专利名称：绿色木霉几丁质酶基因Tvchi及其表达产物与应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及一种绿色木霉几丁质酶基因Tvchi及其表达产物与应用。
背景技术：
几丁质酶(chitinase)是以几丁质(chitin)为作用底物的水解酶。几丁质又称甲壳素或甲壳质，存在于节肢动物、线虫和软体动物的体壁、真菌细胞壁(除卵菌)和一些藻类等生物的细胞壁中。自1921年发现真细菌和放线菌在含有几丁质的琼脂上可形成透明圈，从而证明这些培养物内有水溶性的几丁质酶存在以来，人们从未间断对几丁质酶的研究，多种微生物(细菌、放线菌、真菌)中分离和克隆了几丁质酶，并对微生物源几丁质酶的理化特性及生物学性状进行了大量研究。几丁质酶生产菌对真菌具有拮抗作用，在离体情况下也能抑制真菌的生长，且与其它细胞壁降解酶、植物病相关蛋白(PR)、杀菌剂、生防因子具有协同增效作用，因此几丁质酶应用于生物防治受到人们广泛的关注。木霉菌(Jrichodermasw.)属于半知菌类的常见土壤丝孢菌，广泛存在于土壤、 根围、叶围、种子和球茎等生态环境中，且可应用于植物病害生物防治。木霉菌能够分泌产生细胞壁降解酶类，其中几丁质酶尤为重要，而且不同种类的几丁质酶表现出对作用底物和病原微生物拮抗活性的特异性。Lorito研究表明，木霉几丁质酶的生物防治效果要比植物、细菌和其他真菌的几丁质酶好。最初从哈茨木霉菌株发现分子量分别为42、37、33kD 的3种内切几丁质酶。后来有学者确定了哈茨木霉Pl菌株的5个几丁质酶基因Chil8-2、 Chil8-3、Chi 18-4, Chil8-10和Chil8_13。其中ThEn42是第一个被克隆的几丁质酶基因， 该基因是目前进行遗传和转化研究的常用材料。发明人所在研究室从河南省不同小麦产区采集和分离获得12株木霉分离物，经 々、麦全烛(Gaeumannomyces graminis var. tri tici )、纹 古病(Mhizoc tonia cerealis Vander Hoeven)及赤霉病菌(/^sari腫graminearum)室内对峙实验，筛选获得1株对3 种病原真菌均具有良好抑制效果的木霉^S-6菌株(菌种保藏号为CGMCC No. 3538，专利文献号CN102071145A)，经形态分类学及ITS序列分析鉴定为绿色木霉(7 viride),已应用于田间小麦全蚀病防治试验。但目前对木霉及其几丁质酶基因的认识还很有限，现有一些几丁质酶基因的表达产物的生物活性及表达量难以尽如人意，且利用原核表达木霉几丁质酶活性较低；还有一些几丁质酶(如绿木霉UKM-I菌株几丁质酶等)对活性存在条件要求苛刻，制备、贮存成本高昂，这些因素制约着其在生物防治中的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种具有SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的绿色木霉几丁质酶基因Rdi，并构建了 Tvchi原核表达载体，获得了高抑菌活性的绿色木霉几丁质酶。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是本发明以^S-6为研究对象，克隆和原核表达分析了几丁质酶Tvchi基因，为木霉抗病基因及抗病机制的分子机理及作物病害生物防治提供了新思路。一种绿色木霉几丁质酶基因斤cAi，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。一种由上述绿色木霉几丁质酶基因Tvchi表达出的绿色木霉几丁质酶。所述的绿色木霉几丁质酶，其特征在于，具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。含有上述绿色木霉几丁质酶基因Tvchi的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。扩增上述绿色木霉几丁质酶基因Tvchi全长或其任意片段的引物对。所述绿色木霉几丁质酶在降解几丁质中的应用。所述绿色木霉几丁质酶在制备杀菌剂中的应用。本发明具有积极有益的效果
1.构建了Tvchi原核表达载体，成功的获得了 47kD左右的包涵体表达蛋白，通过咪唑洗脱、复性获得了具有高活性的表达产物，其制备不需其它表达系统复杂过程，为后续活性检测以及Tvchi功能域研究等提供了简便的方法；
2.本发明中原核表达的Tvchi在20 37°C酶活迅速升高，在37°C时达到最高，在 PH6 8具有较高的酶活活性最适PH值为6. 8，存活条件要求低，易于制备和使用，且生产成本和保存成本低，可广泛应用于作物病害生物防治；
3.本发明中绿色木霉^S-6斤di基因的获得，对于明确观5-6的抑菌分子机理以及进行转基因研究具有重要的意义。
图1为本发明斤Mi基因克隆电泳结果图谱，图中，Ml DNA标准分子量 DL10000 ； 1-2: ZBS-6 菌株总 RNA ;M2 :DNA 标准分子量 DL2000 ;3: PCR 产物；4-5:酶切重组载体 pMD19-T/Tvchi ;M3 DNA 标准分子量 DL15000 ；
图2为本发明Tvchi基因编码的氨基酸序列信号肽序列分析图； 图3为本发明重组质粒pETjSa/Tvchi酶切鉴定结果图，图中，M DNA标准分子量 DL10000 ；1:酶切重组载体 pETj8a/Tvchi ；
图4为本发明Western和SDS-PAGE分析Tvchi基因的表达情况，图中，1 大肠杆盧BL21;2: pET-28a 表达产物；3: pET48a/Chi 表达产物；4:纯化 pET48a/Chi ;5 pET-28a表达产物办大肠杆菌AUA ；7: pET-28a/Chi表达产物；M:蛋白标准分子量；
图5为本发明TvChi表达产物对小麦病害的抑菌活性检测结果图，图中，A:禾谷镰刀菌；B 纹枯病菌；C 全蚀病菌；Al, Bi, Cl 无菌水；A2, B2, C2 :pET_28a表达产物可溶性组分；A3, B3, C3 空BL21细胞裂解液可溶性组分；A4, B4, C4 :pET-28a/TvChi表达细胞上清； A5, B5, C5 经80 mmol/L咪唑洗脱纯化上清；A6，B6, C6 经100 mmol/L咪唑洗脱纯化上清； B7 经150 mmol/L咪唑洗脱纯化上清；A7，C7, B8 无菌培养基；
图6为本发明Tvchi表达产物的活性与其pH (A)、温度(B)的关系图。
具体实施例方式以下的具体实施例便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用到试验材料主要包括
绿木霉(7 viride ) ZBS-6、大肠杆菌 JM109、BL21 (DE3 )、小麦全蚀(G. graminis var. iriiiei )、纹才古病(/ · cerealisNander Hoeven)及赤霉病菌(/7- graminearum)>{φ pET-28a均由本实验室保存；pMD 19T_vector购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶I、损ol、反转录试剂盒、蛋白质分子量标准购自TaKaRa公司；凝胶回收试剂盒和质粒小量快速抽提试剂盒购自U-gene公司；CTAB、X_gal、IPTG、卡那霉素(Kan)、丙烯酰胺十二烷基磺酸钠、甘氨酸等均购自上海生工生物技术有限公司；其它常用化学试剂为市售分析纯。实施例1 -Jvchi基因的克隆和序列测定 (1)引物设计
上游引物 TVchi-F :5' -GGATCC ATGTTGAGCTTCCTCGGCAAAT -3'；下游引物 TVchi-R 5 ‘ - CTCGAG TTAGTTGAGACCCTTCCTGATGT -3'，分别引入了 Bamm 和 Xho I 酶切位点(以下划线表示)。以上引物由上海生工生物技术有限公司合成。(2)斤cAi基因的获得
总RNA的提取与反转录以RNAiso Plus说明书方法提取的绿木霉总RNA。反转录按PrimeScript RT-PCR Kit说明书方法获得全长cDNA。PCR 扩增斤cAi 基因体系(25PL) :2. 5 μ ΙΟ XBuffer (Mg2+ free),2. 5 μ MgCl2 (25 mM),0. 4 μ dNTP (10mM)，上下游引物(ΙΟμΜ)各 1 μ ，0.2 μ rTaq 聚合酶，6 μ 模板 cDNA(lOng^L), 11. 4 μ ddH20。扩增条件94°C 3 min ；94°C 1 min，55°C 1 min，72°C 1 min, 30个循环，72°C 10 min ；10°C保持。PCR结束后，经1%琼脂糖电泳，利用DNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段。如图(图1-A)所示，木霉RNA提取可见3条带，获得了高纯度的RNA,以其 cDNA为模板进行PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳分析，得到1300 bp左右的特异性PCR条带 (图1-B)。将目的片段与PMD19-T载体酶连接，用氯化钙法转化大肠杆菌JM109，并在带有 Ampicilin、X-gal、IPTG的LB平板上根据蓝白斑筛选阳性重组子，用和炀οI双酶切鉴定重组克隆，结果显示质粒被切为约2. 7 kb载体片段和1. 3 kb左右插入片段(图1-C)。 酶切结果表明，已得到插入目的片段的阳性克隆。Tvchi序列测定结果表明，其开放阅读框全长1 293 bp，编码430个氨基酸残基，有其起始密码子ATG和终止密码子TAA。(3) PCR产物的克隆与序列分析
将纯化后的PCR产物与pMD19-T vector连接，转化大肠杆菌JM109，再将成功的阳性克隆样品送上海生工生物工程有限公司进行DNA序列测定。具体如SEQ ID NO. 1所示。该基因编码氨基酸序列的基本特征分析显示-.Tvchi所预测的蛋白质分子量为 46. 7kD，等电点为5. 90，氨基酸组成中带正电荷氨基酸(Arg、Lys) 37个，占8. 7 %，带负电荷氨基酸(Asp、Glu) 41个，占9. 5 %，疏水性氨基酸189个，占44. 06%，亲水性氨基酸162 个，占37. 76%。其氨基酸序列第39-390处存在甘氨酸水解酶18家族典型的活性位点，在 164 172位点具有典型的Chil8家族的蛋白基序FDGIDVDWE，说明所获得的绿木霉Tvchi 基因属于第18家族的几丁质酶。信号肽分析表明其前22个氨基酸为信号肽序列(参见图 2)。以上分析显示该基因具有典型的Oi基因的特征，说明已经成功克隆到几丁质酶基因， 本发明将其命名为Tvchi基因。
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实施例2 ,Tvchi基因原核表达载体的构建
将重组的pMD19-T/Tvchi经37°C、2 h BanfA I和损ol双酶切后，回收1 200 bp左右的片段，与经同样酶切的原核表达载体pET-28a连接，在T4连接酶的作用下于16°C恒温过夜。转化大肠杆菌JM109，37°C、180 r/min过夜培养，提取重组质粒pETj8a/TVchi DNA, Bam^ I和IAo I酶切鉴定。pMD19-T-Tvchi经^WXhol双酶切，连接到同样由fefflHI ^WXhol双酶切的 pET-28a载体上，构建了 pET-28a/TVchi表达载体，酶切结果表明本实验得到了 Tvchi基因的原核表达载体pETjSa/Tvchi (图；3)。将该质粒经制备大肠杆菌感受态细胞转化到BL21 (DE3)菌株中，经Immol的IPTG诱导和SDS-PAGE分离，含有pETj8a/TVchi载体的样品显示出大约为47kD的蛋白条带，Western印迹分析pETj8a/TVChi原核表达载体，检测到约 47 kD的Tvchi-His融合外源蛋白，与预测的融合蛋白分子量大小相符，而含pET48a的工程菌和BL21 (DE3)(阴性对照)经IPTG诱导表达无相应的表达的条带，说明Tvchi基因得到正确的表达，参见图4。实施例3 ,Tvchi基因的诱导表达与蛋白纯化
经酶切鉴定的pETj8a/TVChi质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，挑取正确的转化子克隆，具体步骤参照Yang等(Yang LR，Wang ZJ, Xue BG, et al. Clonging of Antagonistic Protein TasA Gene in Bacillus amyloliquefaciens YN-I and Its Prokaryotic Expression. [J]· Genomics and Applied Biology (基因组学与应用生物 ^),2010,29 (5) :823-8 )的方法进行。实施例4 =Western印迹分析
Western 印迹分析参照 Sambrook 等的方法(Sambrook J, Fritsch EF, and Maniatis Τ, Molecular cloning[M]. New York: A laboratory manual (2nd edition) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 845-898.)，将蛋白从 SDS-PAGE 胶上转移到 PVDF膜上，以(谷胱甘肽巯基转移酶)单克隆抗体(表型小鼠的IgGh;稀释度为1:2 000)作为一抗，以碱性磷酸酶标记的小鼠IgG(稀释度为1:2 000)作为二抗，用DAB作为显色反应的底物。实施例5 表达产物的酶学特性分析 (1)几丁质酶最适温度和PH值的确定
胶体几丁质的制备按Hsu & Lockwood的方法进行(Hsu SC, Lockwood JL. Powdered chitin agar as a selective medium to enumeration of actinomecetes in water and soil [J], Appl Environ Microb, 1975，29: 422-426. )0 用 DNS 还原糖法检测几丁质酶活性。以胶态几丁质为作用底物，在40°C反应30min，测定0D530值并计算还原糖含量。配制不同 PH 值(5. 8,6. 0,6. 2,6. 4,6. 6,6. 8,7. 0,7. 2,7. 4,7. 6,7. 8,8. 0)的磷酸盐缓冲液，求出反应体系中影响几丁质酶活力的最适PH值。测定pH为8. O时，以不同反应温度20、25、 30、32、35、37、38、39、42和45 °C测定温度对表达产物活力的影响，从而确定最适温度，设三次重复。经盐析处理IPTG诱导培养12h的pETj8a/TVChi质粒表达产物后，测定不同反应温度对几丁质酶活性的影响。结果表明，几丁质酶的最适活性温度为37°C，从20 37°C 酶活迅速升高，在37°C下时达到最高，相对酶活力达94. 5% (参见图6-B)，随着温度不断提高，酶活迅速下降。不同PH值对几丁质酶的活性影响较大，通过对不同pH值条件下几丁质酶活性的检测，最适PH值为6. 8，相对酶活可达91. 2% (参见图6-A)，适于在微酸和微碱性条件下作用，当PH值到8时，酶的活性迅速下降，说明该酶在强碱条件下失活，不利于发挥作用。(2)抑菌活性
取上述实施例4中超声破碎后的上清液，经浓缩后用琼脂糖扩散法检测裂解液活性， 具体步骤参照 Yang 等(Yang LR，Wang ZJ, Xue BG, et al. Clonging of Antagonistic Protein TasA Gene in Bacillus amyloliquefaciens YN-I and Its Prokaryotic Expression. [J], Genomics and Applied Biology (基因组学与应用生物学)，2010，29 (5) 823-828)的方法进行。细胞裂解液上清经Ni2+2琼脂糖层析树脂柱，浓度为100 mmol/L咪唑洗脱缓冲液时获得较高浓度和纯度的纯化蛋白(图4)。测定所纯化的表达产物的浓度为0. 459 mg/ mL。其80、100和150mmol/L咪唑洗脱缓冲液对赤霉病、纹枯病和全蚀病菌具有明显的抑菌活性(图 5-A、B、C)。本发明中构建了 Tvchi原核表达载体，成功的获得了 47kD左右的包涵体表达蛋白，通过咪唑洗脱、复性获得了具有活性的表达产物，不需经历其它表达系统复杂过程，为后续应用提供了简便的方法和物质保障。新近的报道显示绿木霉UKM-I菌株430个氨基酸残基的几丁质酶与本发明所克隆到的Tvchi基因具有一定的同源性，但它们在大肠杆菌中表达产物的特性却不尽相同，前者表达产物最适PH值为6.0，最适温度为50°C，而本发明中原核表达的Tvchi在20 37°C酶活迅速升高，在37°C时达到最高，在pH6 8具有较高的酶活活性，最适PH值为6. 8。本发明几丁质酶与前者相比在常规条件下即可保持高酶活性，更适合于生产应用，可大大降低生产、储藏、运输成本。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种绿色木霉几丁质酶基因RcAi，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.一种由权利要求1所述绿色木霉几丁质酶基因Tvchi表达出的绿色木霉几丁质酶。
3.根据权利要求2所述的绿色木霉几丁质酶，其特征在于，具有SEQID NO. 2所示的氨基酸序列。
4.含有权利要求1所述绿色木霉几丁质酶基因Tvchi的重组表达载体、表达盒或重组菌。
5.扩增权利要求1所述绿色木霉几丁质酶基因Tvchi全长或其任意片段的引物对。
6.权利要求2所述绿色木霉几丁质酶在降解几丁质中的应用。
7.权利要求2所述绿色木霉几丁质酶在制备杀菌剂中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种绿色木霉几丁质酶基因Tvchi 及其表达产物与应用。本发明以木霉ZBS-6为研究对象，克隆出具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的绿色木霉几丁质酶基因Tvchi，并构建了Tvchi原核表达载体，获得了高抑菌活性的绿色木霉几丁质酶，其制备方法简单；本发明中绿色木霉ZBS-6Tvchi基因的获得，对于明确ZBS-6的抑菌分子机理以及进行转基因研究具有重要的意义；本发明中原核表达的Tvchi在20～37℃酶活迅速升高,在37℃时达到最高,在pH6～8具有较高的酶活性,最适PH值为6.8，存活条件要求低，易于制备和使用，且生产成本和保存成本低，可广泛应用于作物病害生物防治。
文档编号C12N1/21GK102433351SQ201110432620
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月21日 优先权日2011年12月21日
发明者全鑫, 孙虎, 杨丽荣, 梁慎, 武超, 薛保国 申请人:河南省农业科学院