专利名称：D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条的制作方法
技术领域：
本实用新型属于医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条。
背景技术：
D-二聚体是血液中的纤维蛋白原受凝血酶等作用而凝固形成的聚合物，是交联纤维蛋白的特异性降解产物。在生理状态下，人体正常D- 二聚体的水平一般在200 μ g/L以下，机体保持着凝血与纤溶动态平衡，以保证纤维蛋白及时形成和清除。如果这一平衡遭到破坏，血管内凝血倾向增强，纤维蛋白聚集，纤维蛋白降解产物增加，D-二聚体含量增力口。因此，D-二聚体水平的升高反映体内凝血和纤溶系统的双重激活，可作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。D- 二聚体含量升高可检测多种疾病的病程，如深静脉血 栓(DVT)、弥漫性血管内凝血(DIC)、心肌梗死、重症肝炎、肺栓塞(PE)等疾病。因此血液中D-二聚体含量检测有助于血栓前状态及血栓形成性疾病的诊断，疗效观察及预后判断。目前，D-二聚体检测方法主要有乳胶凝集法、酶联免疫吸附(ELISA)法、荧光抗体检测法、免疫金标法和胶乳免疫比浊法等。胶乳凝集法只能定性检测，不能测定血浆中D-二聚体含量的变化。酶联免疫法操作容易受到酶活性变化的影响，结果不太准确。免疫胶体金法容易受类风湿因子、肝素及血脂的影响，结果准确性差。胶乳比浊法反应特异性不好，所需试剂比较复杂。基于荧光标记技术的免疫层析能够准确定量检测样品中D-二聚体的含量，同时灵敏度高。同时，本实用新型对传统试纸条结构进行改造，在原来样品垫基础上增加了一层样品垫，有效过滤了样品中残余的血红细胞，使得检测结果更加准确可靠。
发明内容本实用新型的目的是提供一种操作简便、准确度高、灵敏度高、成本低和能进行定量检测D- 二聚体的荧光免疫定量测定试纸条。本实用新型的技术方案为一种D- 二聚体荧光免疫定量测定试纸条，在底衬上依次搭接地粘贴两层样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的抗D- 二聚体抗体A，所述的硝酸纤维素膜上包被有抗D- 二聚体抗体B为检测线和兔抗鼠IgG抗体作为质控线。所述胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。所述的荧光胶乳微球是由胶乳微球吸附荧光标记的链霉亲和素制备得到。所述荧光为直接荧光物质，优选异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。所述结合垫材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。所述两层样品垫的材质至少有一种是全血滤膜。实验结果证实，本实用新型的试纸条能够准确定量检测人血浆中D- 二聚体含量，具有操作简便、准确度高、灵敏度高、成本低等特点。
图I为本实用新型D- 二聚体荧光免疫定量测定试纸条结构示意图；图2为本实用新型实施例I所制备的试纸条的校准曲线；图3为本实用新型实施例I所制备的试纸条的线性范围相关性；图4为本实用新型实施例I所制备的试纸条与德国Siemens公司D- 二聚体试剂盒检测结果相关性比较；其中，图I :1、底衬；2、第一层样品垫；3、第二层样品垫；4、结合垫；5、硝酸纤维素膜；6、吸水纸；7、检测线；8、质控线。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式
对本实用新型作进一步详细的说明。D- 二聚体荧光免疫定量测定试纸条，在底衬上依次搭接地样品垫2、3，结合垫4，硝酸纤维素膜5和吸水纸6，所述结合垫4上喷涂有荧光胶乳微球标记的抗D- 二聚体单克隆抗体Ml，所述硝酸纤维素膜5上有包被抗D- 二聚体单克隆抗体M2为检测线7和兔抗鼠IgG抗体作为质控线8。以上抗体均购自罗氏公司。上述硝酸纤维素膜上检测7线还可以是包被抗D-二聚体的多克隆抗体，所述多克隆抗体是采用本领域熟练技术人员熟知的常规方法免疫鼠获得抗血清制备而得。进一步所述的胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。所述荧光为自发荧光物质，优选异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。实施例ID- 二聚体荧光免疫定量测定试纸条制备方法如下I)荧光胶乳微球的制备荧光胶乳微球的制备用吸附缓冲液(50mM、pH5. 8的柠檬酸盐缓冲液)稀释粒径为IOOnm胶乳微球至终浓度20mg/ml,体积为5ml,制得胶乳微球悬浮液；添加适量的突光素Cy5标记链霉亲和素(购自上海研晶生物科技有限公司)在吸附缓冲液里，终体积为5ml ;将上述胶乳微球悬浮液加入到上述含有荧光素标记链霉亲和素的吸附缓冲液中，制得混合液；将所得混合液在室温下温浴1-2小时，并不断搅拌，然后离心，收集沉淀，沉淀用储存缓冲液(含有O. 05%BSA的吸附缓冲液)溶解，放置4°C保存，备用。2)生物素化抗D- 二聚体抗体A的制备将抗D-二聚体单克隆抗体Ml用O. lmol/L、pH8. O碳酸氢钠缓冲液稀释至lmg/ml,交互用O. lmol/L、pH8. O碳酸氢钠缓冲液对D- 二聚体抗体Ml充分透析；用Iml DMSO溶解Img的NHSB，得到NHSB溶液；向上述ImlD- 二聚体单克隆抗体Ml溶液加入20 μ I NHSB溶液，室温搅拌2-4小时，继续室温搅拌10分钟，然后用20mM、pH7. 2 PBS缓冲液透析，即得生物素化抗D- 二聚体单克隆抗体Ml。3)荧光胶乳微球标记D- 二聚体抗体A的制备将步骤I)制得的荧光胶乳微球和步骤2)制得的生物素化D- 二聚体抗体Ml混合在一起，反应30分钟后离心，沉淀用用储存缓冲液溶解，恢复至原体积。 4)包被荧光胶乳微球标记D- 二聚体抗体A结合垫4的制备将步骤3)制得的荧光胶乳微球标记抗D- 二聚体抗体Ml，按3. O μ 1/cm3的用量喷在玻璃纤维素膜4上。5)硝酸纤维素膜5的制备a)包被缓冲液的制备将O. 025M、pH7. 4的PBS，用O. 22 μ膜过滤，置于4°C备用，
有效期7天。b)封闭液的制备将含1%BSA, 1%鹿糖，O. 025M、ρΗ7· 5的PBS,用O. 22 μ膜过滤，
置于4°C备用，有效期3天。c) D- 二聚体抗体检测线7的制备将抗D- 二聚体单克隆抗体M2按2mg/ml的浓度，蠕动泵授液量O. 4ml/min,划线速度50m/20min，在干燥箱内20°C鼓风干燥12小时。d)质控线8的制备将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量O. 4ml/min,划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜5上划线，该线与检测线7平行，放入干燥箱内20°C鼓风干燥12小时。e)用上述封闭液将含有检测线7和质控线8的硝酸纤维素膜5于37°C封闭60分钟，取出后置37°C下烘干处理两个小时，封袋备用。6)试纸条组装在底衬I上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、3，玻璃纤维素膜4，硝酸纤维素膜5和吸水纸6得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。实施例2另一种D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条制备方法如下I)突光胶乳微球的制备荧光胶乳微球的制备用吸附缓冲液(50mM、pH5. 8的柠檬酸盐缓冲液)稀释粒径为400nm胶乳微球至终浓度30mg/ml,体积为6ml,制得胶乳微球悬浮液；添加适量的红色荧光素罗丹明标记链霉亲和素(购自上海酶联生物科技有限公司)在吸附缓冲液里，终体积为6ml ;将上述胶乳微球悬浮液加入到上述含有红色荧光素罗丹明标记链霉亲和素的吸附缓冲液中，制得混合液；将所得混合液在室温下温浴1-2小时，并不断搅拌，然后离心，收集沉淀，沉淀用储存缓冲液(含有O. 06%BSA的吸附缓冲液)溶解，放置4°C保存，备用。2)生物素化抗D- 二聚体抗体A的制备将抗D-二聚体单克隆抗体Ml用O. lmol/L、pH8. O碳酸氢钠缓冲液稀释至lmg/ml,交互用O. lmol/L、pH8. O碳酸氢钠缓冲液对D- 二聚体抗体Ml充分透析；用Iml DMSO溶解Img的NHSB，得到NHSB溶液；向上述ImlD- 二聚体单克隆抗体Ml溶液加入25 μ I NHSB溶液，室温搅拌2-4小时，继续室温搅拌10分钟，然后用20mM、pH7. 2 PBS缓冲液透析，即得生物素化抗D- 二聚体单克隆抗体Ml。3)荧光胶乳微球标记D- 二聚体抗体的制备将步骤I)制得的荧光胶乳微球和步骤2)制得的生物素化D- 二聚体抗体Ml混合在一起，反应30分钟后离心，沉淀用用储存缓冲液溶解，恢复至原体积。4)涂覆荧光胶乳微球标记D- 二聚体抗体A结合垫4的制备将步骤3)制得的荧光胶乳微球标记抗D- 二聚体抗体M1，按2 μ 1/cm3的用量喷在聚酯膜4上。5)硝酸纤维素膜5的制备A.包被缓冲液的制备将O. 025M、pH7. 4的PBS，用O. 22 μ膜过滤，置于4°C备用，有效期7天；B.封闭液的制备将含1%BSA, 1%鹿糖，O. 025M、ρΗ7· 5的PBS,用O. 22 μ膜过滤，
置于4°C备用，有效期3天；C. D- 二聚体抗体检测线7的制备将抗D- 二聚体多克隆抗体按3mg/ml的浓度，螺动泵授液量O. 4ml/min,划线速度50m/20min,在干燥箱内20°C鼓风干燥12小时；D.质控线8的制备将兔抗鼠IgG抗体按8mg/ml的浓度，蠕动泵授液量O. 4ml/min,划线速度50m/20min，在硝酸纤维素膜5上划线，该线与检测线7平行，放入干燥箱内 20°C鼓风干燥12小时；E.用上述封闭液将含有检测线7和质控线8的硝酸纤维素膜5于37°C封闭60分钟，取出后置37°C下烘干处理两个小时，封袋备用。6)试纸条组装在底衬I上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、3，聚酯膜4，硝酸纤维素膜5和吸水纸6得到试纸板，按照要求切割成适当宽度的试纸条。实施例3 D- 二聚体荧光免疫定量测定试纸条定量检测3. I绘制标准曲线在按实施例I制备好的D- 二聚体荧光免疫定量测定试纸条样品垫上加入不同浓度D-二聚体抗原标准品(取七个不同浓度，分别为0、0. 1、0. 5、l、2、5、10mg/L，每个浓度设3个重复)，10分钟后，通过南京基蛋生物科技有限公司的荧光免疫定量分析仪GeteinllOO读取检测线7和质控线8信号，实验结果及分析见表I :表I D-二聚体标准品检测结果
樣暮=I ° U 叫十卜卜
*J* I Il OS 26*19 H9.23. 512.41 I 311 22 +2的f, Iα """--"Ι"""1"1--
信 I O, OlI . 12150,252ft, 5δ573. 561320.45 2δ6Ι. 12
号
I O. 0326. 5149. Π2§1.93572. S，I 320, 86 2661. U
Metn [\ O32 , 92149, 15291.90572, W1120, |4 I 2661,64
SD__O. mI O. IfO. SIO. 33O. 5 O. 3f O. 4 以D- 二聚体抗原标准品浓度与测定的信号平均值绘制标准曲线，如图2所示。3. 2检测线性范围采用本实用新型实施例I制备的试纸条，做检测线性范围实验。取D- 二聚体标准品，用生理盐水稀释成8个浓度，其浓度范围是O. lmg/L-10mg/L,每个浓度重复测定3次，将测定浓度的平局值与理论浓度进行线性回归分析，计算回归方程y = 1.0183x + 0.0313，相关系数r=0. 99995，表明本实用新型试纸条在O. lmg/L_10mg/L线性范围内相关性很好(见附图3)。3· 3灵敏度(最低检测限)以5%人血清白蛋白为空白样本，用本实用新型实施例I制备的试纸条进行测定，重复20次，计算结果均值为O. 021，标准差SD为O. 036，根据以空白均值加两倍标准差报告方法计算荧光免疫定量分析仪GeteinllOO测定读数变化量为0.093。用稀释后浓度分别为O. 05mg/L、0. lmg/L和O. 15mg/L D- 二聚体标准品溶液测定荧光免疫定量分析仪GeteinllOO测定读数变化值分别为O. 045,0. 098,0. 112，因此本实用新型实施例I制备的试纸条检测D- 二聚体灵敏度为O. lmg/L ο3.4重复性和准确性配制O. 5mg/L和I. Omg/L的D- 二聚体标准品溶液，采用本实用新型实施例I制备的试纸条进行测定，各浓度分别重复测定5次，分别计算测定均值和标准差。计算变异系数进行重复性考察，结果显示变异系数分别为4. 10%和3. 97% ;以(I-均值/标准值)X 100%计算相对偏差进行准确度考察，相对偏差分别为I. 2%和4%。表2重复性和准确性实验
权利要求1.一种D- 二聚体荧光免疫定量测定试纸条，在底衬(I)上依次搭接地粘贴样品垫(2、3)，结合垫(4 )，硝酸纤维素膜(5 )和吸水纸(6 )，其特征在于所述的结合垫(4 )上包被有荧光胶乳微球标记的抗D- 二聚体抗体A，所述的硝酸纤维素膜(5)上包被有抗D- 二聚体抗体B为检测线(7)和兔抗鼠IgG抗体作为质控线(8)。
2.根据权利要求I所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，其特征在于所述胶乳微球粒径范围为50nm-500nm。
3.根据权利要求I所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，其特征在于所述的荧光胶乳微球是由胶乳微球吸附荧光标记的链霉亲和素制备得到。
4.根据权利要求3所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，其特征在于所述的荧光为直接荧光物质，为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、荧光素Cy5中的一种。
5.根据权利要求I所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，其特征在于所述结合垫(4)材质为玻璃纤维素膜或聚酯膜。
6.根据权利要求I所述的D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，其特征在于所述样品垫(2)和样品垫(3)的材质至少有一种是全血滤膜。
专利摘要本实用新型涉及一种D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条，在底衬上依次搭接地粘贴两层样品垫，结合垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的结合垫上包被有荧光胶乳微球标记的抗D-二聚体抗体A，所述的硝酸纤维素膜上包被有抗D-二聚体抗体B为检测线和兔抗鼠IgG抗体作为质控线。本实用新型的试纸条能够准确定量检测人血浆中D-二聚体含量，具有操作简便、准确度高、灵敏度高、成本低等特点。
文档编号G01N33/577GK202631543SQ20122030106
公开日2012年12月26日 申请日期2012年6月26日 优先权日2012年6月26日
发明者苏恩本, 黄力, 陈伟, 涂策, 沈小娟 申请人:南京基蛋生物科技有限公司