专利名称：间接聚合和标记的抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及通过抗体聚合，所得聚合抗体结合于蛋白质形成蛋白复合物或聚合的抗体结合物并用花青染料标记该结合物而制成的间接聚合和标记的抗体，还涉及其制备方法。
用染料标记制成的染料标记抗体是肉眼可见的，与样本溶液中所含的免疫原或抗原有特异性反应。因此，这样的抗体用于例如在免疫传感器中借助抗原-抗体免疫反应检出样本溶液中所含的特异性物质即抗原，在各种医疗机构中作为诊断工具具有广阔的应用。
花青染料是标记抗体最常用的染料，因为它们反应性强、摩尔吸光系数高(见Bioconjugate Chemistry Vol.4,No.2,pp.105-111,1993)。
这些花青染料具有与抗体上存在的氨基或羧基反应形成共价键的官能团。花青染料与抗体的结合比为每分子抗体20-50个花青染料分子。
这样制成的花青染料标记抗体被应用于如免疫色谱法，因为其可见度通常高，并广泛地用于检测小量特异性物质，如只在妊娠妇女尿中含有的绒毛膜促性腺素。
正常抗体包括数百至数千个氨基或羧基。但是，通常的解释是，由于其三维结构，在这么多的氨基或羧基中，只有50个左右可参与反应，这使每分子抗体上花青染料的结合分子数限制为50个分子。
而且，由于抗体与抗原的反应部位仅限于每分子2个，因此抗体与抗原结合敏感性低。
在免疫传感器等中使用这样的标记抗体限制了传感器的敏感性，当样本溶液中被分析物即抗原浓度低时产生难于检测的重大问题。
鉴于上述问题，本发明的目的在于提供高度敏感的间接聚合和标记抗体，促进样本溶液中低浓度被分析物的检出。
本发明的另一个目的在于提供上述间接聚合和标记抗体的制备方法。
本发明提供间接聚合和标记的抗体，包含抗体和用于标记抗体的染料，该染料为以如下化学式(1)-(4)之一表示的花青染料
其中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示整数1-4，其中，抗体经多功能试剂聚合并经二硫键结合于蛋白质形成聚合的抗体结合物，该抗体结合物被花青染料标记。
通过将抗体聚合制得的聚合抗体是多价的，具有很多与抗原反应部位，因此与其它常见的二价抗体相比，其结合敏感性高。
此外，当结合到蛋白质上后，所得的聚合抗体结合物与花青染料结合的面积增加，还增加了染料与聚合抗体结合物的结合分子数目。结果，用上述方法得到的间接聚合和标记抗体可具有极好的可见度。
本发明间接聚合和标记的抗体用于例如免疫色谱法，促进以高敏感性检出低浓度被分析物即抗原。按照本发明的间接聚合和标记抗体因其高敏感性，还可用于任何类型的生物传感器。
在本发明的一个较佳实施模式中，间接聚合和标记抗体具有的结构是其花青染料骨架经花青染料中存在的琥珀酰亚胺的酰基碳与聚合抗体结合物中存在的氨基氮之间的共价键结合于聚合抗体结合物。
按照本发明的间接聚合和标记抗体，其合乎需要的抗体聚合度可以在2-50范围内。
按照本发明的间接聚合和标记抗体的制备方法包括以下步骤在中性或弱碱性磷酸盐缓冲液中，用多功能试剂将抗体聚合，形成聚合抗体；在中性或弱碱性磷酸盐缓冲液中，将蛋白质还原形成还原蛋白，使聚合抗体与还原蛋白反应，形成聚合抗体结合物，将该聚合抗体结合物与染料反应，从而用染料标记聚合抗体结合物，染料为化学式(1)-(4)之一表示的花青染料。
在本发明的另一个实施模式中，该方法可包括如下步骤
在中性或弱碱性磷酸盐缓冲液中，用多功能试剂将抗体聚合，形成聚合抗体；在中性或弱碱性磷酸盐缓冲液中，将蛋白质还原形成还原蛋白，使还原蛋白与染料反应，形成标记蛋白，将聚合抗体与标记蛋白反应，染料为化学式(1)-(4)之一表示的花青染料。
在任何一个方法中，磷酸盐缓冲液的较佳pH值在7.0-8.0范围内。
可用于本发明的较佳聚合和标记抗体的抗体不限于特定的抗体，任何抗体无论其来源和亚型均可使用。可用的抗体的例子为各种免疫球蛋白(Ig)，如小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠IgA、小鼠IgE、大鼠IgG、大鼠IgM、大鼠IgA、大鼠IgE、家兔IgG、家兔IgM、家兔IgA、家兔IgE、山羊IgG、山羊IgM、山羊IgE、山羊IgA、绵羊IgG、绵羊IgM、绵羊IgA、绵羊IgE等。这些抗体可从商业途径购得或可从受关注的动物身上得到。
多功能试剂可列举在同一个分子上有两个或两个以上能结合于抗体的官能团如琥珀酰亚胺基、吡啶基二硫基等的试剂。这些试剂的例子可以是化学式(5)所示丙酸二硫基磺基琥珀酰亚胺酯、化学式(6)所示辛二酸二(磺基琥珀酰亚胺)酯、化学式(7)所示酒石酸二琥珀酰亚胺酯、化学式(8)所示二(琥珀酰亚胺基琥珀酸乙二醇酯、化学式(9)所示N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸等。
结合于聚合抗体上的蛋白质可以是不起抗体作用的任何蛋白质。较好的是高水溶性蛋白。例如，血清白蛋白较佳，因为它对抗原-抗体反应无抑制作用，并极易溶于水。
化学式(1)或(2)所示花青染料是有利于宏观确认的红色染料。
化学式(1)所示染料共价碳原子数目少，具有高度水溶性，而化学式(2)所示染料具有很深的红色，最易于宏观确认。
如果用仪器如传感器确认花青染料的呈色反应，染料的颜色不限于红色，化学式(3)或(4)所示蓝色染料同样也可使用。
化学式(3)或(4)所示染料不太可能受样本溶液中杂质的不良影响，因为它们的吸收谱仅存在于长波长区域。
在化学式(1)-(4)中，X表示的卤素可列举氟、氯、溴或碘，M表示的金属可列举锂、钠、钾等。
本发明的新特征在所附的权利要求中特别加以阐述，本发明无论其组成和内容，以及其它目的和特征，均可结合附图从下面的详细描述中得到更好的理解和认识。
图1是阐明本发明的一个实施例中所用的免疫色谱法的斜视图。
首先，描述式(2)所示花青染料的合成途径的一个实施例。
第一步，将肼基苯磺酸(10)和异丙基甲基酮溶于酸溶剂，加热生成磺酸假吲哚鎓(11)。在磺酸假吲哚鎓(11)的醇溶液中加入金属氢氧化物的饱和醇溶液，生成磺酸假吲哚鎓的金属盐(12)。
第二步，将卤代烷酸加到金属盐(12)的有机溶液中，加热生成磺酸羧基烷基假吲哚鎓的另一个金属盐(13)。此处，考虑到卤代烷酸的水溶性问题，以具有1-4个碳原子为佳。
最后一步，将金属盐(13)和原甲酸乙酯溶于碱性有机溶剂，加热生成羧酸衍生物(14)。然后，将羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳化二亚胺，后者作为缩合剂，加到羧酸衍生物(14)的有机溶剂中，将混合物搅拌，最终生成化学式(2)所示花青染料，用作标记染料。
在化学式(1)所示花青染料的合成中，用N-羧基乙基-3,3-二甲基假吲哚代替上述原甲酸乙酯。同样地，在化学式(3)或(4)所示花青染料的合成中，分别用四甲氧基丙烷或戊烯二醛四甲基缩醛代替上述原甲酸乙酯。
化学式(1)-(4),(13)和(14)所示化合物中所含的卤素可列举氟、氯、溴或碘。化学式(1)-(4)和(12)-(14)所示化合物中所含的金属可列举锂、钠、钾等。
下面将描述用多功能试剂进行抗体聚合反应的机制。
起始反应如式(15)所示，当多功能试剂，具有两个或两个以上琥珀酰亚胺基的二硫二(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)，加到抗体中时，如式(16)所示，抗体的一个氨基接近多功能试剂的琥珀酰亚胺基的一个酯键。
接着，如式(17)所示，氨基和酯基之间发生反应，氨基失去一个氢原子。然后，从氨基释放的游离氢原子结合到琥珀酰亚胺基的琥珀酰亚胺上，将琥珀酰亚胺转变为羟基琥珀酰亚胺，导致羟基琥珀酰亚胺从琥珀酰亚胺基释出。当上述反应进行时，琥珀酰亚胺基的剩余部分和失去一个氢原子的氨基互相结合，形成酰胺键，该酰胺键起到将多功能试剂分子结合于抗体分子的作用。
如式(18)所示，同样地反应也出现在多功能试剂的其余琥珀酰亚胺基上，形成另一个酰胺键，将其它多功能试剂分子结合于其它抗体分子。该反应重复进行，形成聚合抗体。
具有琥珀酰亚胺基的花青染料和具有氨基的抗体之间的结合机制与上述相同。
下面，借助具体实施例对本发明作更具体的描述。
(Ⅰ)聚合抗体的合成将10mg小鼠IgG(相当于6.667×10-5mmol)溶于1ml磷酸盐缓冲液(以下简称“PBS”)。然后将一滴(0.1ml)含丙酸二硫磺基琥珀酰亚胺酯(以下简称“DTSSP”)的PBS加到小鼠IgGPBS中，于35℃搅拌。此处所用的DTSSP的PBS溶液含DTSSP 4.057mg(相当于0.006667mmol,100当量)。
然后，于35℃搅拌30分钟，将混合物用琼脂糖凝胶(商品名Sephadex G25M柱)作凝胶过滤，得到约6ml IgG凝聚物的PBS液(IgGagg.)。IgG凝聚物(IgGagg.)中IgG分子的浓度计算如下将这样合成的溶液(0.5ml)于280nm处测定吸光度，吸光度值为2.69。由于考虑到280nm处观察的吸光度来自IgG，因此，IgG凝聚物(IgGagg.)的浓度计算如下IgGagg.=2.69/2.099×105=1.282×10-5(M)计算时，将IgG在280nm处的摩尔吸光系数限定为2.099×105。
(Ⅱ)聚合抗体结合物的合成将牛血清白蛋白(下文简称“BSA”)(110mg，相应于0.001667mmol；25当量IgG)溶于5ml PBS，所得的混合物中再加入二硫苏糖醇(77mg)，室温搅拌30分钟以还原BSA。然后将溶液用Sephadex G25M柱(2.5×30cm)进行凝胶过滤，得到BSA的28ml PBS溶液(SH活性)。
向这样得到的BSA的PBS溶液中加入按上述(Ⅰ)制得的聚合抗体的PBS溶液6ml，于4℃搅拌过夜，然后用Sepharose凝胶(商品名Sephacryl S300HR柱)，进行凝胶过滤，得到聚合抗体结合物的PBS溶液50ml。
(Ⅲ)间接聚合和标记抗体的制备将化学式(2)表示的称作“SLIC3”的染料350.2mg(相当于0.34mmol，总蛋白含量的200当量)溶于0.2ml PBS中。将所得的溶液轻轻地滴加到按上述(Ⅱ)制得的聚合抗体结合物的PBS溶液50ml中。此处所用的染料中，式(2)中，X为碘，M为钾，n为2。
于4℃搅拌20小时后，将溶液用Sephadex G25M柱(2.5×30cm,2.5×150cm)进行凝胶过滤，得到间接聚合和标记抗体的PBS溶液64ml。这样得到的间接聚合和标记抗体，其每分子IgG的SLIC3数目测定如下按前面描述的同样的方式，在550nm处测定溶液的吸光度，其值为24.7。因为聚合抗体结合物在550nm处不被吸收，因此认为观察到的吸收源自结合于聚合抗体结合物的SLIC3分子。因此，SLIC3的浓度〔SLIC3〕可测定如下〔SLIC3〕=24.7/8.55×104=2.889×10-4(M)计算时，550nm处SLIC3的摩尔吸光系数定为8.55×104。
因此，结合于间接聚合和标记抗体的一个IgG分子上的SLIC3分子的数目可测定如下〔SLIC3〕/〔IgGagg.〕=2.889×10-4/1.042×10-6=277.3分子经计算，结合于蛋白质上的一分子IgG的浓度(即〔IgGagg.〕)定为10mg/64ml(1.042×10-6M)。
(Ⅳ)间接聚合和标记抗体的评价将上述(Ⅲ)中制得的间接聚合和标记抗体引入免疫色谱传感器(immunochromatosensor)。测定550nm处吸光度来评估该抗体的敏感性。
图1是此处所用的免疫色谱传感器结构的斜视图。将第一玻璃滤片2、硝基纤维素制的抗体固定膜5和第二玻璃滤片6依次放置在聚氯乙烯之类塑料制的支持板1上。将第一玻璃滤片2一端浸渍(Ⅲ)中制得的间接聚合和标记抗体，该端与抗体固定膜5接触，形成浸渍了标记抗体的区域3。将能与间接聚合和标记抗体的同样抗原反应的另一种抗体吸收固定于抗体固定膜5的预定部位，形成抗体固定区域4。
用具有上述结构的免疫色谱传感器测定本发明的间接聚合和标记抗体的吸光度。一种测定方法如下按照色谱法的原理，当样本液滴加到不与抗体固定膜5接触的第一玻璃滤片2的另一端时，样本溶液开始从第一玻璃滤片2经标记抗体浸渍部位3向第二玻璃滤片6移动。这时，标记抗体浸渍区域3上的间接聚合和标记抗体与样本溶液中所含的抗原结合。然后，结合于宿主抗原的含间接聚合和标记抗体的样本溶液向抗体固定区域4移动，宿主抗原与抗体固定区域4上的固定抗体发生结合，将抗原固定在抗体固定区域4。剩余的样本溶液经抗体固定膜5继续向第二玻璃滤片6移动，最后吸附在第二玻璃滤片6上。
将波长550nm的L1光辐照抗体固定区域4，测定反射光L2，从而测得吸光度。
然后，除了用化学式(1)、(3)和(4)代替化学式(2)所示花青染料外，按上述同样的方法制备其它间接聚合和标记抗体。将这样制得的抗体施加于免疫色谱传感器，分别于430、640和720nm处测定它们的吸光度。此处所用的染料中，化学式(1)、(3)和(4)中X为碘，M为钾，n为2。
为作对比，除了用非聚合抗体代替聚合抗体结合物外，按所示同样的方法制备其它标记抗体，同样地施加于免疫色谱传感器并测定其吸光度。
结果显示，按本发明的间接聚合标记抗体实施例(各包含聚合抗体结合物)，其吸光度约为0.8，而只包含非聚合抗体的对比实施例的标记抗体其吸光度约为0.08。结果表明，本发明的间接聚合和标记抗体的敏感性约10倍于对比实施例的敏感性。
如上所述，本发明的间接聚合和标记抗体具有很多与抗原反应的位点，也富含与一分子抗体结合的染料分子的数目，因此，促进高灵敏度的免疫检测。本发明的间接聚合和标记抗体在例如免疫色谱法上的使用使高灵敏度传感器的产生成为可能。
虽然用目前最佳实施例对本发明进行了描述，但应当理解的是，这样的揭示不能解释为对本发明的限制。在阅读上述公开内容后，各种变动和修改对于本发明所属技术领域的技术人员来说无疑将会不解自明。因此，所附的权利要求旨在解释为覆盖落在本发明的真实精神和范围内的所有变动和修改。
权利要求
1．间接聚合和标记的抗体，包含抗体和用于标记所述抗体的染料，所述染料为以如下化学式(1)-(4)之一表示的花青染料
其中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示整数1-4，其中，所述抗体经多功能试剂聚合并经二硫键结合于蛋白质形成聚合的抗体结合物，所述聚合的抗体结合物被花青染料标记。
2．如权利要求1所述的间接聚合和标记抗体，其中所述花青染料骨架经所述花青染料中存在的琥珀酰亚胺的酰基碳与所述聚合抗体结合物中存在的氨基氮之间的共价键结合于所述聚合抗体结合物。
3．权利要求1所述的间接聚合和标记抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤在中性或弱碱性磷酸盐缓冲液中，用多功能试剂将抗体聚合，形成聚合抗体，在中性或弱碱性磷酸盐缓冲液中，将蛋白质还原形成还原蛋白，将所述聚合抗体与所述还原蛋白反应，形成聚合抗体结合物，及将所述聚合抗体结合物与染料反应，从而用所述花青染料标记所述聚合抗体结合物，所述染料为化学式(1)-(4)之一表示的花青染料
其中，R1和R2表示氢或烷基，X表示卤素，M表示氢或碱金属，n表示整数1-4。
全文摘要
高灵敏度间接聚合和标记的抗体,该抗体促进样本溶液中低浓度抗原的检测。其制备方法为用多功能试剂聚合抗体,将聚合抗体经抗体的二硫键与蛋白质结合形成聚合抗体结合物,用上式所示花青染料标记结合物:其中,R
文档编号C07D403/00GK1235165SQ99106379
公开日1999年11月17日 申请日期1999年5月6日 优先权日1998年5月7日
发明者重藤修行, 宫崎仁诚 申请人:松下电器产业株式会社