1X以下，在PCR检测应用上 基本可以忽略。如果激发光是相邻孔，激发光会通过透明材质的试管传导到相邻孔上，形成 背景和引起误激发，其影响在典型荧光信号强度的10%以上，就不能满足要求。
发明内容
针对现有多波长检测技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种能实现实时同步 检测的定量PCR的多波长荧光检测方法及其装置。 本发明的定量PCR的多波长荧光检测方法，其特征是设置n个相互间隔为一个模 块标准孔位的荧光波长检测通道，n = 2 96，每个荧光波长检测通道具有一条光源激发光 纤路径和一条荧光接收光纤路径，n条光源激发光纤路径的光源各自经过透镜准直和激发 光滤光片获得所需波长的激发光，再经聚焦分别沿光纤照射到n个试管底部或顶部激发试 剂样本；n个试管中试剂样本荧光分别进入荧光接收光纤路径，经透镜准直和荧光滤光片 获得所需波长的荧光照到平面反光镜，n条荧光接收光纤路径的平面反光镜将样本荧光分 别折射到同一个多面体反光镜的n个工作面，由多面体反光镜将n个荧光波长检测通道的 荧光会聚到同一个光学传感器的光电面上，实现多波长荧光实时同步检测。
上述的激发光和荧光滤光片的参数根据所需检测试剂的染料光谱特性选定，以准确区分背景和信号，可以是200-900nm范围内的任意波长。 实施本发明定量PCR的多波长荧光检测方法的装置，包括n个相互间隔为一个模 块标准孔位的荧光波长检测通道，多面体反光镜和光学传感器，多面体反光镜具有n个工 作面，n = 2 96，每个荧光波长检测通道具有一条光源激发光纤路径和一条荧光接收光纤 路径，在光源激发光纤路径沿光源激发方向依次设有光源，第一透镜、第一滤光片和第一聚 焦镜，在荧光接收光纤路径沿荧光传递方向依次设有第二透镜、第二滤光片、第二聚焦镜和 平面反光镜，将n个荧光检测通道的荧光会聚到光学传感器的多面体反光镜位于平面反光 镜的反射光路上。 本发明中，所说的光源可以是发光二极管、激光二极管或卤素灯。光电传感器可以 是光电倍增管、光敏二极管、雪崩光电管或电荷耦合器件。第一聚焦镜和第二聚焦镜均可采 用棱镜。 本发明中的光源激发光纤和荧光接收光纤可以是两根独立的光纤，也可以是Y状 分叉光纤。 本发明的有益效果在于 D可实现多波长荧光实时同步检测，检测效率大大提高。 2)荧光波长检测通道相互间隔一个模块标准孔位，检测时不产生激发光串扰。
3)最大限度縮短了检测总时间，有利于克服试剂样本中物质(酶，引物，内参品 等)衰变降解的影响，获得准确的定量PCR分析结果。 4)采用的光纤没有相对运动，不存在光纤疲劳寿命问题，便于系统集成和检测装 置小型化。 5)通过检测装置整体移动方式，可以实现对任意孔的多波长荧光检测。
图1是本发明装置示意图。
具体实施例方式
以下结合附图进一步说明本发明。 参照图l，本发明的定量PCR的多波长荧光检测装置，包括n个相互间隔为一个模 块标准孔位的荧光波长检测通道，多面体反光镜11和光学传感器12，图示实例中，n = 2， 多面体反光镜11具有2个工作面，每个荧光波长检测通道具有一条光源激发光纤路径1和 一条荧光接收光纤路径2，此例，光源激发光纤和荧光接收光纤采用Y状分叉光纤。在光源 激发光纤路径沿光源激发方向依次设有光源3，第一透镜4、第一滤光片5和第一聚焦镜6， 在荧光接收光纤路径沿荧光传递方向依次设有第二透镜7、第二滤光片8、第二聚焦镜9和 平面反光镜IO，多面体反光镜11位于平面反光镜10的反射光路上，将2个荧光检测通道的 荧光会聚到光学传感器12的光电面上。 图示实例工作时，2个光源同时点亮，光源各自经过第一透镜准直和激发光滤光片 获得所需波长的激发光，再经第一聚焦镜聚焦后沿光纤照射到试管1和试管3底部或顶部 激发试剂样本。2个试管中试剂样本荧光分别进入荧光接收光纤路径，经第二透镜准直和第 二荧光滤光片获得所需波长的荧光照到平面反光镜的2个工作面，由平面反光镜将2个荧光检测通道的荧光会聚到光学传感器12的光电面上，实现对2个荧光波长检测通道实时同 步检测。图中时刻，试管2未被检测，但通过检测装置整体移动方式，可以实现对对标准模 块(96x0. 2ml孔试管板)任意孔的多波长荧光同步检测，无需机械切换，并且所用光纤并不 活动，也消除了光线纤运动疲劳造成的可靠性问题。 激发光和荧光滤光片的参数根据所需检测试剂的染料光谱特性选定，以准确区分 背景和信号，可以是200-900nm范围内的任意波长。
权利要求
定量PCR的多波长荧光检测方法，其特征是设置n个相互间隔为一个模块标准孔位的荧光波长检测通道，n＝2～96，每个荧光波长检测通道具有一条光源激发光纤路径和一条荧光接收光纤路径，n条光源激发光纤路径的光源各自经过透镜准直和激发光滤光片获得所需波长的激发光，再经聚焦分别沿光纤照射到n个试管底部或顶部激发试剂样本；n个试管中试剂样本荧光分别进入荧光接收光纤路径，经透镜准直和荧光滤光片获得所需波长的荧光照到平面反光镜，n条荧光接收光纤路径的平面反光镜将样本荧光分别折射到同一个多面体反光镜的n个工作面，由多面体反光镜将n个荧光波长检测通道的荧光会聚到同一个光学传感器的光电面上，实现多波长荧光实时同步检测。
2. 根据权利要求1所述的定量PCR的多波长荧光检测方法，其特征是所说的波长为 200-900nm范围内的任意波长。
3. —种实施权利要求1所述定量PCR的多波长荧光检测方法的装置，其特征是包括n 个相互间隔为一个模块标准孔位的荧光波长检测通道，多面体反光镜(11)和光学传感器 (12)，多面体反光镜(11)具有n个工作面，n = 2 96，每个荧光波长检测通道具有一条 光源激发光纤路径(1)和一条荧光接收光纤路径(2)，在光源激发光纤路径沿光源激发方 向依次设有光源(3)，第一透镜(4)、第一滤光片(5)和第一聚焦镜(6)，在荧光接收光纤路 径沿荧光传递方向依次设有第二透镜(7)、第二滤光片(8)、第二聚焦镜(9)和平面反光镜 (10)，将n个荧光检测通道的荧光会聚到光学传感器(12)的多面体反光镜(11)位于平面 反光镜(10)的反射光路上。
4. 根据权利要求3所述的定量PCR的多波长荧光检测装置，其特征是光源(3)为发光 二极管、激光二极管或卤素灯。
5. 根据权利要求3所述的定量PCR的多波长荧光检测装置，其特征是光源激发光纤和 荧光接收光纤是两根独立的光纤，或是Y状分叉光纤。
6. 根据权利要求3所述的定量PCR的多波长荧光检测装置，其特征是光电传感器(12) 是光电倍增管、光敏二极管、雪崩光电管或电荷耦合器件。
7. 根据权利要求3所述的定量PCR的多波长荧光检测装置，其特征是第一聚焦镜和第 二聚焦镜均为棱镜。
全文摘要
本发明公开了定量PCR的多波长荧光检测方法和装置，设置n个相互间隔为一个模块标准孔位的荧光波长检测通道，每个荧光波长检测通道具有一条光源激发光纤路径和一条荧光接收光纤路径，n条光源激发光纤路径的光源各自经过透镜准直和激发光滤光片获得所需波长的激发光，再经聚焦照射到n个试管激发试剂样本；n个试管试剂样本荧光分别进入荧光接收光纤路径，经透镜准直和荧光滤光片获得所需波长的荧光照到平面反光镜，经平面反光镜折射到同一个多面体反光镜的n个工作面，由多面体反光镜将n个荧光波长检测通道的荧光会聚到光学传感器的光电面上，实现多波长荧光实时同步检测。采用本发明可大大提高检测效率，且检测时不产生激发光串扰，定量PCR分析结果准确。
文档编号G01N21/64GK101705280SQ20091015387
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月16日 优先权日2009年11月16日
发明者刘志华, 吕才树, 李社刚, 王勇, 项伟平 申请人:杭州博日科技有限公司