专利名称：同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
技术领域：
本发明涉及农副产品安全检测技术，具体涉及同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针及检测方法。
背景技术：
食品安全是公共卫生问题中最应重视的环节，目前我国食品安全领域存在微生物污染；农产品生产、加工以及销售等环节仍然存在安全隐患；食品安全科技成果和技术储备不足；食品安全标准体系、检验检测体系、认证认可体系等方面还存在明显的不适应性，食品安全管理体制和法律法规体系有待完善；食物中毒和食源性疾病等一系列食品安全问题。因此只有尽快加强食品安全监控，提高检测技木，建立、健全食品安全法規，使我 国相应的法规、标准与国际接轨，特别是食品快速检测技术达到国际先进水平，大力加强食品检验的力度，才能为我国食品安全与食品贸易保驾护航。食源性疾病定义为，通过摄食进入人体的，使人体患感染性或中毒性的疾病。常见的食源性致病菌包括沙门氏菌属、致病性大肠杆菌、葡萄球菌及毒素、变形杆菌属、副溶血性弧菌、李斯特菌、肉毒梭菌毒素、蜡样芽抱杆菌、韦氏梭菌、弯曲杆菌、酵米面椰毒假单胞杆菌、结肠炎耶尔森氏菌、链球菌及志贺氏菌属等。研究发现，人类有60%的疾病都与动物疾病有关，近些年出现的新型疾病中，这ー比例更是高达75%，在养殖业高度发达、人与动物多层面接触的今后，这ー比例恐怕还会升高。实时荧光定量PCR定义为，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种荧光探针和荧光染料。荧光定量PCR方法已被广泛应用于各方面(I)各型肝炎、艾滋病、胎儿畸形、肿瘤标志物及瘤基因等临床疾病诊断；(2)禽流感、新城疫等动物疾病检测；(3)医学、农牧、生物相关分子生物学定量等科学研究；(4)食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等食品安全的检测。以上所述的致病菌目前还没有ー套可以用荧光定量PCR技术同时检测其是否存在的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一套可同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针。本发明的另ー目的是提供根据上述检测引物和探针设计的ー种荧光定量PCR检测方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的本发明针对在我国食物中毒中最常见的致病菌，研究出ー种食物中毒诊断及食品检测的有效方法。根据GB 4789.1食品卫生微生物学检验总则和GB4789. 17肉与肉制品检验中的相关要求以及结合我国目前食源性致病菌的发生发展情况，选取以下五种细菌作为检测对象沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非Ol群霍乱弧菌，筛选出检测上述各致病菌的荧光定量PCR引物和探针。同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针，核苷酸序列如下
组引物对 SEQ ID N0:1 2，探针 SEQ ID NO:3 ；
力か组引物对SEQ ID N0:4 5，探针SEQ ID NO:6 ；οχ/Ρ 组引物对 SEQ ID N0:7 8，探针SEQ ID NO:9 ；
组引物对 SEQ ID NO: 10 11，探针SEQ ID NO: 12 ； we 组引物对 SEQ ID NO: 13 14，探针SEQ ID NO: 15 ；
以上除Aか组与 οζ组不能同时存在外，其他任何两组以上引物及相应探针组合，可以检测该组引物对和探针所对应的致病菌；
其中invA组引物对和探针用于检测沙门氏菌{Salmonella spp. ), hly组引物对和探针用于检测单核细胞增生李斯特氏菌(listeria monocytogenes), toxR组引物对和探针用于检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus), ipaH组引物对和探针用于检测福氏志贺氏菌iShigella flexneri ), vcc组引物对和探针用于检测非01群霍乱弧菌(VibrioCnolerae non- 01、。以上引物和探针是通过Blast、MegAlign和DNAStar程序筛选出的沙门氏菌inv基因簇保守序列(GenBank: FR775234. 2)，单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因Aか保守序列(GenBank: NC_012488. I),副溶血性弧菌ioi基因保守序列(GenBank: LI1929. 2),福氏志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因ipaH7保守序列(GenBank:NC—004337. 2 )，非07群霍乱弧菌基因保守序列(GenBank: NC—012578. I)作为模板，用Primer Explorer V5软件设计所得。本发明选择靶基因遵循两个原则1、毒力基因选择位于细菌基因组的基因。由于各种致病菌属间基因组的同源性很高，且与其同属的非致病型在生化反应上无任何区別，但与致病性相关的毒力基因特异性高。而通常在食品检测中只有检测出其毒力才能认定为致病菌，所以选择毒力基因为靶基因。2、细菌为原核生物，其遗传物质有基因组和质粒两类，很多毒力基因位于质粒上。但质粒不稳定，可能在细菌间转移，也容易在传代培养中丢失。由于基因组DNA和质粒DNA的大小相差很大，所以不能用同样方法提取。因此选择位于细菌基因组上的毒力基因为靶基因。由于要在同一个PCR管体系中同时进行至少两个目的基因的扩增，引物和探针设计比较复杂，且对引物和探针扩增区的特异性要求较高。所以引物和探针设计没有普通引物很探针设计简单，要设计出优良的引物和探针，需要在各种生物信息软件评估的基础上进行费时的筛选。由于所设计的引物和探针具有高度的选择特异性，在进行病原细菌检测时，要求引物和探针所针对的靶序列位点应该相当保守，这样所建立的方法才具有更广泛适用性。由于所设计的引物和探针要在下一步进行多重荧光定量PCR反应，因此在设计引物和探针时要将各目的基因对应的序列共同进行分析比对。不仅要遵循引物和探针设计的一般原则，探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段10(T200bp相对要保守的片段来设计引物与探针，即Real-time PCR的扩增片段是50bp 150bp。Real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。要避免多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰，引物对内部和引物对之间也要尽量使Tm值相近，确保能在同一条件下均获得较好的扩增曲线；各对引物内部和引物对之间不能互补，尤其避免3’端的互补，以減少引物ニ聚体的形成。设计好的引物和探针序列用DNAstar软件中的Primerselect软件分析并提交到NCBI网站进行BLAST分析,用以验证引物和探针的理论特异性。一种同时检测多种水产品致病菌的检测方法，是使用上述除Aか组与 Μ组不能同时存在外的5组引物和探针中任何两组以上的组合，以待检样品中提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，所选组对应能检测的致病菌荧光定量PCR扩增结果作为阳性对照，待检样品检测结果中的特异性对数扩增曲线与阳性样品结果一致，表明存在该相应致病菌。本发明还保护ー种同时检测多种致病菌的多重荧光定量PCR反应体系，该反应体 系为25μ ，其中Real-timePCRmix 12. 5 μ L，上、下游引物各O. 4μ ，探针O. 8μ ，待检测样品DNA模板I. O μ L，超纯水补足25μ ；
所述上、下游引物和探针为上述5组中的任意两组以上的组合，但是Aか组和组不能同时存在；
上、下游引物和探针的浓度分别为 invA 组引物对 ΙΟμΜ/L，探针-J. δμΜ/L ； hly组引物对δμΜ/L，探针δμΜ/L ； οχ/Ρ 组引物对 7. δμΜ/L，探针δμΜ/L ； ipaH览:引物对δμΜ/L，探针5μΜ/1 ； vcc 组引物对 ΙΟμΜ/L，探针-J. δμΜ/L ；
所述致病菌为选择的所述引物对和探针所对应能检测的致病菌。上述同时检测多种致病菌的多重荧光定量PCR反应体系的扩增方法，扩增条件为95°C反应30s，PCR反应进行40个循环，每个循环的条件为95°C 5s, 60°C 34s。多重荧光定量PCR体系中増加了引物、探针和模板，影响反应的因素增多，互相之间增加了干扰。因此增加了设计引物和探针的难度。除此之外体系中各成分的量和浓度也需在实验中做适当调整，以减少非特异性扩增的影响。在实际检测中模板的量是不能确定的，因此引物和探针的浓度及其他成分要保证充分供给，但也不能过量，这会对检测结果产生直接影响。因此在体系中重点调整的是引物的浓度。本发明的荧光定量PCR技术同时检测多种致病菌的检测用引物和探针特异性強， 可用于制备农副产品尤其是水产品致病菌的检测试剂盒。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
(I)本发明筛选出了多种特异性强的致病菌荧光定量PCR扩增引物和探针，建立了一种同时检测多种致病菌的多重荧光定量PCR方法，为快速、高效检测农副产品中多种致病菌提供了一种简便快速的方法。(2)本发明的 5 组引物和探针 invA-Foiword，Reverse, IN，hly~Forword,Reverse，IN，toxR—Forword，Reverse，IN，ipaH—Forword，Reverse，IN，vcc—Forword，Reverse, 只引起相应靶基因的特异性对数扩增曲线，无任何非特异性对数扩增曲线，显示了良好的特异性。(注'Fonvord为上游引物，为下游引物，为探针)
(3)本发明的多重荧光定量检测方法扩增反应快速、高效、简便，整个扩增在不到I小时即可完成。(4)本发明的5组引物和探针在五种细菌单重荧光定量PCR检测中灵敏度都是IO1CfuZmL,显示了高灵敏度。(5)能够用荧光定量PCR技术同时检测多种致病性细菌通过对5组引物和探针浓度的优化组合，通过ー个多重荧光定量PCR体系的建立和调试，成功建立只引起相应五种菌靶基因的多重特异性对数扩增曲线，未出现相互间强抑制现象。
图I.引物和探针Reverse, /Ar对表I中细菌的对数扩增曲线结 果图，注对数曲线表示沙门氏菌的特异性扩增曲线。图2.引物和探针Reverse, /Ar对表I中细菌的对数扩增曲线结果图，注对数曲线表示单核细胞增生李斯特氏菌的特异性扩增曲线。图3.引物和探针ioHormrt/, Reverse, 对表I中细菌的对数扩增曲线结果图，注对数曲线表示副溶血性弧菌的特异性扩增曲线。图4.引物和探针Reverse, 7 对表I中细菌的对数扩增曲线结果图，注对数曲线表示福氏志贺氏菌的特异性扩增曲线。图5.弓丨物和探针rcdormrt/, Reverse, 7 对表I中细菌的对数扩增曲线结果图，注对数曲线表示非Ol群霍乱弧菌的特异性扩增曲线。图6.沙门氏菌灵敏度检测结果，对数曲线广7分别为107、106、105、104、103、102、IO1CfiVmL0图7.单核细胞增生李斯特氏菌灵敏度检测结果，对数曲线广7分别为107、106、lO'lO'KfUO^lOkfu/mL。图8.副溶血性弧菌灵敏度检测结果，对数曲线f 7分别为107、106、105、104、103、IO2UO1CfuZmLo图9.福氏志贺氏菌灵敏度检测结果，对数曲线广7分别为107、106、105、104、103、IO2UO1CfuZmLo图10.非Ol群霍乱弧菌灵敏度检测结果，对数曲线f 7分别为107、106、105、104、Io3UO2UO1CfuZmLo图11. 二重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为Aか基因对数扩增曲线。图12. 二重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为かa//基因对数扩增曲线。图13. 二重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为基因对数扩增曲线。图14. 二重荧光定量PCR对数扩增曲线結果，曲线I为Aか基因对数扩增曲线，曲线2为かa//基因对数扩增曲线。
图15. 二重荧光定量PCR对数扩增曲线結果，曲线I为Aか基因对数扩增曲线，曲线2为基因对数扩增曲线。图16. 二重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为ioi基因对数扩增曲线。图17. 二重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为ioi基因对数扩增曲线，曲线2为かa//基因对数扩增曲线。图18. 二重荧光定量PCR对数扩增 曲线結果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为ioi基因对数扩增曲线。图19.三重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为かa//基因对数扩增曲线，曲线3 %hly基因对数扩增曲线。图20.三重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为基因对数扩增曲线，曲线3为Aか基因对数扩增曲线。图21.三重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为基因对数扩增曲线，曲线3为かa//基因对数扩增曲线。图22.三重荧光定量PCR对数扩增曲线結果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为かa//基因对数扩增曲线，曲线3 %hly基因对数扩增曲线。图23.三重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为ioi基因对数扩增曲线，曲线3为かa//基因对数扩增曲线。图24.三重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为基因对数扩增曲线，曲线3为ioi基因对数扩增曲线。图25.三重荧光定量PCR对数扩增曲线結果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为ioi基因对数扩增曲线，曲线3为かa//基因对数扩增曲线。图26.四重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为基因对数扩增曲线，曲线3为かa//基因对数扩增曲线，曲线4为Aか基因对数扩增曲线。图27.四重荧光定量PCR对数扩增曲线结果，曲线I为基因对数扩增曲线，曲线2为基因对数扩增曲线，曲线3为ioi基因对数扩增曲线，曲线4为かa//基因对数扩增曲线。
具体实施例方式以下实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验试剂和常规操作步骤。实施例I五种致病菌检测引物的设计与筛选 I. I实验材料
本实验中使用ABI7500荧光定量PCR仪。主要工具酶类、生化试剂及试剂盒
LB肉汤、各种生化管、李氏增菌液等试剂购自广州环凯生物试剂有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)，DNA回收试剂盒(天根)，pGM_T19连接含试剂盒(含载体，连接酶)购自广州市瑞真生物科技有限公司，质粒DNA小量提取试剂盒(天根)，离心管、玻璃试管、平皿、三角瓶等耗材购自广州市芸荟试验仪器公司；其他试剂均为分析纯常规试剂。
LB固体培养基在LB肉汤基础上加入比例为15g/L的琼脂粉，混匀煮沸熔化灭菌。营养肉汤NB培养基(IL):牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH7. 4。实验菌株来源及编号见表I
权利要求
1.同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针，其特征在于核苷酸序列如下组引物对 SEQ ID N0:1 2，探针 SEQ ID NO:3 ； 力か组引物对SEQ ID N0:4 5，探针SEQ ID NO:6 ；οχ/Ρ 组引物对 SEQ ID N0:7 8，探针SEQ ID NO:9 ；组引物对 SEQ ID NO: 10 11，探针SEQ ID NO: 12 ；we 组引物对 SEQ ID NO: 13 14，探针SEQ ID NO: 15 ； 以上除Aか组与 οζ组不能同时存在外，其他任何两组以上引物及相应探针组合，可以检测该组引物对和探针所对应的致病菌； 其中invA组引物对和探针用于检测沙门氏菌，Aか组引物对和探针用于检测单核细胞增生李斯特氏菌，toxR组弓I物对和探针用于检测副溶血性弧菌，ipaH组弓I物对和探针用于检测福氏志贺氏菌，KCC组引物对和探针用于检测非见群霍乱弧菌。
2.一种同时检测多种水产品致病菌的检测方法，其特征在于使用权利要求I所述的除hly组与tox组不能同时存在外的任何两组以上检测用引物对和探针，以待检样品中提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，所选组对应能检测的致病菌荧光定量PCR扩增结果作为阳性对照，待检样品检测结果中的特异性对数扩增曲线与阳性样品结果一致，表明存在该相应致病菌。
3.ー种同时检测多种致病菌的多重荧光定量PCR反应体系，其特征在于反应体系为25μ ，其中Real-timePCRmix 12. 5 μ L，上、下游引物各O. 4μ ，探针O. 8μ ，待检测样品DNA模板l.OyL,超纯水补足25μ ； 所述上、下游引物和探针为权利要求I所述5组中的任意两组以上的组合，但是Aか组和 οパ 组不能同时存在； 上、下游引物和探针的浓度分别为 invA 组引物对 ΙΟμΜ/L，探针-J. δμΜ/L ； hly组引物对δμΜ/L，探针5μΜ/1 ； οχ/Ρ 组引物对 7. δμΜ/L，探针5μΜ/1 ； ipaH览:引物对δμΜ/L，探针5μΜ/1 ； vcc 组引物对 ΙΟμΜ/L，探针-J. δμΜ/L ； 所述致病菌为选择的权利要求I所述引物对和探针所对应能检测的致病菌。
4.权利要求3所述同时检测两种致病菌的多重荧光定量PCR反应体系的扩增方法，其特征在于扩增条件为95°C反应30s，PCR反应进行40个循环，每个循环的条件为95°C 5s,60 °C 34s。
5.权利要求I所述同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针在制备农副产品致病菌检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了同时检测多种水产品致病菌的荧光定量PCR引物和探针及检测方法，属于分子检测技术领域。所述的荧光定量PCR引物和探针共有5组，可以分别检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、福氏志贺氏菌和非O1群霍乱弧菌，除单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌基因两组的引物和探针不能同时使用外，其他任意两组或两组以上组合，均可以同时检测相应引物和探针对应能检测出的致病菌。本发明同时公开了一种利用上述各引物对和探针建立的多重荧光定量PCR扩增体系，可快速准确地检测出待检样品中是否有相应致病菌，操作方便快捷，且特异性高，不会出现假阳性结果，可以做成试剂盒等，在农副产品致病菌检测中非常适用。
文档编号C12R1/01GK102676664SQ201210130290
公开日2012年9月19日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者吕英姿, 孙宝丽, 张凌俊, 毕英佐, 谢青梅 申请人:华南农业大学