用于间接酶联免疫吸附法检测的无害化阳性对照品的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫学检测领域，具体地说，涉及一种用于间接酶联免疫吸附法检测的无害化阳性对照品及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]间接法酶免诊断试剂是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。具体操作是将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。加酶标抗抗体，使固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。最后加入底物显色。
[0003]间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。间接法所采用的阳性对照往往是该检测试剂所测物种该类抗原阳性的血清加工后获得的，有潜在生物危害。在试剂盒生产中阳性对照采用人类或动物病原体感染后的阳性血清经灭活和稀释而制成，这种血清只能来源于病毒感染者，由于需要保持抗体活性，不允许采用灭活效果好的高温高压或化学试剂灭活，所有在制备、运输和使用过程中存在生物安全问题，不仅对直接接触者和环境有风险，而且有人源或动物源病原体感染、传播、扩散的风险，大多数厂家的试剂盒说明书均对该问题进行了强调。
【发明内容】
[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于检测病原体的无害化阳性对照品及其制备方法与应用。
[0005]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测病原体的无害化阳性对照品，其特征在于，由鼠抗包被抗原的抗体和抗鼠IgG的抗体按1:32?2:1的摩尔比混合制成。优选地，鼠抗包被抗原的抗体和抗鼠IgG的抗体按1:4的摩尔比混合制成。
[0006]所述包被抗原为待检测病原体抗原。
[0007]本发明提供了制备用于检测病原体的无害化阳性对照品的方法，包括如下步骤:
[0008](I)制备鼠抗包被抗原抗体和抗鼠IgG抗体；⑵阳性对照的获得:取鼠抗包被抗原抗体和抗鼠IgG抗体混合并加入小牛血清和硫柳汞后用生理盐水稀释作为阳性对照。
[0009]其中，步骤(2)为取鼠抗包被抗原抗体和抗鼠IgG抗体按照摩尔比1:32?2:1混合，然后按照与抗体混合液的体积比10:1加入％的小牛血清，按照与抗体混合液的体积比2:1加入10%的硫柳汞后，用生理盐水稀释至总体积为抗体混合液的体积的200倍后作为阳性对照。
[0010]优选地，步骤(2)中鼠抗包被抗原抗体和抗鼠IgG抗体按照摩尔比1:4混合。
[0011]在本发明的一个实施例中，取鼠抗包被抗原抗体Img和兔抗鼠IgG抗体4mg混合并加入50ml小牛血清和1ml 10%的硫柳汞后用生理盐水稀释至100ml作为阳性对照。
[0012]本发明的上述方法中，所述鼠抗包被抗原抗体为单抗，所述抗鼠IgG抗体为兔抗鼠IgG多抗。
[0013]所述鼠抗包被抗原的单抗或多抗是可与包被抗原反应的基因表达、化学修饰、免疫学方法获得的IgG类抗体；所述抗鼠IgG的单抗或多抗是可与鼠IgG反应的基因表达、化学修饰、免疫学方法获得的抗体。
[0014]含有本发明阳性对照品的检测试剂盒也属于本发明的保护范围。
[0015]进一步地，所述检测试剂盒为ELISA检测试剂盒。
[0016]本发明还提供了上述阳性对照品在无害化检测病原体中的应用。在应用时，阳性对照品的浓度为0.05-20mg/mlo优选地，阳性对照品的浓度为0.5mg/ml。
[0017]本发明的有益效果在于:利用免疫学方法制备鼠抗包被抗原的单抗或多抗和兔抗鼠IgG的单抗或多抗，按照摩尔比1:32?2:1加入混合在一起作为阳性对照，解决阳性对照材料的来源受限的问题，并避免使用含有病原的血清作为阳性对照的潜在风险。本发明采用严格检验的实验动物进行抗体制备从源头上保障了生物安全性，这些来源与实验动物的抗体制成的阳性对照不存在生物危害风险，同时，和从病毒感染者身体内采集相比较来源更广泛，抗体效价更高，完全可以满足试剂盒中作为阳性对照的需要。
【具体实施方式】
[0018]以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0019]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0020]实施例1用于间接酶联免疫吸附法检测病原体的无害化阳性对照品的制备
[0021]1.鼠抗包被抗原单抗的获得:以包被抗原作为免疫抗原，免疫BALB/c小鼠，将免疫小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞相融合，然后用有限稀释方法获得可分泌红细胞单抗的杂交瘤。具体步骤如下:
[0022]取0.2mg/ml的包被抗原，初次免疫采用皮下多点注射，0.1ml/点，共四点。2周后第二次免疫，剂量同上，腹腔注射。再2周后第三次免疫，剂量同上，腹腔注射(5?7天后采血测其效价)。再过2?3周后加强免疫，剂量0.5ml，腹腔注射。最后一次加强免疫，剂量0.5ml，腹腔注射，3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，将脾脏研碎，过不锈钢筛网，离心，细胞用培养液洗2次，计数，取I X 17脾淋巴细胞悬液备用，准备融合。
[0023]将6?10周大的BALB/C小鼠拉颈处死，浸泡在75%酒精内，3?5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5?6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管)反复冲洗，吸出冲洗液放入1ml离心管，1200rpm/分离5?6min，用20%小牛血清(NCS)的培养液混悬，调整细胞数至I X 107/ml，加入96孔板，100 μ I/孔放入37°C CO2孵箱培养，制得饲养细胞。
[0024]将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10或1:5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗I次，离心，1200rpm, 8min ;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。90s内加入37°C预温的lml45%PEG (分子量400