一种ca15-3检测试剂盒及其应用
【专利说明】
(一)
技术领域
[0001]本发明涉及一种半定量检测血液中乳腺癌相关抗原CA15-3的基于金磁颗粒的免疫层析检测试剂盒及其应用。
(二)
【背景技术】
[0002]CA 15-3是一种乳腺癌相关抗原，分子量约为400kD。1984年Hikens等从人乳脂肪球膜上糖蛋白MAM-6制成的小鼠单克隆抗体(115-DB)以及1984年KuFu等自肝转移乳腺癌细胞膜制成单克隆抗体(DF-3)，这两种抗体均能识别同一种抗原，这种抗原即为抗原CA15-3。乳腺癌患者常常伴随CA15-3的升高，但在乳腺癌初期患者敏感性较低，转移性乳腺癌阳性率可达80%。发现癌症转移的敏感性比癌胚抗原和组织多肽抗原高，且早于临床发现转移。CA15-3可以作为原发性乳腺癌的辅助诊断指标，也可以作为手术后随访，检测肿瘤复发，转移的指标。血清中CA15-3水平增高，提示乳腺癌的局部或全身复发，且增高早于核素检查和临床检查。除乳腺癌以外，其他肿瘤如肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、良性乳腺疾病等均可出现血清CA15-3的增高，非恶性肿瘤一般阳性率低于10%。
[0003]目前的血液中CA15-3的诊断技术主要包括:放射性免疫分析(RIA)、酶联免疫分析(ELISA)、化学发光免疫分析(CLIA)、时间分辨荧光免疫分析、胶体金免疫层析等方法，但这些方法都有各自的特点及不足:放射性免疫分析是临床较为常用的方法，优点是结果较准确，线性范围较宽，缺点是操作繁琐，耗时长，且放射性标记物会对操作者产生危害，并且会产生环境污染，目前用的较少。ELISA和化学发光及时间分辨荧光免疫分析目前已经实现自动化、大批量、定量检测，但是方法见结果差异大，线性范围较窄。同时，目前自动化监测仪器被国外大厂商垄断，仪器设备昂贵，且不适合单人份和小批量检测用，基层医院及诊所应用受到限制。近年来发展较快的胶体金免疫层析技术检测CA15-3的试剂盒已经研制成功，其快速，便捷，单人份操作的优势促使其被广泛使用，但其缺点是由单纯的胶体金标记的免疫层析试纸条检测的结果灵敏度较低。由于在癌症发展或者转移初期，患者体内CA15-3含量较低，这就导致部分体内CA15-3含量高于正常值而低于检测线的患者出现假阴性的检测结果，因此实际上，该方法被应用于肿瘤临床检测并不广泛。
[0004]基于金磁颗粒的免疫层析技术，是近年来新出现的一门新的检测技术。其原理主要是由于其表面负载了大量的金颗粒，大大增加了金磁颗粒的比表面积，提高了金磁颗粒表面的抗体偶联量，进而达到降低检测线，提高其灵敏度的目的。同时，通过调节金颗粒本身粒径及其在单个微球上的负载量，可进一步调节抗原检测线。2009年，D.Tang等最早将该技术用于黄曲霉毒素B2的检测，其检测线比单纯金标记的试纸条降低了 3倍。本发明主要通过制备这种基于金磁颗粒免疫层析诊断试剂盒，并应用于乳腺癌标记物CA15-3的检测，实现拓展该技术在肿瘤检测领域应用的目的。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明目的是从提高检测灵敏度出发，提供一种既方便又快速的CA15-3基于金磁颗粒的免疫层析检测试剂盒，灵敏度提高了 2倍。
[0006]本发明采用的技术方案是:
[0007]本发明提供一种CA15-3检测试剂盒，所述检测试剂盒包括测试条和检测液，所述测试条为镶嵌在支撑板内的金磁颗粒免疫层析测试条，所述的金磁颗粒免疫层析测试条由硝酸纤维素膜和吸水垫连接而成，所述的硝酸纤维素膜上依次设有点样区、包被有CA15-3抗体的检测条带(T线，检测线)和包被有兔抗鼠IgG抗体对照条带(C线，质控线)，并分别形成点样区、CA15-3检测条带(T线，检测线)和兔抗鼠IgG抗体对照条带(C线，质控线)，所述吸水垫连接在硝酸纤维素膜远离检测条带的一端(即吸水垫连接在靠近硝酸纤维素膜对照条带的一端)；所述检测液为金磁颗粒混悬液，所述金磁颗粒混悬液是将包被有CA15-3单克隆抗体的金磁颗粒用牛血清白蛋白封闭后，混悬于含表面活性剂、蔗糖和氯化钠的缓冲液中而获得；所述缓冲液中表面活性剂的体积终浓度为0.1?10% (优选8% )，所述蔗糖的质量终浓度为0.1?2g/L缓冲液(优选1% )，所述氯化钠的质量终浓度为0.1?2g/L缓冲液(优选1.2g/L缓冲液)；所述金磁颗粒是由Fe3O4粉末和氯化金制备的粒径为50nm?I μ m的颗粒(优选10nm?800nm)，所述缓冲液中金磁颗粒的OD52tl =1_3 ο
[0008]进一步，所述金磁颗粒免疫层析测试条上方还覆盖有一开有加样孔和视窗的盖板，所述的视窗与检测条带和对照条带配合，所述加样孔与点样区配合，即硝酸纤维素膜点样区上方为加样孔，T线和C线上方为视窗，优选长方形视窗。所述支撑板上设有卡槽，所述盖板设有与卡槽配合连接的卡扣。
[0009]进一步，所述硝酸纤维素膜远离检测条带的一端置于吸水垫下方，部分重叠连接，所述重叠部分的长度为l_3mm(优选2mm)。本发明所述T线和C线间隔0.5cm。本发明所述测试条靠近T线的一端还可以跟吸水垫连接，并在吸水垫上设置点样区，即硝酸纤维素膜的靠近T线端和靠近C线端均可以连接有吸水垫。
[0010]进一步，所述表面活性剂为Tween-80。
[0011]进一步，本发明所述金磁颗粒混悬液按如下方法制备为:(I)磁性粒子的制备:将壳聚糖通过反相悬浮聚合法包裹纳米Fe3O4粒子；
[0012](2)金磁颗粒的制备:取步骤⑴制备的磁性粒子超声分散于ddH20中，再加入质量浓度I %氯化金水溶液和质量浓度I %柠檬酸三钠水溶液，煮沸10分钟，永磁铁分离，缓冲液洗涤，获得金磁颗粒；所述氯化金水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33.3ml/g，所述柠檬酸三钠水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33?84ml/g ；
[0013](3)金磁颗粒混悬液的制备:取步骤⑵制备的金磁颗粒用含鹿糖的pH = 9.0，0.05M硼酸-硼砂缓冲液悬浮，加入0.5mg/mL的CA15-3单克隆抗体，室温孵育30分钟，再加入1%的牛血清白蛋白封闭30分钟；然后加入质量浓度10%氯化钠水溶液和Tween-80的混合液，继续反应30分钟，充分混匀，然后加质量浓度为1%聚乙二醇水溶液，即获得金磁颗粒混悬液；所述金磁颗粒质量用量以缓冲液体积计为3mg/ml，所述缓冲液中Tween-80的体积终浓度为0.1?10%，所述蔗糖的质量终浓度为0.1?2g/L缓冲液，所述氯化钠水溶液中氯化钠的质量终浓度为0.1?2g/L缓冲液；所述CA15-3单克隆抗体与缓冲液体积比为0.03:1，所述牛血清白蛋白与缓冲液体积比为0.03:1，所述聚乙二醇水溶液与缓冲液体积比为0.01:lo
[0014]更进一步，所述金磁颗粒悬浮液按如下方法制备:(I)磁性粒子的制备:将Fe3O4粉末(优选粒径为I?20nm)超声分散到体积浓度2%乙酸水溶液中，加入壳聚糖粉末，充分搅拌制成水相；取span-80 (山梨糖醇酐油酸醋)加入到液体石錯中，在1000?3000rpm条件下机械搅拌形成油相；将水相缓慢加入油相中，继续搅拌形成油包水小液滴后滴加体积浓度为10%戊二醛水溶液，40°C进行交联(通常反应2h)，反应完全后再用质量浓度10%NaOH水溶液调整pH至pH = 10，继续搅拌均匀(优选2h)，反应液加入2倍体积的石油醚，抽滤，滤饼用石油醚和70°C无水乙醇各洗涤3次，冷冻干燥，获得磁性粒子，粒径为100?800nm ;所述乙酸水溶液的体积用量以Fe3O4粉末质量计为100ml/mg，所述Fe 304粉末与壳聚糖质量比:1:2，所述山梨糖醇酐油酸酯与液体石蜡体积比为1:1500，所述油相体积以Fe3O4粉末质量计为50ml/mg，所述戊二醛溶液的体积用量以Fe3O4粉末质量计为0.67ml/mg ；
[0015](2)金磁颗粒的制备:取步骤⑴制备的磁性粒子，加入ddH20，超声分散5min，加入质量浓度I %氯化金水溶液，加热至沸腾后，迅速加入质量浓度I %柠檬酸三钠水溶液，煮沸10分钟，永磁铁分离，pH = 9.0,0.05M硼酸-硼砂缓冲液洗涤三次，去除洗涤液，获得金磁颗粒，粒径为10?30nm ;所述氯化金水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33.3ml/g，所述柠檬酸三钠水溶液的体积用量以磁性粒子质量计为33?84ml/g ；
[0016](3)金磁颗粒混悬液的制备:取步骤⑵制备的金磁颗粒用含鹿糖的pH = 9.0，0.05M硼酸-硼