一种快速定量检测d-二聚体的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验领域，具体设及一种快速定量检测D-二聚体的均相巧光免 疫试剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 在血凝过程中，纤维蛋白原在凝血酶的作用下，释放出肤A、肤B后，生成纤维蛋白 单体（FM)，FM在巧离子及xIII因子的作用下，形成交联纤维蛋白，其在纤溶酶的作用下发生 降解，降解产物之一就是D-二聚体值-dimer,孤）。它是交联纤维蛋白的特异性降解产物， 血液中D-二聚体升高，说明有纤维蛋白的形成和降解，有继发纤溶的发生。DD的含量变化 可W作为体内高凝状态、血栓形成和纤溶亢进的分子标志物之一。DD反映出的特异性并不 是指在某一种特定的具体疾病中的表现，而是针对有凝血和纤溶过程的该一大类疾病的共 同病理特点。大量研究表明，静脉血栓栓塞病人、肺栓塞病人及深静脉栓塞的病人，体内循 环的D-二聚体含量明显增加。
[000引 D-二聚体在临床检验中应用的十分广泛。研究表明，发生弥漫性内出血值1C)时， 由于广泛的微血栓形成，W及继发性纤溶亢进，导致D-Dimer水平显著增高，其敏感性和特 异性显著高于血小板计数、纤维蛋白原定量、纤维蛋白（原）降解产物（FD巧等筛选检测试 验。急性屯、肌梗死及脑血栓患者急性发病时血浆D-Dimer水平明显增高，D-Dimer检测不 仅可作为观察屯、肌梗死病情的一项指标，而且也是观察溶栓治疗的一种理想检测方法。深 静脉血栓值VT)形成时几乎所有的DVT患者D-Dimer呈阳性，血浆D-Dimer阴性可W基本 排除DVT可能。D-Dimer可反映血栓大小的变化，因此可作为溶栓治疗和肝素抗凝的用药指 导及疗效观察：治疗期间持续较高，说明治疗无效；含量再升高，预示血栓再发生。继发性 纤溶亢进时，D-Dimer水平显著增高，原发性纤溶症时，D-Dimer不增高。陈旧性血栓形成 时，D-Dimer不增高。正常妊娠后期的生理性高凝状态下，D-Dimer水平增高，孕妇血浆D-二聚体水平明显高于非孕妇女（p<0. 05)，但低于妊高征孕妇（p<0. 05)，测定血浆D-二聚 体含量对妊高征患者高凝状态的诊断、疗效检测和预后判定有重要意义。组织损伤后对凝 血系统的激活可使D-Dimer水平显著增高，另外，除组织损伤可W导致出现血栓形成趋势 夕F，如果患者自身存在遗传性抗凝缺陷，或者存在风险因素的情况下，易发生静脉血栓，导 致D-Dimer水平显著增高。
[0004]目前临床检测D-二聚体的方法有自身红细胞凝集法、乳胶凝集法、酶联免疫吸附 法巧LISA)、基于酶免疫法的巧光抗体检测法和免疫金标法。自身红细胞凝集法为半定量方 法，其优点是可在全血中检测，省略了离屯、制备血浆的步骤。乳胶凝集法用于定性或根据其 稀释度半定量测定标本中的D-二聚体的含量。酶联免疫吸附法巧LISA)检测D-二聚体不 受胆红素、血红蛋白、纤维蛋白原、FDP干扰，因此更精确，敏感性更高。但操作要求严格费 时，每次均需同时做标准曲线，不适于单个标本的测定。巧光抗体检测法是目前研究最多的 一种检测方法，敏感性很高，与经典化ISA法有很好的一致性，但需要在专用的免疫分析仪 上进行，设备成本昂贵。免疫金标法通过肉眼观察或用折射仪读数。与提供的标准色价或者 测定标准品的折射读数，可计算出标本中D-二聚体的含量。该法既具有胶乳凝集法的操作 简单、快速，适用于急诊测定的优点，不受胆红素，化、纤维蛋白原、可溶性的纤维蛋白及FDP 等干扰，但对类风湿因子、肝素及脂血等有一定的干扰。
[0005] 均相巧光分析法化omogeneous f luoroimmunoassay, HFIA)是在时间分辨巧光免 疫分析（time-resolued fluoroimmunoassay, TRFIA)技术的基础上形成的一种新的巧光免 疫分析技术。TRFIA技术采用的巧光物质与传统的巧光染料完全不同，采用的是铜系元素 館巧U)、得（Tb)等作为巧光材料，灵敏度非常高，稳定性好，低温条件可保存=年，因而成 为二十一世纪最热口的免疫分析技术。
[0006] 均相巧光免疫检测法是用同一抗原的两个抗体分别标记化和巧光染料 Alexa647。化标记抗体在游离状态时，受到340nm光线激发，只发射平均波长为615nm 巧光，而在抗原、抗体复合物形成时，发生能量传递，激发巧光染料Alexa647发射出665nm 巧光。标记抗体直接与待测样品进行抗原、抗体反应，如果能形成抗原、抗体复合物，则在 665nm出可测得巧光信号。该种方法省却了酶联免疫法反复解育和洗板等烦琐操作步骤，几 分钟就能获得结果，省时省力。并且，此法也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境 等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。此外，Eu 3+和 Alexa647该对巧光物质的最大发射光波长之间相差较大，未发生抗原抗体反应的本底巧光 值就非常低。而人血清中非特异性物质产生的300?500nm巧光，不能激发Alexa647发射 巧光信号650nm激发光。因此非特异性巧光非常低。
[0007] 本发明采用均相巧光免疫快速检测技术，利用巧光的高灵敏特点，同样也避免了 胶体金或者巧光D-Dimer干式免疫试纸中的硝酸纤维素膜本身孔隙不均一特性对检测准 确度和重复性的不良影响。由于均相巧光免疫检测中样品与巧光标记抗体全过程都在液相 中全面接触，反应充分，因此可大幅度提高检测灵敏度和线性范围，同时反应在液相进行也 增加了样品的稀释倍数，消除了样品的基质效应影响，使定量结果有很好的可重复性，提高 了定量结果的精密度和准确度，可满足临床诊断大规模检测的要求。
【发明内容】
[000引本发明的目的在于克服现有D-Dimer检测技术的不足，提供一种快速定量检测 D-Dimer的均相巧光免疫试剂组。本发明根据巧光免疫技术特点和D-Dimer抗原抗体系统 特点，设计新的原材料，试剂和工艺流程，应用本发明提供的试剂组检测D-Dimer水平，具 有简单，快速，灵敏和特异性好等特点，可同时定量检测高值和低值样品，并且性价比高，适 用于临床快速检测。
[0009] 本发明的第一个方面是提供一种快速定量检测D-二聚体的均相巧光免疫试剂 组，包括稀±元素馨合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体（anti-孤）、近红外巧光化合物标 记的抗D-二聚体单克隆抗体和系列浓度的D-二聚体校准品。
[0010] 优选地，稀上元素馨合物为化馨合物。
[0011] 更优选地，稀±元素馨合物为BH肥T-化或1，2-二（1"，1"，1"，2"，2"，3"，3"-走 氣-4"，6"-己二酬-6"-基-对节基）-4-氯横酷基苯与館（III)的配合物炬HHBCB-Eu 3+)。
[0012] 优选地，所述近红外巧光化合物为Alexa系列近红外巧光化合物、DyLi曲t系列近 红外巧光化合物和CF系列近红外巧光化合物中的至少一种。
[0013] 更优选地，所述近红外巧光化合物Alexa647、DyLi曲t-DY647和CF647中的至少一 种。
[0014] 优选地，所述系列浓度的D-二聚体校准品由校准品稀释液稀释D-二聚体配 制而成，所述校准品稀释液为含0. 01-0. 5wt %阳G800、l-5wt % BSA、5-20wt %甘油、 0. 01-0. 05wt%表面活性剂的Tris缓冲液。
[0015] D-二聚体校准品可用塑料瓶密封包装。
[0016] 本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的均相巧光免疫试剂组的制 备方法，包括W下步骤：
[0017] 1)稀±元素馨合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体的制备：
[00化]取0. 5-5mg/ml的抗D-二聚体单克隆抗体溶液，加入0. 05-0. 5mol/L的Na肥〇3 溶液后，调抑至8. 5-10,滴加10-100 y g/ml配体化合物溶液，揽拌反应0. 6-化，分离 得到配体化合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体，加入终浓度为0. 05-0. 5wt %的BSA和 0. 01-lwt %的NaNs，调抑至5. 5-6. 5,免疫分析前，加入Eu3+溶液，使配体化合物与化等 摩尔浓度，即得，其中，抗D-二聚体单克隆抗体溶液、NaHC〇3溶液和配体化合物溶液的体积 比为 0. 1-1 : 1 : 0.01-0. 05 ;
[0019] 2)近红外巧光化合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体的制备：
[0020] 将抗D-二聚体单克隆抗体用0. 05-0. 5mol/L的Na肥〇3溶液稀释至0. 5-5mg/ml， 加入近红外巧光化合物溶解液，揽匀，室温解育0. 5-化，分离得到近红外巧光化合物标记的 抗D-二聚体单克隆抗体；
[002U 3)系列浓度的D-二聚体校准品的制备；
[0022] 将D-二聚体用校准品稀释液稀释配制成系列浓度，即得，
[0023] 其中，1)、2)和3)的顺序可W任意颠倒。
[0024] 其中，稀±元素馨合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体用于免疫分析时，用标记物 稀释液稀释使用，2-8 °C分装保存。
[0025] 其中，近红外巧光化合物标记的抗D-二聚体单克隆抗体用磯酸盐缓冲液稀释， 2-6 °C保存。
[0026] 其中，D-二聚体校准品2-6°C保存。
[0027] 优选地，抗D-二聚体单克隆抗体在于配体化合物反应之前，先进行透析处理。
[0028] 优选地，步骤1)中配体化合物为BHHCT或BHHBCB。
[0029] 优选地，步骤1)中分离得到配体化合物标记的anti-D-Dimer通过离屯、和柱层析 方式进行。柱层析采用Se地adexG-50柱，0. 01-0. Imol/L畑4肥〇3(P服.0)洗脱。
[0030] 优选地，步骤2)中，分离得到近红外巧光化合物标记的anti-D-Dimer通过柱层析 的方式进行。
[0031] 进一步优选地，步骤2)中，柱层析采用G25凝胶柱。
[003引优选地，步骤2)中，室温解育时，每隔10-20min混匀一次。
[0033] 本发明的均相巧光免疫试剂的使用；先将稀±元素馨合物标记的anti-D-Dimer 溶液加入反应微孔中，再加入近红外巧光化合物标记的anti-D-Dimer溶液，最后分别加入 D-Dimer校准品和临床检测样品，37°C反应20分钟后，用均相巧光免疫分析仪检测判读结 果。
[0034] 本发明提供的快速定量检测D-二聚体的均相巧光免疫试剂组，其反应原理为双 抗体夹屯、法的均相巧光免疫法。待测样品与适当比例的稀上元素（例如化 3+)和巧光标记 抗体在液相均质介质中充分混和均匀，在此过程