专利名称：一种制备酶标记抗体的方法
技术领域：
本发明属于免疫分析技术领域，尤其涉及一种酶标记抗体的制备方法。
背景技术：
酶免疫测定技术自问世以来发展迅速，在药物筛选、医疗诊断、食品安全检测等众 多领域得到广泛应用。它既继承了放射性免疫测定的高灵敏度等优点，又克服了前者需使 用放射性标记这一缺点。酶免疫测定将酶促反应的高效率和免疫反应的高特异性有机地结 合起来，可对各种分析物如蛋白、毒素、农药、微生物等进行定量检测，是目前灵敏度高、适 应性强、并在生产和临床中得到推广的免疫测定技术。另外，在免疫测定中使用酶作为标 记，还在于酶能保持长期的稳定性、对操作人员无危害、并避免了放射性免疫中存在的废物 处理问题。而制备特定抗体和酶偶联物(酶标记抗体)是能否实现对特定抗原分析物进行定 量检测的关键。目前用于酶标记抗体制备的方法传统的主要有戊二醛法和过碘酸钠法。戊二醛法 也是至今最常见的标记酶到抗体上的偶联方法。它又分为一步法和两步法，一步法操作简 便、快速，只要将一定量的酶和抗体加入到缓冲液中，同时加入一定量的戊二醛进行反应。 但一步法的缺点是(1)偶联反应不易控制，若被偶联的两种物质与偶联剂的反应速度不同， 则反应速度快的那种分子易发生自生聚合；(2)偶联效率不高，参与偶联反应的两种分子 所占比率较低。而两步法克服了一步法的缺点，它采用将与偶联剂反应较弱的分子先用过 量的偶联剂活化，然后去除多余偶联剂后再加入反应速度相对快的偶联分子。两步法虽然 操作繁琐，但偶联率提高，而且形成的同分子聚合物减少。过碘酸钠法是偶联酶和糖蛋白产 率最高的方法，该法利用过碘酸钠将糖蛋白(抗体、糖基化的酶等)上的糖链基团氧化成醛 基，再通过醛基与待偶联的分子发生连接。与戊二醛法相比，过碘酸钠法的效率提高至少 3 4倍。用于偶联HRP和IgG时，约有70%的酶和99%的抗体反应。最佳时，每个IgG分 子可与5 6个HRP分子连接。尽管按该法制备酶标记物时酶活的损失可达50%，但用于 酶免疫测定时可将灵敏度提高5倍左右。过碘酸钠法虽有很高的产率，但操作中对于过碘 酸钠的浓度和工作PH等都需十分注意，过碘酸钠浓度过高可以导致新形成的醛基被直接 进一步氧化为羧基，浓度过低则无法使糖基氧化。针对不同批次的酶之间存在糖基化程度 有差别的特点，使用过碘酸钠法时需对不同批次的方法有所调整。另一方面，由于重组抗体 和许多单克隆抗体不含糖基，若准备用该法连接这类抗体时，需事先确定抗体上是否有合 适的修饰位点。戊二醛法和过碘酸钠法各有优点，也成为了商业法酶标抗体(如Sigma公 司)的主流制备方法，但这两种方法都涉及使用高浓度的酶和抗体，也需要较为繁琐的分离 与纯化步骤，如凝胶过滤、长时间透析或亲和层析柱纯化等。近年来，纳米技术发展迅速，新兴的纳米材料也层出不穷，这为新一代的酶标抗体 的发展提供了可能。西班牙Merkoci课题组分别于2007年和2010年报道将HRP 二抗和胶 体金结合形成胶体金HRP 二抗复合标记抗体用于酶联免疫检测，结果表明新的酶标抗体能 使检测的灵敏度提高10倍左右。该复合抗体是将传统方法制备的酶标记抗体以胶体金表面能承受的饱和吸附量吸附到胶体金表面，形成包被有酶标二抗的纳米胶体金。当胶体金 上的任一抗体参与抗原捕捉后，与该抗体连接着的胶体金上的其他酶标记抗体都可以参与 信号示踪(如加底物后显色)，从而使灵敏度提升。另一方面，胶体金的相对大的表面积足以 同时容纳更多的酶标记抗体(如1个18nm胶体金离子可容纳约13个HRP),Merkoci课题组 使用的这种高灵敏度的胶体金复合酶标特点在于使参与信号示踪的酶标量增多，突破传统 酶标抗体在参与捕捉抗原后，只有酶标抗体其自身所带1 2倍数量酶标分子能参与信号 示踪这一局限。该胶体金复合酶标记抗体虽有更高的灵敏性，但是仍以制备好的传统酶标 抗体为基础，并没变传统意义上抗体与酶的偶联过程。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种制备酶标记抗体的方法，能以未经偶联的 抗体和酶为基础，结合纳米材料(胶体金)制备高灵敏度的新一代酶标记胶体金复合抗体。 为此，本发明采用以下技术方案它将胶体金溶液浓缩，然后将浓缩后的胶体金溶液的PH 调到略高于用于标记的酶的等电点的PH，将用于标记的酶的水溶液加入胶体金溶液后混 勻，再通过双功能试剂将抗体连接到胶体金表面的酶分子上，经离心后即制得酶标记金胶 复合抗体。Merkoci课题组制备的酶标记金胶复合抗体不仅需以现成的酶标抗体为基础，还 需使用较高终浓度的酶标记抗体(8 9μ g/mL)来饱和胶体金表面以使胶体稳定，这无疑 增大了酶标记抗体的耗费量。目前，市售的大部分抗体的价格是等质量酶价格的数十到上 百倍，考虑到酶相对低的成本，本发明的核心思路是在保证抗体捕捉抗原的能力(即抗体的 量)不受影响的情况下，通过胶体金为载体来增大用于信号示踪的酶标分子的量。首先将 胶体金溶液浓缩(通过离心后加少量水重溶)以增大单位体积溶液内胶体金可以用于吸附 蛋白的总的表面积；将胶体金溶液的PH调到略高于酶的等电点，将酶加入后混勻，便可以 以简捷的直接吸附在金胶表面包满一层酶分子，一方面可以为后续步骤获得充足的酶标分 子，另一方面可以使金胶溶液稳定。再通过双功能试剂将抗体连接到胶体金表面的酶分子 上，经离心后即制得酶标记胶体金复合抗体。在采用上述技术方案的基础上，本发明还可采用以下进一步的技术方案
所述用于标记的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。所采用胶体金粒子的直径范围在18 60nm之间；
所述略高于用于标记的酶的等电点的PH为高于用于标记的酶的等电点0. 4-0. 6个单 位的pH。所述双功能试剂为戊二醛或N，N' - 二琥珀酰亚胺碳酸酯。所述方法包括制备用于标记的酶溶液的步骤，它将用于标记的酶用水配成0. 1 2mg/mL的澄清溶液，所述用于标记的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡 萄糖氧化酶；
所述方法还包括制备胶体金溶液的步骤，所述胶体金溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸的 方法来制备；
所述方法还包括以下步骤
(1)将所制备的胶体金溶液浓缩至原浓度的2倍，将浓缩过的胶体金溶液的pH值调节到适合标记酶的最佳PH范围，即高出用于标记的酶的等电点约0. 4-0. 6个单位的pH，然后 将该胶体金溶液与所述用于标记的酶溶液进行混合，在室温或4° C条件下混合lh。随后 将混合液于15000g 4° C下离心15min，吸走上清液后加入等体积的磷酸盐缓冲液重新溶 解，所述磷酸盐缓冲液的PH =7. 4，即得到标记有酶的胶体金溶液；
(2)将步骤(1)所得溶液中加入双功能试剂，所述双功能试剂选自如戊二醛或 N, N’ - 二琥珀酰亚胺碳酸酯，使标记在胶体金上的酶经双功能试剂活化后修饰上功能基团； 随后将反应液在15000g和4° C下进行离心，离心后吸走上清液并加入等体积的磷酸盐缓 冲液重新溶解，所述磷酸盐缓冲液的PH =7. 4，此离心步骤重复进行以去除未参与反应的多 余双功能试剂；
(3)往步骤⑵所得的产物中加入抗体，抗体的最终浓度为5 50μ g/mL，混勻后过夜 反应，使抗体连接到标记在胶体金上的酶的活化的功能基团上，随即加入封闭剂封闭掉酶 上可能残余的双功能试剂功能基团；然后将产物进行离心后溶于磷酸盐缓冲液中，即制得 以胶体金为载体的酶标记抗体。本发明与现有技术相比，具有以下优点及突出性效果(1)通过直接吸附这种简 捷的方式完成了胶体金上的酶标记；(2)之后的双功能试剂两步法中，酶和偶联剂的分离 以及抗体连接后的分离纯化无需引入凝胶过滤、透析或亲和层析等繁琐且高损耗的昂贵步 骤，只需通过简单的离心即可完成，因为连接上的胶体金粒子可以很轻易的离心下来(如在 15000g的条件下);(3)胶体金吸附酶前进行的浓缩操作可以提高被连接试剂(酶和抗体)的 连接量，同时可以增加酶标记胶体金复合抗体中金胶粒子的浓度；(4)酶分子要比传统的 酶标记抗体分子直径要小，单位面积的胶体金表面可以吸附更多的酶分子来作为信号示踪 分子；(5)所获得的酶标记胶体金复合抗体仍能和Merkoci课题组制备的酶标记胶体金复 合抗体一样具有较传统酶标抗体的信号放大能力，第(3)和(4)点的效果更提升了这种信 号放大能力。(6)酶标记胶体金复合抗体仍保有胶体金的酒红色，可以作为操作中是否加入 酶标抗体的指示，可以省去商业化酶标抗体中加入有色染料来作为指示这一步骤。(7)吸附 有蛋白的胶体金易于保存，在的4° C无菌环境下可以稳定保存一年以上。酶标记金胶复合 抗体同样符合这一特征。
图1是本发明制备过程的示意图。
具体实施例方式如图1所示，一种酶标记胶体金复合抗体，包括胶体金粒子1、酶分子2、双功能试 剂分子3、抗体4。以下采用本发明方法制备系列酶标记胶体金复合抗体。
实施例1
取2. 5mL 1%的柠檬酸钠水溶液加入到煮沸的IOOmL含0. 01%的氯金酸溶液中，并同时 进行磁力搅拌使之混合均勻。反应一段时间后，溶液由黄变蓝，最终变成酒红色，停止加热 并在磁搅拌的条件下直至冷却，即制得直径约为18nm的胶体金。4/4页取一定体积的胶体金溶液，在15000g和4° C条件下离心15min后吸走上清 液，并用原体积一半的去离子水重新溶解。用0.2M K2CO3将浓缩后的胶体金pH值调至约 8. 2-8. 5之间，随后加入一定浓度的辣根过氧化物酶(HRP，等电点PI =7. 2 8.0)，使HRP 最终浓度为50 μ g/mL。在室温或4° C下旋转混合1 一 2小时，随后将反应液在15000g和 4° C下进行离心，离心后吸走上清液并加入等体积的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)重新溶解。再 往该标记有酶的胶体金溶液中加入戊二醛(戊二醛在溶液中的最终浓度0.洲)，混勻后在旋 转混合器上反应2小时。随后按之前的离心步骤重复两次。产物中加入抗体(抗体在溶液中的最终浓度10 μ g/mL)，混勻后在旋转混合器上过 夜反应；之后加入与原反应液等体积的IM甘氨酸反应2小时。然后将产物进行离心后溶于 磷酸盐缓冲液中，即制得以胶体金为载体的酶标记抗体。随后将反应液在15000g和4° C 下进行离心，离心后吸走上清液并加入等体积的磷酸盐缓冲液(PH 7. 4)重新溶解，此离心 步骤重复两次，即制得酶标记胶体金复合抗体。
实施例2
取1. 5mL 1%的柠檬酸钠水溶液加入到煮沸的IOOmL含0. 01%的氯金酸溶液中，按实施 例1中步骤可制得直径约为25nm的胶体金。同实施例1中步骤将胶体金浓缩后用0. IM盐酸调pH值至5左右，随后加入一定 浓度的碱性磷酸酶(AP，等电点PI =4.5)，使AP最终浓度为50 μ g/mL。除了双功能试剂 采用N，N' - 二琥珀酰亚胺碳酸酯(N，N' - 二琥珀酰亚胺碳酸酯在溶液中的最终浓度0. 2%到 1%)，余下步骤同实施例1。
实施例3
取1. 2mL 1%的柠檬酸钠水溶液加入到煮沸的IOOmL含0. 01%的氯金酸溶液中，按例1 中步骤可制得直径约为40nm的胶体金。同实施例1中步骤将胶体金浓缩后用0. IM盐酸调pH值至5左右，随后加入一定 浓度的半乳糖苷酶(β "Gal,等电点PI =4. 6)，使β -Gal最终浓度为100 μ g/mL。余下步 骤同实施例1，除了把加入的抗体的最终浓度改为50 μ g/mL。 实施例4
同实施例1制成18nm的胶体金，将胶体金浓缩后用0. IM盐酸调pH值至5左右，随后 加入一定浓度的葡萄糖氧化酶(GO，PI=4.4),使GO最终浓度为50 μ g/mL，余下的步骤都 同实施例1。
权利要求
1.一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于它将胶体金溶液浓缩，然后将浓缩后的胶 体金溶液的PH调到略高于用于标记的酶的等电点的pH，将用于标记的酶的水溶液加入胶 体金溶液后混勻，再通过双功能试剂将抗体连接到胶体金表面的酶分子上，经离心后即制 得酶标记金胶复合抗体。
2.如权利要求1所述的一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于所述用于标记的酶包 括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。
3.如权利要求1所述的一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于所采用胶体金粒子的 直径范围在18 60nm之间。
4.如权利要求1、2或3所述的一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于所述略高于用 于标记的酶的等电点的PH为高于用于标记的酶的等电点0. 4-0. 6个单位的pH。
5.如权利要求1所述的一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于所述双功能试剂为戊 二醛或N，N' - 二琥珀酰亚胺碳酸酯。
6.如权利要求1所述的一种制备酶标记抗体的方法，其特征在于所述方法包括制备用 于标记的酶溶液的步骤，它将用于标记的酶用水配成0. 1 ang/mL的澄清溶液，所述用于 标记的酶包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶；所述方法还包括制备胶体金溶液的步骤，所述胶体金溶液通过柠檬酸钠还原氯金酸的 方法来制备；所述方法还包括以下步骤(1)将所制备的胶体金溶液浓缩至原浓度的2倍，将浓缩过的胶体金溶液的pH值调节 到适合标记酶的最佳PH范围，即高出用于标记的酶的等电点约0. 4-0. 6个单位的pH，然后 将该胶体金溶液与所述用于标记的酶溶液进行混合，在室温或4° C条件下混合Ih ；随后将混合液于15000g 4° C下离心15min，吸走上清液后加入等体积的磷酸盐缓冲 液重新溶解，所述磷酸盐缓冲液的PH =7. 4，即得到标记有酶的胶体金溶液；(2)将步骤(1)所得溶液中加入双功能试剂，所述双功能试剂选自如戊二醛或 N, N' - 二琥珀酰亚胺碳酸酯，使标记在胶体金上的酶经双功能试剂活化后修饰上功能基团； 随后将反应液在15000g 4° C下进行离心，离心后吸走上清液并加入等体积的磷酸盐缓冲 液重新溶解，所述磷酸盐缓冲液的PH =7. 4，此离心步骤重复进行以去除未参与反应的多余 双功能试剂；(3)往步骤(2)所得的产物中加入抗体，抗体的最终浓度为5 50μ g/mL，混勻后过 夜反应，使抗体连接到标记在胶体金上的酶的活化的功能基团上，随即加入封闭剂封闭掉 酶上可能残余的双功能试剂功能基团；然后将产物进行离心后溶于磷酸盐缓冲液中，即制 得以胶体金为载体的酶标记抗体。
全文摘要
本发明提供一种制备酶标记抗体的方法，它将胶体金溶液浓缩，然后将浓缩后的胶体金溶液的pH调到略高于用于标记的酶的等电点的pH，将用于标记的酶的水溶液加入胶体金溶液后混匀，再通过双功能试剂将抗体连接到胶体金表面的酶分子上，经离心后即制得酶标记金胶复合抗体。本发明通过直接吸附的简捷方式完成胶体金上的酶标记；酶和偶联剂的分离以及抗体连接后的分离纯化无需引入凝胶过滤、透析或亲和层析等繁琐且高损耗的昂贵步骤，只需通过简单的离心即可完成；胶体金吸附酶前进行的浓缩操作可以提高被连接试剂的连接量，同时可以增加酶标记胶体金复合抗体中金胶粒子的浓度酶标记金胶复合抗体同样符合这一特征。
文档编号G01N33/532GK102141567SQ20101059430
公开日2011年8月3日 申请日期2010年12月19日 优先权日2010年12月19日
发明者吴坚, 应义斌, 李冬阳 申请人:浙江大学