鸡蛋清溶菌酶及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种鸡蛋清溶菌酶及其制备方法，所述鸡蛋清溶菌酶的蛋白活性的多肽氨基酸编码序列为序列表400<1>所示序列，制备方法包括：(1)获取鸡蛋清溶菌酶基因；(2)重组质粒的构建；(3)基因工程菌株的构建；(4)基因工程重组鸡蛋清溶菌酶生产方法；所述鸡蛋清溶菌酶具有稳定、纯净、生物活性高的特点，可广泛应用于制药、饲料等多个领域，其制备方法将基因工程菌株作用于发酵合成溶菌酶，所构建的工程菌株能大量增加酶基因的拷贝数，提高酶的表达量，从而实现鸡蛋清溶菌酶的高效合成，不受原材料来源的限制。
【专利说明】鸡蛋清溶菌酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】，尤其是鸡蛋清溶菌酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 溶菌酶（lysozyme)首先是从尼科辽（Nicolle) 1907年发表枯草芽孢杆菌溶解因 子的报告开始的。两年后，拉希琴科（Laschtscbenko)指出，鸡蛋清有强抑菌作用，是酶作 用的结果。1922年，弗来明（Fleming)发现人的鼻涕、唾液、眼泪也有强力的溶菌活性，因其 具有溶菌作用，被命名为溶菌酶。溶菌酶广泛存在于动物、植物和微生物中，是一种天然的 抗菌剂，能特异性地作用于细胞壁N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，NAG)和N-乙 酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid，NAM)之间的β-1，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，使微生物 细胞在内部渗透压的作用下涨裂，细胞质外泄，最终导致细胞死亡。溶菌酶的化学性质稳 定，在pH值4-7范围内，KKTC处理Imin仍能保持原酶活性，对革兰氏阳性菌和部分革兰氏 阴性菌有很好的抑菌作用，对人和动物的细胞则不发生溶菌作用，被WHO和许多国家认定 为无毒、无害、安全的添加剂，被越来越广泛地应用于医药、生物技术、食品以及动物生产 中。
[0003] 根据溶菌酶氨基酸序列和底物的差异，可以将溶菌酶大致分为3种类型：c型（鸡 蛋清溶菌酶）、g型（鹅蛋清溶菌酶）和噬菌体溶菌酶。迄今为止，生产上应用最多的是鸡 蛋清溶菌酶（hen egg white Isozyme)。鸡蛋清中溶菌酶的含量很丰富，约占蛋清总蛋白的 3.4% -3. 5%，作为溶菌酶类的典型代表，是结构了解最清楚的溶菌酶之一。它含有129个 氨基酸，分子量约为14, 300Da，鸡蛋清溶菌酶具有的广谱抗性使其在食品和医学等领域早 已得到广泛地应用。溶菌酶制剂能有效防止球虫病，饲喂小麦基础日粮的鸡，添加和不添加 酶对球虫病的应激呈现不同的反应，对照组鸡生长被抑制52. 5%，而加酶组为30. 5%，而 且损伤系数要好得多。此外，溶菌酶还能改变肠道微生物群，增加肠道有益菌，使肠道内的 胺、甲酚等有害物减少，增加机体抗病力，提高动物的生产性能。在不用任何抗生素情况下， 于肉鸡饲料中添加饲用溶菌酶制剂，可促进鸡体的健康，增加体重和饲料报酬，减少死亡。 饲用溶菌酶可以促进饲料中营养物质的消化、吸收，提高饲料的消化率，最大限度地提高饲 料原料的利用率。
[0004] 目前，我国主要采用蛋厂鸡蛋壳中残留的鸡蛋清为原料来生产鸡蛋清溶菌酶，其 中相关的报道很多，有直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、沉淀法、双水相萃取、超滤法 等。各种方法优缺点不一，产品的质量和生产成本也有所不同。沉淀法是一种工业上应用 比较成熟的提取方法，其在技术要求和生产成本上都比较好。但自鸡蛋清中提取溶菌酶存 在着生产成本高、生产工艺复杂、生产规模受限制等问题，难于满足越来越大的市场需求， 因此寻找其他廉价的生产鸡蛋清溶菌酶的途径是非常有意义的，近年来人们正研究利用分 子生物技术构建基因工程菌，通过发酵手段生产溶菌酶，将是提高溶菌酶产量，降低成本 的有效手段之一。
[0005] 鸡蛋清溶菌酶应用抗病基因工程研究最早起始于上世纪90年代初，1992年， Trudel等将鸡蛋清溶菌酶基因首次导入烟草并随后检测到转基因植株有溶菌酶活性。2000 年，Carolina等通过农杆菌介导法将鸡蛋清溶菌酶基因导入到马铃薯中，结果表明14-20 株转基因植株对细菌性软腐病的抗性增强。2007年，刘兴敏等人根据T4噬菌体溶菌酶的 氨基酸序列，选用植物偏爱的密码子设计并人工合成了溶菌酶基因，导入宿主细菌E. coli BL21 (DE3)pLysS，经IPTG诱导后，宿主菌在2h内全部被溶菌酶基因的表达产物裂解，说明 该溶菌酶基因对细菌具有很强的抗性。2008年，李斌等将鸡蛋清溶菌酶基因 LYZ插入表达 载体pET15b，获取大量高纯度鸡蛋清溶菌酶，其纯度达90%以上，为利用大肠杆菌系统规 模化生产重组鸡蛋清溶菌酶奠定了技术基础。
[0006] 而当今动物疾病盛行，抗生素在预防治疗畜禽疾病起到了不可磨灭的作用，但考 虑到其相关副作用，人们不得不去寻求一种安全、高效的饲用抗生素替代品，这已成为本世 纪畜牧工作者面临的迫切问题。早己应用与医疗、食品等行业的溶菌酶引起了饲料行业的 注意。然而当前商品化溶菌酶多为鸡蛋清提取，较高的成本限制了其在畜禽养殖和饲料工 业中的应用。国内一些企业抓住时机，通过生物技术已工业化生产出大量溶菌酶，且成本较 低。由于溶菌酶是初次应用于该行业，目前市场畜禽应用溶菌酶的报道极少，因而对这种新 的产品在市场推广应用之前，饲料行业急需在畜禽中的应用效果评价的相关报道。本试验 正是基于此目的，对溶菌酶在肉鸡中的应用作一有效性评价，探讨其作为安全添加剂替代 抗生素应用可能性，具有广泛的社会意义。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种鸡蛋清溶菌酶。
[0008] 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述鸡蛋清溶菌酶的制备方法。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0010] 一种鸡蛋清溶菌酶，其蛋白活性的多肽氨基酸编码序列为序列表400〈1>所示序 列，具体为：
[0011] KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRT PGSRNLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSXGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRLo
[0012] 上述鸡蛋清溶菌酶的制备方法，具体构建步骤如下：
[0013] (1)获取鸡蛋清溶菌酶基因：根据Gene Bank中已发表的编码具有鸡蛋清溶菌酶 蛋白活性的多肽氨基酸序列，合成了鸡蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根据大肠杆菌表达宿主 进行密码子的优化，所得多肽氨基酸序列为序列表400〈1>所示序列；
[0014] (2)重组质粒的构建：用酶切连接的方法分别将上述鸡蛋清溶菌酶基因与载体 pET-28a相连，得到携带鸡蛋清溶菌酶基因的重组表达载体pET28a (+) /LYZ，并进行双酶切 验证；
[0015] (3)基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株 BL21(DE3)中，得到含有重组质粒的基因工程菌株；
[0016] (4)基因工程重组鸡蛋清溶菌酶生产方法：通过在发酵条件下使工程菌株在IPTG 的诱导下大量合成鸡蛋清溶菌酶，经提取、纯化后制成溶菌酶产品。
[0017] 优选的，上述鸡蛋清溶菌酶的制备方法，所述步骤（2)中所用的原核表达载体是 大肠杆菌表达载体pET_28a，构建载体宿主细胞是大肠杆菌DH5 α菌株，表达宿主细胞是大 肠杆菌BL21(DE3)菌株。
[0018] 优选的，上述鸡蛋清溶菌酶的制备方法，所述步骤（4)中重组溶菌酶的生产工艺 为：重组工程菌E. Co I i BL21 (DE3) /pET28a (+) /LYZ接种于LB培养基中，在培养温度为 37°C，摇床转速为180r/min条件下，培养至菌液OD值为0. 4?0. 6时，取出ImL菌液作为对 照，剩下的部分加入IPTG(终浓度为0. 5?2mM/mL)进行诱导，诱导时间为4?6小时，诱 导结束后12000r/min离心2?5min收集菌体，并将诱导前后的菌体煮沸后进行SDS-PAGE 电泳，检测溶菌酶蛋白的表达，之后将获得的菌体经裂解、变性、复性等纯化提取后制成溶 菌酶产品，再利用SDS-PAGE电泳检测溶菌酶的纯化效果。
[0019] 优选的，上述鸡蛋清溶菌酶的制备方法，所述LB培养基的成分为蛋白胨10g/L、酵 母粉5g/L、氯化钠10g/L，通过常规方法制备而成。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] 上述鸡蛋清溶菌酶，具有稳定、纯净、生物活性高的特点，可广泛应用于制药、饲料 等多个领域，其制备方法以大肠杆菌为基础，运用基因工程重组技术构建基因工程菌株，应 用基因合成获得相关酶基因，并应用分子生物学制药技术，将基因工程菌株作用于发酵合 成溶菌酶，所构建的工程菌株能大量增加酶基因的拷贝数，提高酶的表达量，从而实现鸡蛋 清溶菌酶的高效合成，不受原材料来源的限制，为实现大批量、低价、工业化生产鸡蛋清溶 菌酶提供了一条可行途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为本发明的载体构建示意图；
[0023] 图2为本发明pET28a(+)/LYZ重组表达质粒的酶切验证电泳图，其中：
[0024] M 为 DNA marker ; 1-2 为 pET28a (+) /LYZ/BamHI/Hind III ;
[0025] 图3为本发明的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)/LYZ的蛋白表达电泳图，其 中：
[0026] 泳道M为低分子量蛋白Marker ;泳道1为诱导前全菌裂解液；泳道2-4为诱导后 全菌裂解液；
[0027] 图4为本发明的重组溶菌酶蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中：
[0028] 泳道M为低分子量蛋白Marker ;泳道1、2为包涵体纯化后的溶菌酶蛋白；
[0029] 图5为本发明溶菌酶的杀菌效应图，其中：
[0030] 3、4为添加 PBS缓冲液的阴性对照，5为溶菌酶标品的阳性对照，6为本发明溶菌酶 产生的抑菌圈。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0032] 实施例1
[0033] -种鸡蛋清溶菌酶的制备方法，利用基因合成技术获得鸡蛋清溶菌酶的cDNA 序列，应用E. coli表达系统，对鸡蛋清溶菌酶Iyz基因进行高效表达，构建包含目的基 因 Iyz的重组大肠杆菌，在IPTG的诱导下进行发酵合成，最后通过提取、纯化获得鸡蛋 清溶菌酶的方法。本发明所用的目的基因是根据NCBI公布的鸡蛋清溶菌酶蛋白序列 (ACCESSIONNUMBER:GI345100466)合成的，本发明中重组载体的的宿主细胞为大肠杆菌 BL21 (DE3)。所构建的重组表达载体不仅包括编码酶的DNA序列，还具有表达该基因所需的 控制兀件。
[0034] 具体构建方法的步骤如下：
[0035] 1、鸡蛋清溶菌酶Iyz基因的合成
[0036] 根据NCBI公布的鸡蛋清溶菌酶蛋白序列（ACCESSION NUMBER:GI345100466)，按 照大肠杆菌密码子偏爱性重新优化序列，替换稀有密码子，调节AT含量，使其可在大肠杆 菌BL21 (DE3)中高效表达，然后将该优化的基因序列交给上海英潍捷基公司合成，合成后 的序列克隆至PMD18-T载体。
[0037] 2、重组质粒的构建
[0038] (1)表达载体的制备：
[0039] 在卡那霉素（50 μ g/mL)的LB培养基中接种携带质粒pET_28a的大肠杆菌DH5 α 菌株（购自宝生物公司），于37°C振荡培养过夜。将I. 5mL菌液转入微量离心管中，12000r/ min,离心30s收集菌体，弃上清，控干残液。将沉淀重悬于100 μ L预冷的溶液I (50mmol鹿 糖，25mmol Tris，10mmol EDTA，pH8.0)，混合均匀。加入 200yL 新配置的溶液 2(0.2mol NaOH，1 % SDS)盖紧管口，轻轻摇匀，放置冰上l-2min至液体清亮。加入150 μ L预冷的溶 液3 (3mol乙酸甲，ρΗ4. 8)轻轻转动离心管，使溶液3在粘稠的细菌裂解液中混合均匀，冰浴 3_5min，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一管中，12000r/min钟，离心5min，再将上 清移到另一离心管中。加入2-2. 5倍体积的无水乙醇，混匀，冰浴（或-20°C )放置30min。 12000r/min，离心5min，收集质粒DNA沉淀。用70 %乙醇洗涤沉淀2-3次，弃去残液，空气 中干燥10-20min，用20 μ L的双蒸水溶解沉淀。
[0040] 所获得的pET-28a即可用作连接酶基因的载体，载体构建示意图如图1所示。
[0041] (2)重组表达载体的构建：
[0042] ①将合成得到的含有鸡蛋清溶菌酶Iyz基因的菌株活化，利用小提试剂盒提取 DH5 a /pMD18-T-LYZ的质粒，pMD18-T-LYZ和pET-28a(+)质粒分别用相应的限制性内切酶 进行双酶切，然后电泳、切胶回收酶切后的质粒和目的基因，均选用50yL酶切体系：
[0043] a.
【权利要求】
1. 一种鸡蛋清溶菌酶，其特征在于：其蛋白活性的多肽氨基酸编码序列为序列表 400〈1>所示序列，具体为： KVFGRCELAAAMKRHGLDNYRGYSLGNWVCAAKFESNFNTQATNRNTDGSTDYGILQINSRWWCNDGRTPGSR NLCNIPCSALLSSDITASVNCAKKIVSXGNGMNAWVAWRNRCKGTDVQAWIRGCRLo
2. 权利要求1所述的鸡蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于：具体构建步骤如下： (1) 获取鸡蛋清溶菌酶基因：根据Gene Bank中已发表的编码具有鸡蛋清溶菌酶蛋白 活性的多肽氨基酸序列，合成了鸡蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根据大肠杆菌表达宿主进行 密码子的优化，所得多肽氨基酸序列为序列表400〈1>所示序列； (2) 重组质粒的构建：用酶切连接的方法分别将上述鸡蛋清溶菌酶基因与载体 pET-28a相连，得到携带鸡蛋清溶菌酶基因的重组表达载体pET28a (+) /LYZ，并进行双酶切 验证； (3) 基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株BL21(DE3) 中，得到含有重组质粒的基因工程菌株； (4) 基因工程重组鸡蛋清溶菌酶生产方法：通过在发酵条件下使工程菌株在IPTG的诱 导下大量合成鸡蛋清溶菌酶，经提取、纯化后制成溶菌酶产品。
3. 根据权利要求2所述的鸡蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（2)中所 用的原核表达载体是大肠杆菌表达载体pET_28a，构建载体宿主细胞是大肠杆菌DH5 α菌 株，表达宿主细胞是大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
4. 根据权利要求2所述的鸡蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于：所述步骤（4)中重 组溶菌酶的生产工艺为：重组工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET28a(+)/LYZ接种于LB培养基 中，在培养温度为37°C，摇床转速为180r/min条件下，培养至菌液0D值为0. 4?0. 6时，取 出lmL菌液作为对照，剩下的部分加入终浓度为0. 5?2mM/mL的IPTG进行诱导，诱导时间 为4?6小时，诱导结束后12000r/min离心2?5min收集菌体，并将诱导前后的菌体煮沸 后进行SDS-PAGE电泳，检测溶菌酶蛋白的表达，之后将获得的菌体经裂解、变性、复性等纯 化提取后制成溶菌酶产品，再利用SDS-PAGE电泳检测溶菌酶的纯化效果。
5. 根据权利要求4所述的鸡蛋清溶菌酶的制备方法，其特征在于：所述LB培养基的成 分为蛋白胨l〇g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，通过常规方法制备而成。
【文档编号】C12N9/36GK104263709SQ201410500154
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】王连民, 刘珂飞, 荆玮 申请人:天津生机集团股份有限公司