一种通过糖代谢调控因子提高乳链菌肽nisin产量的方法
【专利摘要】本发明公开了sacR基因在提高nisin活性中的应用。本发明提供了SacR蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在提高乳酸乳球菌产生的乳链菌肽的产量和/或活性中的应用；所述SacR蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。本发明的实验证明，在nisin高产菌Lactis AL2中增加sacR基因的拷贝数，即提高SacR的表达水平，可以进一步提高乳酸乳球菌生产nisin的产量约10％。本发明深化了对nisin产生调控机制的认识，可作为基础进一步提高nisin产量，并对高产菌进行生物工程改造进而降低成本，这在食品产业有着十分广阔的应用前景。
【专利说明】-种通过糖代谢调控因子提高乳链菌肽nisin产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种通过糖代谢调控因子提高乳链菌肽 nisin产量的方法。
【背景技术】
[0002] 乳链菌肽（nisin)是由乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcuslactissubsp. Lactis)的某些菌株产生的一种阳离子抗菌肽，对能够引起食品腐败和致病性的格兰仕阳 性菌具有强烈的抑制作用，而对人体的安全无毒，目前已被全世界50多个国家和地区广泛 使用，是一种安全、高效的食品防腐剂。Nisin有耐热、抑菌范围广、无毒特性，使其在医药和 轻工业等领域也极具应用潜力。Nisin产生菌Lactococcuslactissubsp.LactisAL2是 经过多年育种获得的nisinZ高产菌，是乳链菌肽工业化生产菌株，如何进一步提高nisin 产生菌的生产能力从而获得更大的经济效益一直是科研人员和企业所关注的问题。因此， 建立新的菌种改造的方法对提高nisin产量、节约生产成本、进一步解决食品安全问题具 有重要意义。
[0003] 自然界中蔗糖无处不在，蔗糖代谢相关基因成簇排列且广泛存在于微生物中，在 L.lactisAL2中，鹿糖代谢相关的四个基因sacR、sacA、sacB、sacK成簇排列，组成三个转 录本sacAR，sacBK和sacR。在非诱导状态sacR有少量表达，并抑制sacAR和sacBK两个 转录本中基因的表达。在有相应诱导作用的糖代谢中间代谢产物（例如sucr〇Se-6P)在的 条件下，SacR与诱导物结合释放sacAR、sacBK等基因的表达。在以葡萄糖为碳源时，SacR 为糖代谢的抑制因子。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供SacR蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体 的新用途。
[0005] 本发明提供的SacR蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在提高乳酸 乳球菌产生的乳链菌肽（nisin)的产量和/或活性中的应用；
[0006] 所述SacR蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
[0007] 上述应用中，所述提高乳酸乳球菌产生的乳链菌肽的产量和/或活性体现在提高 乳链菌肽的抑菌活性。
[0008] 上述应用中，所述抑菌为抑制黄色微球菌。
[0009] 上述应用中，所述SacR蛋白编码基因的核昔酸序列为序列表中序列1。
[0010] 上述应用中，其特征在于：所述重组载体为将所述SacR蛋白编码基因插入表达载 体中，得到表达SacR蛋白的重组载体。
[0011] 上述应用中，所述乳酸乳球菌为L.lactisAL2。
[0012] 本发明的另一个目的是提供一种培育重组菌的方法。
[0013] 本发明提供的方法，为将所述SacR蛋白编码基因导入目的菌，获得重组菌，所述 重组菌产生的乳链菌肽的活性大于所述目的菌。
[0014] 上述方法中，所述重组菌产生的乳链菌肽的活性大于所述目的菌为所述重组菌产 生的乳链菌肽的抑菌活性大于所述目的菌产生的乳链菌肽的抑菌活性。
[0015] 上述方法中，所述抑菌为抑制黄色微球菌；
[0016] 所述SacR蛋白编码基因的核昔酸序列为序列表中序列1。
[0017] 上述方法中，所述SacR蛋白编码基因通过重组载体导入目的菌；
[0018] 所述重组载体为将所述SacR蛋白编码基因插入表达载体中，得到表达sacR蛋白 的重组载体；
[0019] 所述乳酸乳球菌为L.lactisAL2。
[0020] 乳酸乳球菌LactisAL2是本实验以Lactis7962为出发菌株，经过诱变筛选获得 的nisin高产突变菌株，并已经应用到nisin的工业生产当中。传统的观点认为，nisin的 生物合成受成熟的nisin诱导产生。而SacR作为糖代谢调控因子在蔗糖的利用中可以调 控相关的蔗糖利用基因的表达。
[0021] 本发明的实验证明，在nisin高产菌LactisAL2中增加sacR基因的拷贝数，即提 高SacR的表达水平，可以进一步提高乳酸乳球菌生产nisin的产量约10%。本发明深化了 对nisin产生调控机制的认识，可作为基础进一步提高nisin产量，并对高产菌进行生物工 程改造进而降低成本，这在食品产业有着十分广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为nisin高效液相色谱鉴定结果图
[0023] 图2为nisin质谱鉴定结果图
[0024] 图3为sacR基因在提高L.lactisAL2产生的nisin的活性检测
【具体实施方式】
[0025] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0026] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0027]LB培养基（1000ml):用于大肠杆菌的培养，具体配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提 取物5g，NaCllOg，加ddH20定容至1000ml得到液体培养基。
[0028]S1培养基（1000ml):用于黄色微球菌NCIB8166的培养，具体配方如下：胰蛋白胨 8g，酵母粉 5g，葡萄糖 5g，NaC15g，Na2HP042g，Tween_201ml，加ddH20 定容至 1000ml得到液 体培养基。
[0029]GM17培养基（1000ml):用于乳酸乳球菌L.lactisAL2的培养，具体配方如下： 细菌蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母粉2. 5g，0 -磷酸甘油二钠19g，维生素C 0? 5g，1MMgS04lmL,葡萄糖5g，加ddH20定容至1000ml得到液体培养基。
[0030] 发酵培养基（l〇〇〇ml):用于乳酸乳球菌L.lactisAL2的发酵培养，具体配方如 下：蔗糖 16.9g，酵母粉 11.7g，大豆蛋白胨 16.7g，NaCl2.5g，MgS040.2g，KH2P0410g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0031] 上述培养基均为液体培养基，相对应的固体培养基要再加入15g琼脂粉。
[0032] 实施例1、sacR基因在提高nisin活性中的应用
[0033] 一、sacR基因的获得
[0034] (1)、基因组提取
[0035] 1.收集1. 0-1. 5ml过夜培养的稳定期的乳酸乳球菌AL2(lactococcuslactis 八12，《乳链菌肽高产菌株41^2的发酵条件研究》，微生物学通报，1995,22(4):215-218.公众 可从中国科学院微生物研究所获得）菌液。
[0036] 2. 12,OOOrpm，离心lmin，弃去上清。
[0037] 3.用10〇111含3〇11^/1111溶菌酶的了￡3 131^€61'重悬菌体沉淀，在371：下静置 30min〇
[0038] 4.加入600illlysisbuffer，颠倒离心管，轻轻混勻，在室温下放置 l〇-15min(直至澄清）。
[0039] 5?加入 10u1proteinaseK(10mg/ml)，37°C下放置 15min。
[0040] 6. 80°C加热5min，冷却至室温。
[0041] 7?加入200iil乙酸钠（3M，pH5. 2)，混勻，放置于冰上10-15min。
[0042] 8. 4°C，12,OOOrpm，离心 10min，沉淀蛋白至完全。
[0043] 9.小心吸取上清至新的离心管中，向其中加入等体积（约600ill)的异丙醇，轻轻 颠倒几次。
[0044] 10. 12,OOOrpm，离心 5min。
[0045] 11?弃去上清，加入1ml70%的乙醇洗涤沉淀（即DNA)，在室温下烘干。
[0046] 12.重悬DNA沉淀于30ii1双蒸水中。
[0047] 13.进行琼脂糖凝胶电泳分析。
[0048] 得到基因组DNA。
[0049] (2)、PCR克隆
[0050] 以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，扩增sacR基因。所用引物如下：
[0051] SacR-F(XbaI) ：5, -TGCTCTAGAGATGGGAGCTAAAAAAGTGATT~3,
[0052] SacR-R(PstI) :5, -TGCACTGCAGTTAATCTATACCATAATGTAGCTGA-3'
[0053] (下划线所示序列为酶切位点）
[0054] PCR反应体系为：
[0055] TranstartFastPfuDNA聚合酶（2. 5U/u1) 0. 7u1
[0056] 5XBuffer10u1
[0057] dNTP混合物 4u1
[0058] 基因组DNA模板1ill
[0059]引物SacR-F(lOmM) 2. 5u1
[0060] 引物SacR-R(lOmM) 2. 5u1
[0061] 双蒸水 30ill
[0062] PCR程序为：
[0063] 95°C预变性 5min;
[0064] 94°C45s，55°C30s，72°Clmin，30 个循环；
[0065] 72°C充分延伸lOmin。
[0066] 得到972bp的PCR产物，经过测序，其具有序列表中序列1所示的核苷酸，为sacR 基因，编码的蛋白命名为SacR，其氨基酸序列为序列表中序列2。
[0067] 二、表达sacR基因的重组菌的构建
[0068] (1)、重组载体构建
[0069] ?〇?产物回收：用&17§611?〇?回收试剂盒回收上述？〇?产物，并溶于40111去离 子水中。
[0070] 酶切及连接：用Xbal和PstI双酶切上述PCR产物及pMG36e载体 (constructionofalactococcalexpressionvector:expressionofhenegg whitelysozymeinlactococcuslactissubsp.lactis,AppliedandEnvironmental Microbiology, 1989, 55(1) :224-228.公众可从中国科学院微生物研究所获得），用T4连接 酶进行连接反应，用PCR回收试剂盒回收得到纯化的重组质粒。
[0071] 转化E.coli:将重组质粒点击转化E.coliMC1061，转化条件为：2mm，2. 5kv， 200Q，25yF。用红霉素浓度为500yg/ml的LB固体平板培养基培养，挑取单克隆至液体 培养基中放大培养并提取重组质粒。
[0072] 经过测序，重组质粒pMG36e_sacR为将序列表中序列1所示的核苷酸插入pMG36e 载体的Xbal和PstI双酶切位点间得到的载体。
[0073] (2)重组菌的获得
[0074] 将上述⑶的重组质粒pMG36e_sacR转化L.lactisAL2 :将1iig重组质粒 pMG36e-sacR转化L.lactisAL2,转化条件为 2mm，2. 5kv，200Q，25iiF。用红霉素浓度为 5yg/ml的GM17固体平板培养基培养，用PCR的方法筛选鉴定转化子，获得转化子用于下一 步分析。
[0075] 上述PCR扩增采用的引物为SacR-F和SacR-R，得到972bp的产物为阳性转化子， 命名为L.lactisAL2/pMG36e_sacR。
[0076] 采用同样的方法，将空载体pMG36e转入L.lactisAL2中，得到转空载体菌 L.lactisAL2/36e。
[0077] 三、sacR基因在提高L.lactisAL2产生的nisin的活性中的应用
[0078] 1、L.lactisAL2/pMG36e_sacR产生的nisin
[0079] 将上述获得的重组菌L.lactisAL2/pMG36e-sacR、对照菌株L.lactisAL2/36e 和L.lactisAL2在含有5yg/ml红霉素的250ml发酵培养基中进行发酵培养，培养条件 为 30°C，100rpm，在 511、711、911、15.511、25.511、28.511分别收集发酵液：取31111测定00_，另取 lml加入6.6yl浓盐酸，经酸化处理后放入-80°C保存，待测定抑菌活性。
[0080] 收集发酵终点的培养物，用Yang,R?等人的方法（Novelmethodtoextract largeamountsofbacteriocinsfromlacticacidbacteria,ApplEnvironMicrobiol, 1992,58(10) :3355-3359.)对发酵液中nisin进行提取，并用高效液相色谱进行分离纯 化-nisin所在峰的保留时间为19. 5min乙腈浓度为44-45%，如图1所示。质谱鉴定分子 量为 3329. 89,与nisinZ(GenBank:CAA43440. 1，09-AUG-1991.)的理论分子量 3329 -致， 可确定其为nisin，结果如图2所示。
[0081] 高效液相色谱纯化的条件如下：
[0082] C18 柱型号为Shim-packVP-0DS，内径 4.6mm，柱长 250mm，填充介质为C18 ;
[0083]流动相由A液和B液组成；
[0084]A液：由H20和三氟乙酸组成，三氟乙酸在A液中的体积百分含量为0. 1% ;
[0085] B液：由乙腈和三氟乙酸组成，三氟乙酸在B液中的体积百分含量为0. 1% ;
[0086] 流动相中B液的体积百分含量梯度为30% -50%，进行线性洗脱；
[0087] 上样量为500ul，流动相的流速lml/min;
[0088] 采用220nm和280nm的波长进行蛋白检测。
[0089] 2、sacR基因在提高L.lactisAL2产生的nisin的活性
[0090] 采用挖井扩散法测定nisin的抑菌活性，具体如下：
[0091] (1)指示菌平板的制备
[0092] 用含S1培养基的平板培养黄色微球菌NCIB8166 (记载在文献"Xiao,H.，X. Chen,M.Chen,S.Tang,X.Zhao,andL.Huan. 2004.BovicinHJ50,anovel1antibiotic producedbyStreptococcusbovisHJ50.Microbiology150:103-108."中，公众可从中国 科学院微生物研究所获得。），并在冰箱中放置20天左右，挑取两环黄色微球菌NCIB8166 于2mlLB培养基中，悬浮混匀，将2ml悬浮液加入融化的200mlS1固体培养基中混匀，倒 入20X30cm的平板中，平放，得到黄色微球菌NCIB8166的指示菌平板。
[0093] (2)发酵液处理
[0094] 上述每个时间点所取得的1ml发酵液，加入6. 6ill浓盐酸酸化处理，使发酵液 的pH为2以便吸附在细胞表面的nisin洗脱下来，并且nisin在酸性条件下比较稳定，处 理后的发酵液放入-80°C中保存。在测定抑菌圈之前从冰箱中取出，KKTC处理10min，冷 却至室温，12,OOOrpm离心lmin，取上清用0. 02M盐酸溶液稀释25倍后点抑菌圈，另外用 Nisin(sigmaN5764-1G)作为标准品，稀释成 150、100、90、60、50、40、30、20、15IU/ml备用。 [0095] (3)挖井并点样
[0096] 用打孔器在各指示菌平板上打出直径5mm的小孔，将15ul稀释后的发 酵液及nisin标准品溶液加入到小孔中，新鲜的发酵培养基为负对照，将平板放 入30°C培养箱中培养24h。培养之后测定抑菌圈直径，根据得到的nisin标准曲线 公式y= 1. 1504x2-7. 9262X+5. 6412 (y为稀释后的发酵液的抑菌活性，乘以25得原 液活性）计算相应样品的抑菌活性，计算结果如表1，比较改造菌株L.lactisAL2/ pMG36e-sacR(AL2/36e-sacR)和对照菌株L.lactisAL2/36e(AL2/36e)的抑菌活性。
[0097] 表 1
[0098]
【权利要求】
1. SacR蛋白或其编码基因或含有其编码基因的重组载体在提高乳酸乳球菌产生的乳 链菌肽的产量和/或活性中的应用； 所述SacR蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述提高乳酸乳球菌产生的乳链菌肽的 产量和/或活性体现在提高乳链菌肽的抑菌活性。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抑菌为抑制黄色微球菌。
4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于： 所述SacR蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
5. 根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述重组载体为将所述SacR蛋 白编码基因插入表达载体中，得到表达sacR蛋白的重组载体。
6. 根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于： 所述乳酸乳球菌为L. lactis AL2。
7. -种培育重组菌的方法，为将所述SacR蛋白编码基因导入目的菌，获得重组菌，所 述重组菌产生的乳链菌肽的活性大于所述目的菌。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述重组菌产生的乳链菌肽的活性大于 所述目的菌为所述重组菌产生的乳链菌肽的抑菌活性大于所述目的菌产生的乳链菌肽的 抑菌活性。
9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述抑菌为抑制黄色微球菌； 所述SacR蛋白编码基因的核苷酸序列为序列表中序列1。
10. 根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于： 所述SacR蛋白编码基因通过重组载体导入目的菌； 所述重组载体为将所述SacR蛋白编码基因插入表达载体中，得到表达SacR蛋白的重 组载体； 所述目的菌为乳酸乳球菌L. lactis AL2。
【文档编号】C12N15/31GK104387458SQ201410575541
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】钟瑾, 赵方圆 申请人:中国科学院微生物研究所