专利名称：N-连接糖链分析用试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物分析领域，特别是指一种N-连接糖链分析用试剂。
背景技术：
近十年来，继基因组学和蛋白质组学之后，糖组学正成为生命科学研究中又一新的前沿和热点。研究表明，糖链参与了各种生命现象的调节，如细胞识别、粘连与融合、信号传递、免疫与应答、细胞分化和形态发生都离不开糖链的参与。如果糖基化修饰出现缺陷，就会发生先天性糖基化缺陷疾病，目前在人类中已发现数十种此类疾病。细胞恶变如癌症的发生与糖基化异常也有密切关系，癌细胞的侵袭与转移就是由糖链介导的糖链与蛋白相互作用完成的。因此，糖链在生命活动调节中扮演着非常重要的作用，糖链的结构研究有助于最终阐明参与糖链合成的有关糖基化转移酶和糖苷酶表达基因的功能，也有助于阐明相关疾病发生的机理。
根据与糖链连接方式不同，蛋白质主要有N-连接(寡糖中的N-乙酰葡糖胺与多肽链中的天冬酰胺残基的酰胺氮连接)和O-连接(寡糖中的乙酰半乳糖胺与多肽链中的丝氨酸或苏氨酸残基的羟基相接)两种糖基化形式。这两种连接糖蛋白主要定位于细胞膜表面。近年，因N-连接糖链对细胞癌症的发生和转移、以及造血功能起着重要作用而其结构与生物功能之间关系研究倍受人们的关注。为了这些研究得到顺利进行，不仅需要研制开发相关糖类分析仪器，而且更急需开发糖链相关试剂和新的高灵敏、高选择性、简便的N-连接糖链分析方法。
研究糖蛋白糖链的传统方法一般是将糖链切掉(化学法和酶法)并分离纯化后进行分析。如何分离、纯化从糖蛋白糖链中释放的糖链，是糖链结构分析的关键环节。但糖链的分离、纯化却是一项复杂和摸索性很强的工作，其原因主要有以下因素造成(1)糖链自身在组成、连接、衍生化、微观不均一性等方面具有高度复杂性。组成糖链的单糖如葡萄糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰葡萄糖、N-乙酰基半乳糖等具有相似的结构，这使从糖蛋白中释放的寡糖的结构具有相似性。(2)生物来源的糖蛋白的样品含量往往很少，在分离、纯化从糖蛋白中释放的寡糖链时，要求对糖链具有高灵敏的检测。由于糖链本身没有发色基团，尽管示差、脉冲检测可以用于非衍生化糖链的检测，但对含量低的生物来源的样品来说，它的检测灵敏度并不能满足上述微量样品的要求。为了在分离纯化和结构鉴定过程中能够更有效地检测到糖链，往往要对糖链进行衍生化，这对于微量糖链的分离分析是十分必要的。目前，已开发的几种糖链柱前衍生化方法中，与糖链还原端反应的还原胺化HPLC实用范围较广，应用较多。常用的衍生化试剂有对氨基苯甲酸乙酯(ABEE)、8-氨基奈-1，3，6-三磺酸(ANTS)和2-氨基吡啶(2-AP)等。但是，这些方法包括糖链切掉、糖链与衍生化试剂的反应等几步程序，其操作繁琐费时，而且在糖链衍生化过程中还可能发生还原端异构化、β-消除反应、唾液酸丢失等。近十年来，生物质谱软电离技术在糖链物质结构分析方面有了长足进展，高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)串连技术已成为糖链结构解析的强大工具，特别是质谱具有微量、快速、准确和高通量的特点，与柱前衍生化的HPLC纯化方法相配合，有望实现糖链结构研究的突破。但目前的衍生化方法往往引起质谱灵敏度的降低，因此，发展操作简便、反应条件温和、选择性高的衍生化方法，既能提高HPLC检测灵敏度，又能提高后续质谱灵敏度的方法，这将是柱前衍生化发展的重要内容。
近年，有人报道了糖链转移酶endo-β-N-acetylglucosaminidase(Endo-M)。Endo-M切断N-连接糖链五糖核心最内侧的两个N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc-GlcNAc)之间的糖苷键，将其中一个GlcNAc留在多肽链上，并把释放出来的糖链转移到另外一个含有GlcNAc残基的受体。为了利用Endo-M酶水解和糖链转移反应，已开发了Fmoc-Asn-GlcNAc、DNS-Asn-GlcNAc(DNS-5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl；Asn-GlcNAcasparaginyl-N-acetyl-D-glucosamine)等荧光受体，一步完成糖链的酶切和糖链的衍生化反应。但糖链对该受体的转移率低，从而限制了实际样品的分析应用。最近，Toyooka等人利用GlcNAc-Asn与DBD-F(4-(N，N-dimethylaminosulfonyl)-7-fluoro-2，1，3-benzoxadiazole)等荧光衍生化试剂的反应，合成了几种含有GlcNAc残基的荧光标记受体，从中选择糖链转移率较高(大约15％)的NDA-Asn-GlcNAc(NDA2，3-naphthalene-dialdehyde)、DBD-Asn-GlcNAc受体，利用Endo-M酶反应，建立了简便的N-连接糖链分离分析方法。在Endo-M酶反应中，虽然他们所合成的NDA-Asn-GlcNAc、DBD-Asn-GlcNAc两种荧光受体的糖链转移率比DNS-Asn-GlcNAc、Fmoc-Asn-GlcNAc高一些，但难于满足微量生物样品的分析要求。目前，已开发的Endo-M酶反应糖链受体几乎都是以Asn-GlcNAc为母体，在Asn的氨基上标记荧光试剂而制成的。但是，这些受体的糖链转移率普遍较低，其原因可能是因为Endo-M的糖链转移反应和酶水解反应条件几乎相同，以致糖链转移生成物重新被Endo-M水解。当以Boc-Asn-GlcNAc为母体，在Asn的羧基上标记DBD时，DBD-Boc-Asn-GlcNAc受体的糖链转移率比DBD-Asn-GlcNAc受体的糖链转移率提高两倍，这说明反应物的立体化学结构与酶糖链转移反应有密切关系。虽然上述荧光标记受体在荧光检测器上灵敏度较高，但其质谱检测灵敏度却满足不了微量生物样品的分析。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种一步完成糖链的酶切和衍生化，然后，采用色质联用技术，建立简便、高灵敏、高选择性的N-链接糖链分析方法所使用的N-连接糖链分析用试剂。
本发明的技术方案为 一种N-连接糖链分析用试剂，以Boc-Asn-GlcNAc和2-肼基-1-甲基吡啶(HMP)为起始物，反应合成HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)，该HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)试剂具有如下结构式
一种N-连接糖链分析用试剂，以Boc-Asn-GlcNAc和吉拉尔特试剂P(GP)为起始物，反应合成GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)，该GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)试剂具有如下结构式
一种N-连接糖链分析用试剂，以Boc-Asn-GlcNAc和吉拉尔特试剂T(GT)为起始物，反应合成GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)，该GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)试剂具有如下结构式
一种N-连接糖链分析用试剂，以Boc-Asn-GlcNAc和1-甲基-4-[2，4-二硝基-5-(1-哌嗪基)苯基]哌嗪(PDPZ)为起始物，反应合成PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)，该试剂PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)具有如下结构式
PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV) 一种N-连接糖链分析用试剂，在上述的PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)和碘甲烷反应合成MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)，该MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)试剂具有如下结构式
本发明人基于现有技术考虑，设想采用Boc-Asn-GlcNAc作为Endo-M酶反应受体，再在Asn的羧基上分别标记易离子和已带电荷的受体，以便提高糖链转移率和糖链衍生物在质谱检测器上的检测灵敏度，并利用Endo-M酶糖链转移反应，一步完成糖链的酶切和衍生化，然后，采用色质联用技术，建立简便、高灵敏、高选择性的N-链接糖链分析方法，为糖链生物功能的深入研究提供有效、可靠的分析检测手段。
具体实施例方式 实施例1 HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)的合成 24mg Boc-Asn-GlcNAc乙腈/DMF(6∶4，V/V)中加入48mg HMP、167mg TPP、138mgDPDS，室温，避光条件下反应30min，减压抽除溶剂，然后加入10mlCH2Cl2搅拌5min，过滤分离出固体，用CH2Cl2洗涤固体数次，直到无色为止。然后用甲醇溶解，过滤，浓缩母液，得到白色晶体HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)。
ESI-MS谱图数据(m/z)541.2(M+)
实施例2 GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)的合成 20mg Boc-Asn-GlcNAc乙腈/DMF(6∶4，V/V)中加入24mg(GP)、125mg TPP、105mgDPDS，室温，避光条件下反应30min，减压抽除溶剂，然后加入10mlCH2Cl2搅拌5min，过滤分离出固体，用CH2Cl2洗涤固体数次，直到无色为止。然后用甲醇溶解，过滤，浓缩母液，得到白色晶体GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)。
MALDI-TOF-MS谱图数据(m/z)569.4(M+)
实施例3 GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)的合成 20mg Boc-Asn-GlcNAc乙腈/DMF(6∶4，V/V)中加入21mg(GT)、125mg TPP、105mgDPDS，室温，避光条件下反应30min，减压抽除溶剂，然后加入10mlCH2Cl2搅拌5min，过滤分离出固体，用CH2Cl2洗涤固体数次，直到无色为止。然后用甲醇溶解，过滤，浓缩母液，得到白色晶体GP-Boc-Asn-GlcNAc(III)。
MALDI-TOF-MS谱图数据(m/z)549.3(M+)
实施例4 PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)的合成 34.3mg Boc-Asn-GlcNAc乙腈/DMF(6∶4，V/V)中加入42.3mg 1-甲基-4-[2，4-二硝基-5-(1-哌嗪基)苯基]哌嗪(PDPZ)、133.7mg TPP、122.9mg DPDS，室温，避光条件下反应30min，减压抽除溶剂，加适量水，用CH2Cl2萃取后减压旋干水层，经硅胶柱(CH2Cl2/CH3OH体积比10∶1)，得橙黄色粉末PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)。
ESI-MS谱图数据(m/z)768.3[M+H]+；790.3[M+Na]+
实施例5 MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(II)的合成 24.2mg PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc甲醇(乙腈、丙酮等)中加入适量碘甲烷，40-80℃水浴，反应0.5-1h，N2吹干，得亮黄色晶体粉末MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)。
ESI-MS谱图数据(m/z)782.4(M+)
本发明中的五种试剂都含有N-乙酰葡萄糖胺结构，可以利用Endo-M切断N-连接糖链五糖核心最内侧的两个N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc-GlcNAc)之间的糖苷键，将其中一个GlcNAc留在多肽链上，并把释放出来的糖链转移到另外一个含有GlcNAc残基(我们合成的五种受体受体)上。由于该五种受体易离子化或已带电荷，所以可以提高糖链衍生物在质谱检测器上的检测灵敏度，为糖链生物功能的深入研究提供高灵敏的分析试剂。
权利要求
1.一种N-连接糖链分析用试剂，以Boc-Asn-GlcNAc和2-肼基-1-甲基吡啶(HMP)为起始物，反应合成HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)，该HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)试剂具有如下结构式
2.一种N-连接糖链分析用试剂，以Boc-Asn-GlcNAc和吉拉尔特试剂P(GP)为起始物，反应合成GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)，该GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)试剂具有如下结构式
3.一种N-连接糖链分析用试剂，以Boc-Asn-GlcNAc和吉拉尔特试剂T(GT)为起始物，反应合成GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)，该GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)试剂具有如下结构式
4.一种N-连接糖链分析用试剂，以Boc-Asn-GlcNAc和1-甲基-4-[2，4-二硝基-5-(1-哌嗪基)苯基]哌嗪(PDPZ)为起始物，反应合成PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)，该PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)试剂具有如下结构式
5.根据权利要求4所述的一种N-连接糖链分析用试剂，其特征在于所述的PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)和碘甲烷反应合成MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)，该MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)试剂具有如下结构式
全文摘要
本发明涉及N-连接糖链分析用试剂，具体指HMP-Boc-Asn-GlcNAc(I)、GP-Boc-Asn-GlcNAc(II)、GT-Boc-Asn-GlcNAc(III)、PDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(IV)和MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc(V)共五种试剂。该试剂都含有N-乙酰葡萄糖胺结构，可以一步完成糖链的酶切和衍生化，然后，采用色质联用技术，建立简便、高灵敏、高选择性的N-链接糖链分析方法，可以提高糖链衍生物在质谱检测器上的检测灵敏度，为糖链生物功能的深入研究提供高灵敏的分析试剂。
文档编号C07H13/04GK101759633SQ20101003082
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月15日 优先权日2010年1月15日
发明者金东日, 国营 申请人:延边大学