专利名称：β-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法
技术领域：
本发明属于医药中间体、生物诊断试剂和蛋白染色试剂制备领域，涉及一种
(3-葡萄糖基-Yariv试剂[即1， 3， 5-三(4-(3-D-葡吡喃糖氧基-氧化苯基偶氮基)-2， 4， 6-三羟基苯的合成方法。
背景技术：
P-葡萄糖基-Yariv试剂(p-D-glucosyl-Yariv reagent,卩GlcY)，即1，3,5-三
(4-卩-D-葡吡喃糖氧基-氧化苯基偶氮基)-2,4，6-三羟基苯，是一种人工合成的苯 基偶氮染色剂，其结构式如下该试剂可与阿拉伯半乳糖蛋白(AGPS)的糖基发生反应形成红色沉淀。这
对于我们探究植物体中AGPs的分布和生理作用有着十分重要的意义。但如今，
这种试剂的合成技术在国内外研究很不成熟，可以说已经出现了一个技术缺口， 而国内这项技术目前尚未见研究报道。
在国夕卜，最早是丄Yariv等人在1962年发表的文章(Yariv，丄；Rapport, M. M.; Graf, L The interaction of glycosides and saccharides with antibody to the corresponding phenyl azo glycoside, 8/'oc/7em. J. 1962， 85, 383-388.)中提出了
-D-葡萄糖苷Yariv试剂的合成方法。之后也仅在I. Ganjian等人的文章(Ganjian, l.; Basile， D. V. Reductive syntheses of p-aminophenyl-(3-D-glucoside and its conversion tog-glucosyl Yariv reagent. /Ana/. 8/oc/7em. 1997, 246, 152-155.)中
对其合成进行了改进，即从对硝基苯基葡萄糖苷作为起始原料进行合成。但这些 方法在合成中都存在操作繁琐、产率较低等问题，总产率为一般在20 40%左右。 合成上的困难严重约束了此试剂的更广泛应用和发展。正在这种背景下，需 要找寻一种合成(3-葡萄糖基-Yariv试剂的较为简捷、经济和高效的合成方法。
发明内容
本发明旨在提供一种(3-葡萄糖基-Yariv试剂[即1， 3， 5-三(4-p-D-葡吡喃
糖氧基-氧化苯基偶氮基)-2， 4， 6-三羟基苯]的合成方法，提高产率，而且方法 简捷，使其制备具有工业生产价值。 技术方案为
(1)对硝基苯基葡萄糖苷还原制备对氨基苯基葡萄糖苷
将硝基苯基葡萄糖苷与溶剂混合搅拌，加入钯催化剂和甲酸铵，40 6(TC条件下反应，反应结束后过滤，取滤液减压浓縮；其中Pd与硝基苯基葡萄糖苷的
摩尔比为(0.02 0.5) :1，硝基苯基葡萄糖苷与甲酸铵的摩尔比为1: (2 10);
所述的溶剂选自甲醇或乙醇。
硝基苯基葡萄糖苷与溶剂的质量体积比为0.05 0.02g/ml。 钯催化剂中，钯的重量百分含量为5% 15%，可选用Pd/C。 Pd与硝基苯基葡萄糖苷的摩尔比优选为(0.02 0.2) :1。 硝基苯基葡萄糖苷与甲酸铵的摩尔比优选为1: (3 6)。
(2) 重氮化反应
取步骤(1)得到的固体溶于水中，去除低沸点杂质后，将温度控制在0 5°C， 加入HCI溶液，再滴加亚硝酸盐溶液；硝基苯基葡萄糖苷与HCI的摩尔比为1: (1 5)，硝基苯基葡萄糖苷与亚硝酸盐的摩尔比为1:(1 5)，得到重氮盐溶液。 HCI溶液浓度为0.3 1.0M。
亚硝酸盐选自亚硝酸钠或亚硝酸钾。硝基苯基葡萄糖苷与亚硝酸盐的摩尔比 优选为1: (1 2)。
去除低沸点杂质的方法为将pH调节至2 3，在1 20mmHg、 20 35°C 下减压蒸馏，去除反应系统中1/3 1/2体积水分；加入原反应系统1/3 1/2体 积的水，调节pH至2 3，在20 35。C下减压蒸馏，去除反应体系中1/3 1/2 体积水分；再加入水至原反应系统体积。
(3) 偶联反应
向重氮盐溶液中滴加间苯三酚溶液，将温度保持在0 5'C同时搅拌，硝基苯 基葡萄糖苷与间苯三酚的摩尔比为1: 0.25 0.5; 0 5。C条件下调节pH为8.0 9.0，并反应1 5小时；反应结束后加入0.5 2倍体积甲醇或乙醇混合，0 5°C条件下放置12 48小时，取沉淀。
<formula>formula see original document page 8</formula>III IV
本反应在重氮偶联过程中所用的0.5M盐酸溶液与对硝基苯基葡萄糖苷的摩 尔比为1.0 5.0，且以1.2 1.5为宜。摩尔比太低，不能提供适宜的酸性条件， 致使重氮化反应不能进行完全；摩尔比太高会使其后引入的NaOH的量增多，从 而带入过多的水及盐，使部分产物溶解，阻碍产物析出，致使最终产率降低，增 加生产成本，降低了工业生产价值。此外，反应温度对反应的结果影响很大。反 应温度太低，反应速度太慢，并且反应不能进行完全；反应温度太高会使重氮盐 分解，致使最终产率降低，增加生产成本，降低了工业生产价值。故采用冰水浴 的方法且控制反应温度在0 5"C为佳。
本发明以对硝基苯基葡萄糖苷为起始原料，采用的是"一锅煮"的合成方法， 与传统的合成方法相比，操作更为简便，产率提高到80%左右，大大高于文献中 报道的各种方法；并且反应所使用的试剂均价廉易得，反应条件更为温和，有机 溶剂和催化剂用量大大减少，生产成本明显降低。这种方法还降低能耗，是一种 较为绿色环保和经济高效的合成方法，适用于工业化生产，是一种很有应用前景 的糖苷合成新方法。
图1是(3-葡萄糖基-Yariv[1， 3， 5-三(4-(3-D-葡吡喃糖氧基-氧化苯基偶氮基) -2， 4， 6-三羟基苯]试剂的11"1-核磁谱图2是p-葡萄糖基-Yariv[1 ， 3， 5-三(4-P-D-葡吡喃糖氧基-氧化苯基偶氮基) -2， 4， 6-三羟基苯]试剂的红外谱图
图3是(3-葡萄糖基-Yariv[1 ， 3， 5-三(4-(3-D-葡吡喃糖氧基-氧化苯基偶氮基) -2， 4， 6-三羟基苯]试剂的质谱图
具体实施方式
实施例1
(1) 对硝基苯基葡萄糖苷的还原
在一个100ml的圆底烧瓶加入25ml无水甲醇，加入0.25g (0.83mmol)对
硝基苯基葡萄糖苷，将混合物搅拌约5分钟。再加入0.1g 5% Pd/C催化剂，加 入0.24g (3.81mmo1)甲酸铵。在50°C水浴中继续搅拌。待转化完全后冷至室 温经硅胶土板过滤。滤液合并后在40。C、 1 15mmHg下进行减压浓縮。
(2) 重氮化
将残渣溶解在水中(5ml)，溶液用5%硫酸第一次酸化至pH=3.0。3 6mmHg 真空度和29t:条件下蒸去2.5ml水；再加水至5ml，用5%氢氧化钠碱化至 pH=9.0， 5 10mmHg真空度和29。C条件下蒸去2.5ml水；再加水至5ml。
将圆底瓶冰水浴，加入0.5M盐酸(2.5ml)，控制温度在0~5度。称取0.0643g 亚硝酸钠(0.93mmol)溶于3.5ml冷水中，30min内用滴液漏斗滴完。
(3) 偶联
0.0372g (0.30mmol)间苯三酚溶于12ml冰水，由分液漏斗中缓慢滴入重 氮盐溶液中，0 5度。同时保持均匀搅拌，并保持低温。5%的氢氧化钠溶液缓 慢加入直到pH-9.0， pH稳定在9.0—个半小时，溶液用等体积的乙醇稀释，冰 箱中放置过夜(16小时)，过滤沉淀，干燥后得到0.22g (83%)产品。
实施例2
(1)对硝基苯基葡萄糖苷的还原
对一个500ml的圆底烧瓶加入80ml无水乙醇(20 mol)，加入1g对硝基苯 基葡萄糖苷(3.3mmol)，将混合物搅拌约5分钟。再加入0.25g 10% Pd/C，加入1g甲酸铵(15.9 mmol)，在50°C水浴中继续搅拌。待反应转化完全后冷至 室温经硅藻土过滤。滤液合并后在29 40°C、 1 15mmHg下进行减压浓縮。
(2) 重氮化反应-
将上一步所得残渣溶解在水中(20ml)，溶液用5%硫酸第一次酸化至 pH=3.0。 29°C、 10 15mmHg真空度条件下蒸去10ml水。再加水至20ml，用 5%氢氧化钠碱化至pH=9.0， 29°C、 2 8mmHg真空度条件下蒸去10ml水， 再加入水至20ml。
将圆底瓶冰水浴，加入0.5M盐酸(15ml)，控制温度在0 5。C。称取0.26g (3.8mmol)亚硝酸钠溶于14ml冷水中，30min内用滴液漏斗滴完。
(3) 偶联
0.15g间苯三酚溶于48ml冰水，由分液漏斗中缓慢滴入重氮盐溶液中，0 5°C。同时保持均匀搅拌，并保持低温。5。/。的氢氧化钠溶液缓慢加入直到pH=9.0， pH稳定在9.0约1.5小时，溶液用等体积的乙醇稀释，冰箱中放置36小时，过 滤沉淀，干燥后得到0.78g (73%)产品。
对所得产物(3-葡萄糖基-丫ariv试剂进行了 1H-NMR、 IR、质谱及HPLC分析， 确认为纯的目标产物。1^1-核磁谱、红外谱图和质谱图如图1 3所示。测试数据 如下
1H—NMR: (500MHz，DMSO-d6, TMS内标)(ppm) 3.19(m,1H)， 3.45(m,1H)， 3.71(m，1H), 4.34(t， J=".5Hz，1H), 4.60(t， J=11.5Hz，1H), 4.92(d, J=7.5Hz，1H) 5.03(d' J=5.0Hz，1H)， 5.09(d, J=5.0Hz,1H), 5.27(d， J=5.0Hz, 1H)' 7,15(d, J=9.0Hz, 2H), 7.65 (d, J=3.0Hz,2H);
IR (KBr, pellet, cm1): 3395.6(s), 2920.0(w), 1608.9(m)， 1511.1(m), 1484.4(s)， 1435.6(m)， 1408.9(s), 1324.4(w), 1231.1(s)， 1195.6(m)，1075.6(s), 835.6(w) MS (ESI, negative mode) : m/z 971.3(M-H+, 100);
HPLC (Diamonsil C18 5[j 250M.6mm; DLKMA Technologies;流动相甲醇 水=1: 1 (V/V),流速0.5ml/min)保留时间10.45 min，纯度99.1%
权利要求
1、具有式(I)结构的β-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤(1)对硝基苯基葡萄糖苷还原制备对氨基苯基葡萄糖苷将硝基苯基葡萄糖苷与溶剂混合搅拌，加入钯催化剂和甲酸铵，40～60℃条件下反应，反应结束后过滤，取滤液减压浓缩；其中Pd与硝基苯基葡萄糖苷的摩尔比为(0.02～0.5)∶1，硝基苯基葡萄糖苷与甲酸铵的摩尔比为1∶(2～10)；所述的溶剂选自甲醇或乙醇；(2)重氮化反应取步骤(1)得到的残渣溶于水中，去除低沸点杂质后，将温度控制在0～5℃，加入HCl溶液，再向反应体系中加入亚硝酸盐溶液；硝基苯基葡萄糖苷与HCl的摩尔比为1∶(1～5)，硝基苯基葡萄糖苷与亚硝酸盐的摩尔比为1∶(1～5)，得到重氮盐溶液；(3)偶联反应向重氮盐溶液中滴加间苯三酚溶液，将温度保持在0～5℃同时搅拌，硝基苯基葡萄糖苷与间苯三酚的摩尔比为1∶(0.25～0.5)；0～5℃条件下调节pH至8.0～9.0，并反应1～5小时；反应结束后加入0.5～2倍体积甲醇或乙醇混合，0～5℃条件下放置12～48小时，取沉淀。
2、 权利要求1所述(3-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法，其特征在于，步骤(1) 中所述的钯催化剂为Pd/C。
3、 权利要求1或2所述(3-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法，其特征在于，步骤 (1)中所述的钯催化剂中，钯的重量百分含量为5% 15%。
4、 权利要求1所述P-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法，其特征在于，步骤(1) 中，硝基苯基葡萄糖苷与溶剂的质量体积比为0.05 0.02g/ml。
5、 权利要求1所述P-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法，其特征在于，步骤(1) 中，所述Pd与硝基苯基葡萄糖苷的摩尔比为(0.02 0.2) :1。
6、 、权利要求1所述P-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法，其特征在于，步骤(1) 中，所述硝基苯基葡萄糖苷与甲酸铵的摩尔比为1: (3 6)。
7、 权利要求1所述(3-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法，其特征在于，步骤(2) 中去除低沸点杂质的方法为将pH调节至2 3，在1 20mmHg、 20 35。C下 减压蒸馏，去除反应系统中1/3 1/2体积水分；加入原反应系统1/3 1/2体积的水，调节pH至2 3，在20 35'C下减压蒸馏，去除反应体系中1/3 1/2体 积水分；再加入水至原反应系统体积。
8、 权利要求1所述P-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法，其特征在于，步骤(2) 中所使用的HCI溶液浓度为0.3 1.0M。
9、 权利要求1所述的P-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的硝基苯基葡萄糖苷与HCI的摩尔比为1: (1.2 1.5)。
10、 权利要求1所述的P-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法，其特征在于，步骤 (2)中所述的硝基苯基葡萄糖苷与亚硝酸盐的摩尔比为1: (1 2)，所述的亚硝酸盐为亚硝酸钠或亚硝酸钾。
全文摘要
本发明涉及β-葡萄糖基-Yariv试剂的制备方法。其步骤包括(1)对硝基苯基葡萄糖苷还原制备对氨基苯基葡萄糖苷；(2)重氮化反应；(3)偶联反应。本发明以对硝基苯基葡萄糖苷为起始原料，采用的是“一锅煮”的合成方法，与传统的合成方法相比，操作更为简便，产率提高到80％左右，并且反应所使用的试剂均价廉易得，反应条件更为温和，有机溶剂和催化剂用量大大减少，生产成本明显降低，适合工业化生产。
文档编号C07H15/203GK101525358SQ20091004926
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者张剑波, 萌 李, 田祥光, 许意达, 琛 陈 申请人:华东师范大学