一种用于生物标记物筛选的抗体芯片试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种用于生物标记物筛选的抗体芯片试 剂盒。
【背景技术】
[0002] 细胞因子（cytokines)是机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的具有免疫调 节和效应功能的蛋白质或小分子多肤。
[0003] 细胞因子具有非常广泛的生物学活性，能够促进祀细胞的增殖和分化，促进或抑 制其它细胞因子和膜表面分子的表达，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进炎症过程，影响细 胞代谢等。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋 化因子、生长因子等。众多细胞因子在体内通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用， 具有多效性、重叠性、枯抗性、协同性等多种生理特性，形成了十分复杂的细胞因子调节网 络，参与人体多种重要的生理功能。
[0004] 细胞因子是通过与祀细胞表面的细胞因子受体特异结合后发挥其生物学效应的， 促进祀细胞的增殖和分化，增强抗感染和杀肿瘤细胞效应，促进或抑制其他细胞因子的合 成，促进炎症过程，影响细胞代谢等。每种细胞因子可作用于多种细胞，可受多种细胞因子 的调节，具有网络性的特点；不同细胞因子之间具有相互协同或相互制约的作用，由此构成 了复杂的细胞因子免疫调节网络。
[0005] 因此，细胞因子研究及检测具有非常重要的理论和实用意义，利用细胞因子抗体 芯片检测病人标本，可筛选出此疾病的生物标记物，有助于阐明分子水平的免疫调节机理， 有助于疾病的预防、诊断和治疗。
[0006] 目前常用的细胞因子的检测方法主要包括：酶联免疫吸附法（ELISA)，放 射免疫分析（radio immunoassay, RIA)，免疫印绩法（western blot),流式细胞仪 (Flow-切tometar)，液相磁珠法（LUMI肥X)和96-孔化ISA板法等。其中，酶联免疫吸附法 是最普遍的方法，具灵敏度高、特异性较好、操作简便等优点。但一次试验只能检测单一指 标，通量低、成本高，在具有多指标特性的细胞因子检测中，该方法存在明显的不足；放射免 疫分析（RIA)虽然灵敏度高，是由于具有放射性污染，现在已很少采用；免疫印迹法能测定 分子的大小，且无非特异的反应，但操作繁琐，灵敏度低，且只能检测单一指标，不适合运用 于细胞因子的检测；流式细胞仪能在细胞水平上检测细胞因子的水平，但却存在低灵敏、低 通量、高成本等缺点，且采用的设备结构复杂，不易推广。液相磁珠法（LUffl肥幻容易出现 交叉干扰，W至于同时检测因子的数目有限。96孔化ISA板法是把不同的捕获抗体W微阵 列的方式固定在96孔酶标板底，然后通过类似化ISA的操作来达到多因子的联合检测。但 由于96孔酶标板受孔径大小限制，在一个孔内点的数目有限，重复性也差。
[0007] 因此，有必要开发一种新型的多细胞因子联合检测试剂盒，W克服现有技术中亟 待解决的问题，实现多细胞因子的高通量、高灵敏度、高特异性和低成本检测，实现疾病的 生物标记物的高通量筛选。在本发明中，我们选用没有空间限制的底膜作为载体，将60种 细胞因子的捕获抗体点不受空间的限制，具有独立位点地点在底膜上，减少捕获抗体彼此 干扰的因素，使得细胞因子高通量筛选成为可能，所检测的细胞因子灵敏度可达单因子的 ELISA检测灵敏度。
【发明内容】
[0008] 针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高通量、高灵敏 度、高特异性和低成本的细胞因子检测试剂盒，采用蛋白质芯片技术，能够同时检测六十项 细胞因子，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、需有费仪器、灵敏度低等缺陷，具有廉 价、便利、灵敏、准确、高通量、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明提供的一种检测多种细胞因子用于筛选生物标记 物的抗体芯片试剂盒，包括：抗体芯片，包括底膜和在底膜表面上固定的60种细胞因子的 特异性抗体、H种阳性对照；生物素标记的细胞因子检测抗体混合物；和辣根过氧化物酶 标记的抗生物素蛋白链菌素。
[0010] 根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述底膜为硝酸纤维素膜、聚偏氣己帰 膜或者尼龙膜，采用全自动点样仪完成点样操作，各特异性抗体点阵排布于所述底膜。
[0011] 根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述60种细胞因子的特异性抗体是通 过W下方法固定在所述底膜上的：将所述特异性抗体混合溶解于含有0. Ol-lOg/lOOml牛 白蛋白的Tris缓冲液中，配制浓度为0. 5-l(K)ng/100ml的抗体溶液，取50-500nl点样于底 膜上，将点样好的底膜放于室温条件下静置5分钟到8分钟，于2C到8C保存备用。
[0012] 根据本发明所述的蛋白联合检测芯片的进一步特征，种不同浓度的生物素标 记的小牛IgG作为阳性对照，作为不同微阵列间的标准化参照系。
[0013] 可采用全自动点样仪完成点样操作。每种抗体和H种不同浓度的阳性对照在每个 芯片中都有两次的重复。
[0014] 根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述特异性抗体为选自针对如下细胞因 子的抗体；血管生成素、脑源性神经营养因子、B-淋己细胞趋化因子、骨形态发生蛋白-4、 骨形态发生蛋白-6、CK目8-1、睫状神经营养因子、表皮生长因子、趋化因子、趋化因子-2、 趋化因子-3、成纤维细胞生长因子-6、成纤维细胞生长因子-7、FMS样酪氨酸激酶3配体、 趋化因子CX3化1、趋化因子（C-C基序）配体6、胶质细胞源性神经营养因子、粒细胞集落 刺激因子、趋化因子（C-C基序）配体1、Y-干扰素、膜岛素样生长因子结合蛋白-1、膜岛 素样生长因子结合蛋白-2、膜岛素样生长因子结合蛋白-4、膜岛素样生长因子1、白细胞 介素-10、白细胞介素-13、白细胞介素-15、白细胞介素-16、白细胞介素-1 a、白细胞介 素-1目、IL-1受体枯抗剂、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、 白细胞介素-6、白细胞介素-7、瘦素、LIGHT蛋白、单核细胞趋化蛋白1、单核细胞趋化蛋白 2、单核细胞趋化蛋白3、单核细胞趋化蛋白4、巨瞻细胞集落刺激因子、巨瞻细胞衍生的细 胞因子、单核因子诱导干扰素Y、巨瞻细胞炎性蛋白-1 5、巨瞻细胞炎性蛋白-3 a、中性粒 细胞激活蛋白-2、神经营养因子3、巨瞻细胞炎性蛋白-4、血小板衍生生长因子-BB、趋化因 子（C-C基序）配体5、干细胞因子、基质细胞衍生因子-1、趋化因子（C-C基序）配体17、转 化生长因子目1、转化生长因子目3、肿瘤坏死因子-a、肿瘤坏死因子-目。
[00巧]在本发明就的一个实施例中，采用Bio-Rad公司或化rkin Elmer公司生产的全自 动点样仪器，而用于固定特异性抗体的底膜则采用