一种优化的发酵高产几丁质酶的方法
【专利摘要】本发明提供了一种优化的发酵高产几丁质酶的方法，是以已2009年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC3483一株高产几丁质酶的Chitinolyticbacter?meiyuanensis?SYBC-H1菌株为发酵出发菌株，并采用我们优化的种子培养基配方和产酶培养基配方及优化的发酵生产几丁质酶的方法来发酵高产几丁质酶，发酵制备的几丁质酶酶活最高可达10U/ml以上，所制备的酶可高效水解几丁质，生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖，可广泛用于化工、医药、食品、材料、染料等领域，属于生物【技术领域】。
【专利说明】一种优化的发酵高产几丁质酶的方法
【技术领域】[0001]本发明提供了一种优化的发酵高产几丁质酶的方法，是以已2009年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC3483 —株高产几丁质酶的Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-Hl菌株为发酵出发菌株，并采用我们优化的种子培养基配方和产酶培养基配方及优化的发酵生产几丁质酶的方法来发酵高产几丁质酶，发酵制备的几丁质酶酶活最高可达10U/ml以上，所制备的酶可高效水解几丁质，生成N-こ酰-D-氨基葡萄糖，可广泛用于化工、医药、食品、材料、染料等领域，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]几丁质酶可高效降解几丁质，生成N-こ酰-D-氨基葡萄糖。而N-こ酰-D-氨基葡萄糖是生物细胞内许多重要多糖的基本组成单位，尤其在甲壳类动物的外骨骼含量最高。它是合成双歧因子的重要前体，在生物体内具有许多重要生理功能。临床上用于治疗风湿性及类风湿性关节炎。也可以作为食品抗氧化剂及婴幼儿食品添加剤，糖尿病患者甜味剂。主要用于临床增强人体免疫系统的功能，抑制癌细胞或纤维细胞的过度生长，对癌症和恶性肿癌起到抑制和治疗作用；对于各种炎症，能起到有效的治疗，对骨关节炎及关节疼痛也有治疗作用。
[0003]几丁质酶的价格极为昂贵，如日本的chitin T-1几丁质酶市价为每50毫克20000日元，由于几丁质酶具有广阔的应用前景和极高的经济开发价值，世界上一些发达国家都在进行生物技术生产几丁质酶的研究。因此，我们以保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC3483 —株产几丁质酶的菌株Chitinolyticbactermeiyuanensis SYBC-Hl为出发菌株对该菌株的种子培养基配方和产酶培养基配方进行优化探索研究，使其形成优化的发酵生产几丁质酶的方法。
【发明内容】
[0004]本发明以保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC3483的一株产几丁质酶菌株Chitinolyticbacter meiyuanensisSYBC-HI为出发菌株，对该菌株的种子培养基配方和产酶培养基配方进行优化探索研究，使其形成优化的发酵生产几丁质酶的方法，所制备的酶可高效水解几丁质，生成N-こ酰-D-氨基葡萄糖，可广泛用于化工、医药、食品、材料、染料等领域，来替代价格昂贵的进ロ的几丁质酶。
[0005]本发明的技术方案:以保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号 CGMCC3483 —株产几丁质酶菌株 Chitinolyticbacter meiyiyuanensisSYBC-HI 为出发菌株，对该菌株的种子培养基配方和产酶培养基配方进行优化探索研究，使其形成优化的发酵生产几丁质酶的方法，エ艺为:
[0006](I)种子培养[0007]种子培养基:磷酸二氢钾0.75g/L，磷酸氢二钾0.32g/L，硫酸镁0.55g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L,酵母浸出物4.2g/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨4.2g/L。
[0008]挑经过活化的产几丁质酶菌落二环接种到盛有50ml种子培养基的250ml三角瓶中进行培养。培养条件:pH值:7.0，温度:30°C，摇床转速200rpm，培养时间:12h，即为发酵种子液。
[0009](2)产酶培养
[0010]产酶培养基:果糖3.2g/L，玉米浆粉12g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，磷酸氢二钾0.4g/L,硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L,几丁质粉粒1.5g/L。
[0011]以5%接种量，将发酵种子液250ml加入到含有5升产酶培养基的7L发酵罐中。发酵产酶条件:pH:7.5，温度:30°C，发酵时间:75小时，转速:400prm，通气量:1.5L/min/
し
[0012](3)酶液提取及酶活力测定
[0013]发酵结束后，将发酵液用冷冻离心机离心，离心条件:6000rpm、4°C、10min，离心
后，取上清液即为几丁质酶液，用酶活力測定方法测定酶活力。
[0014](4)酶活的测定方法
[0015]取0.5ml上清液，加入pH = 6.5的Iml0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液，0.5ml0.5%的胶体几丁质(W/V)，37°C保温30min，取出后加入DNS试剂0.5ml，沸水浴IOmin后，迅速用冰水冷至室温，6000rpm离心8min, 530nm处比色,重复三次,取平均值作试验结果，同时以高温灭活的上清液同样处理作为对照，最后以OD53tl的平均值来计算还原糖的含量，计算出酶活。酶活力定义为在上述条件下毎分钟释放相当于lmmol NAG所需要的酶量为ー个酶活单位⑶。
[0016]本发明的有益效果
[0017]提供了优化的种子培养基配方和产酶培养基配方及优化的发酵生产几丁质酶的方法。与其他制备几丁质酶方法相比较，具有酶活力高，发酵技术简便和成本低的优点，且生产的几丁质酶可高效水解几丁质，因此，本发明有着广泛的エ业使用价值和显著的经济效益前景。
【具体实施方式】
[0018]实施例1
[0019]种子培养基:磷酸二氢钾0.75g/L，磷酸氢二钾0.32g/L，硫酸镁0.55g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L,酵母浸出物4.2g/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨4.2g/L。
[0020]挑经过活化的产几丁质酶菌落二环接种到盛有50ml种子培养基的250ml三角瓶中进行培养。培养条件:pH值:7.0，温 度:30°C，摇床转速200rpm，培养时间:12h，即为发酵种子液。
[0021]产酶培养基:果糖3.2g/L，玉米浆粉12g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，磷酸氢二钾0.4g/L,硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L,几丁质粉粒1.5g/L。
[0022]以5%接种量，将发酵种子液250ml加入到含有5升产酶培养基的7L发酵罐中。发酵产酶条件:pH:7.5，温度:30°C，发酵时间:75小时，转速:400prm，通气量:1.5L/min/L。
[0023]发酵结束后，将发酵液用冷冻离心机离心，离心条件:6000rpm、4°C、10min，离心后，取上清液即为几丁质酶液，用酶活力測定方法测定酶活力为10.21U/ml。
【权利要求】
1.一种优化的发酵高产几丁质酶的方法，其特征在于:用已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC3483，保藏日期为2009年11月30日的一株高产几丁质酶的菌株Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1为出发菌株,对该菌株的种子培养基配方和产酶培养基配方进行优化研究，形成优化的发酵生产几丁质酶的方法，エ艺为: (1)种子培养 种子培养基:磷酸二氢钾0.75g/L，磷酸氢二钾0.32g/L，硫酸镁0.55g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L,酵母浸出物4.2g/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨4.2g/L ； 挑经过活化的产几丁质酶菌落二环接种到盛有50ml种子培养基的250ml三角瓶中进行培养。培养条件=PH值:7.0，温度:30°C，摇床转速200rpm，培养时间:12h，即为发酵种子液； (2)产酶培养 产酶培养基:果糖3.2g/L，玉米浆粉12g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.02g/L,几丁质粉粒1.5g/L ； 以5%接种量，将发酵种子 液250ml加入到含有5升产酶培养基的7L发酵罐中。发酵产酶条件:pH:7.5，温度:30°C，发酵时间:75小时，转速:400prm，通气量:1.5L/min/L ； (3)酶液提取及酶活力測定 发酵结束后，将发酵液用冷冻离心机离心，离心条件:6000rpm、4°C、10min，离心后，取上清液即为几丁质酶液，用酶活力測定方法测定酶活力； (4)酶活的測定方法 取0.5ml上清液，加入pH = 6.5的Iml 0.1M醋酸-醋酸钠缓冲液，0.5ml0.5%的胶体几丁质，37°C保温30min，取出后加入DNS试剂0.5ml，沸水浴IOmin后，迅速用冰水冷至室温,6000rpm离心8min, 530nm处比色,重复三次,取平均值作试验结果，同时以高温灭活的上清液同样处理作为对照，最后以OD53tl的平均值来计算还原糖的含量，计算出酶活。酶活力定义为在上述条件下毎分钟释放相当于lmmol NAG所需要的酶量为一个酶活単位。
【文档编号】C12R1/01GK103571810SQ201210278062
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月7日 优先权日:2012年8月7日
【发明者】张明, 李洪兵, 张峰 申请人:湖南鸿鹰生物科技有限公司