新的铁锌结合性调控因子以及通过其表达调节提高植物的耐缺铁性和促进可食用部分中 ...的制作方法
【专利摘要】根据本发明，提供在石灰质土壤中表现出比通常的植物更优良的生长、并且在石灰质土壤和优良土壤这两种土壤中均能够大量地蓄积铁和锌的转化体和基因破坏株、以及它们的制作中使用的基因、载体、蛋白质、抗体、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法/制作用组合物/制作用试剂盒/育种方法。本发明的蛋白质的特征在于，由下述(a)～(c)中任一种氨基酸序列构成，并且为铁锌结合性调控因子。(a)序列号1或2所示的氨基酸序列、(b)在序列号1或2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个～多个氨基酸而成的氨基酸序列、(c)与序列号1或2所示的氨基酸序列的同源性为80％以上的氨基酸序列。
【专利说明】新的铁锌结合性调控因子以及通过其表达调节提高植物的 耐缺铁性和促进可食用部分中的铁锌蓄积的技术
【技术领域】
[0001] 本发明涉及提高植物的耐缺铁性和促进可食用部分中的铁锌蓄积。详细而言，本 发明涉及具有对植物的耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积进行调控的作用的蛋白质、基 因、载体、转化体、基因破坏株、抗体、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的 制作方法、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用组合物、提高了耐 缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用试剂盒、以及提高了耐缺铁性和可食用 部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法。
[0002] 本申请要求以2012年7月26日在日本提出的特愿2012-166233号为基础的优先 权，将其内容援引到本发明中。
【背景技术】
[0003] 植物为了生长、进行碳固定和物质生产，需要铁和锌。植物通过吸收土壤中的铁和 锌来将它们加以利用。
[0004] 然而，在约占世界土壤的30%的石灰质碱性土壤中，可溶化的铁和锌少，其中，可 溶化的铁极少。因此，对于石灰质碱性土壤中的植物的生长而言，缺铁成为主要的制约因 素。
[0005] 因此，当务之急是获得在以石灰质碱性土壤为代表的不良土壤中也可良好生长的 植物。
[0006] 另外，从土壤中吸收铁和锌的植物是人类的主要的矿物质供给源。缺铁症和缺锌 症对于全世界的人类、特别是儿童和女性已经成为深刻的问题，因此，期望获得在可食用部 分中含有大量的铁和锌的植物。
[0007] 近年来，正在进行与铁和锌（特别是铁）的吸收和利用相关的基因的鉴定和分析。 已经获得了通过改变该基因并导入植物中而提高了耐缺铁性和耐缺锌性的植物、或在可食 用部分中蓄积有大量的铁和锌的植物（例如，参照非专利文献1?11)。
[0008] 现有技术文献 [0009] 非专利文献
[0010] 非专利文献 1 :Takahashi, M.，等，Nature Biotech.，（2001) vol. 19, ρρ· 466-469.
[0011] 非专利文献 2 :Ishimaru, Υ·，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2007) vol. 104, pp. 7373-7378.
[0012] 非专利文献 3 :Suzuki,M·，等，Soil Sci. Plant Nutr·, (2008) vol. 54,pp. 77-85.
[0013] 非专利文献4 :0go，Y.,等，Plant Mol. Biol. , (2011)vol. 75,pp. 593-605.
[0014] 非专利文献 5 :Goto, F.,等，Nature Biotech. , (1999) vol. 17, pp. 282-286.
[0015] 非专利文献 6 :Uauy,C·，等，Science, (2006) vol. 314, pp. 1298-1301.
[0016] 非专利文献 7 :Masuda, H.,等，Rice, (2008) vol. 1, pp. 100-108.
[0017] 非专利文献 8 :Masuda, H.,等，Rice, (2009) vol. 2, pp. 155-166.
[0018] 非专利文献 9 :Lee, S.，等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2009) vol. 106, pp. 22014-22019.
[0019] 非专利文献 10 :Wirth，J.,等，Plant Biotech. J. , (2009) vol. 7, pp. 1-14.
[0020] 非专利文献 11 :Ishimaru，Y.,等，Plant J. , (2010)vol. 62,pp. 379-390.
【发明内容】
[0021] 发明所要解决的问题
[0022] 但是，尚未获得在石灰质土壤中表现出与优良土壤中的生长同等程度或者更高程 度的生长的植物。另外，尚未获得在石灰质土壤和优良土壤这两种土壤中均能够大量地 (例如，以往的2倍量以上）蓄积铁和/或锌的植物。
[0023] 因此，从获得具有这种性质的植物的观点而言，还有改良的余地。
[0024] 本发明基于上述情况而完成，提供在石灰质土壤中表现出比通常的植物更优良的 生长、并且在石灰质土壤和优良土壤这两种土壤中均能够在可食用部分中大量地蓄积铁和 锌的转化体和基因破坏株、以及在它们的制作中使用的基因、载体、蛋白质、抗体、提高了耐 缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法、提高了耐缺铁性和可食用部分中的 铁锌蓄积的植物的制作用组合物、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制 作用试剂盒、以及提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法。所谓可 食用部分，可举出例如植物的种子、地上部分、茎叶、根等，只要是作为食用、饲料用而可食 用的部分，则不一定限定于这些部分。另外，在上述植物为水稻的情况下，可举出作为相当 于种子的部分的糙米、将糙米制成精米而得到的胚芽米、分解米、白米等。
[0025] 用于解决问题的手段
[0026] 本发明人为了解决上述问题而进行了深入研究，结果发现了具有抑制植物的缺铁 应答的作用的蛋白质。并且发现，通过制作抑制了编码该蛋白质的基因的表达的植物，能够 提高植物的耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积，从而完成了本发明。
[0027] S卩，本发明提供具有下述特征的蛋白质、基因、载体、转化体、基因破坏株、抗体、提 高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法、提高了耐缺铁性和可食用部 分中的铁锌蓄积的植物的制作用组合物、提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植 物的制作用试剂盒、以及提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法。
[0028] (1) 一种蛋白质，其特征在于，由下述（a)?（c)中任一种氨基酸序列构成，并且为 铁锌结合性调控因子，
[0029] (a)序列号1或2所示的氨基酸序列，
[0030] (b)在序列号1或2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个?多个氨基酸而成 的氨基酸序列，或者，
[0031] (C)与序列号1或2所示的氨基酸序列的同源性为80%以上的氨基酸序列。
[0032] (2) -种基因，其特征在于，编码上述（1)所述的蛋白质。
[0033] (3) -种基因，其特征在于，由下述⑷?（g)中任一种DNA构成，并且编码作为铁 锌结合性调控因子的蛋白质，
[0034] (d)由序列号3或4所示的碱基序列构成的DNA，
[0035] (e)由在序列号3或4所示的碱基序列中缺失、取代或添加一个?多个碱基而成的 碱基序列构成的DNA，
[0036] (f)由与序列号3或4所示的碱基序列的同源性为80%以上的碱基序列构成的 DNA，或者，
[0037] (g)由能够与由序列号3或4所示的碱基序列所构成的DNA的互补碱基序列构成 的DNA在严格的条件下杂交的碱基序列构成的DNA。
[0038] (4) -种载体，其特征在于，能够抑制上述⑵或⑶所述的基因的表达。
[0039] (5)如上述（4)所述的载体，其能够表达可在mRNA水平上抑制所述基因的表达的 RNAi诱导性核酸。
[0040] (6)如上述（5)所述的载体，其中，所述RNAi诱导性核酸为序列号5所示的碱基序 列。
[0041] (7) -种转化体，其特征在于，通过将上述（4)?（6)中任一项所述的载体导入宿 主中而形成。
[0042] (8) -种基因破坏株，其特征在于，具有上述（2)或（3)的基因由于整合插入序列 而被破坏的基因组DNA。
[0043] (9) 一种抗体，其特征在于，与上述（1)所述的蛋白质特异性地结合。
[0044] (10) -种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法，其特征 在于，包括将上述（4)?￠)中任一项所述的载体导入植物中的步骤。
[0045] (11) 一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用组合物，其 特征在于，包含上述（4)?（6)中任一项所述的载体。
[0046] (12) -种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用试剂盒，其 特征在于，包含上述（4)?（6)中任一项所述的载体。
[0047] (13) -种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法，其特征 在于，包括对来自植物的提取液中含有的上述（1)所述的蛋白质进行检测的步骤。
[0048] (14) 一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法，其特征 在于，包括对来自植物的提取液中含有的上述（2)或（3)所述的基因进行检测的步骤。
[0049] 发明效果
[0050] 根据本发明，能够制作出在石灰质土壤中表现出比通常的植物更优良的生长、在 石灰质土壤和优良土壤这两种土壤中均能够大量地蓄积铁和锌的转化体和基因破坏株。
[0051] 此外，根据本发明，能够有助于不良土壤中的碳酸固定、物质生产以及人类的铁锌 缺乏症的缓解。
【专利附图】
【附图说明】
[0052] 图1表示本发明的OsHRZl蛋白质和0sHRZ2蛋白质的域结构。
[0053] 图2表示本发明的基因破坏株中的基因组结构。
[0054] 图3表示具有蚯蚓血红蛋白域的蛋白质的系统树和域结构。
[0055] 图4表示使用定量RT-PCR得到的OsHRZl和0sHRZ2的mRNA的表达水平的分析结 果。
[0056] 图5表示所制作的重组蛋白的域结构。
[0057] 图6表示野生型和突变型OsHRZ蛋白质与金属的结合能力的分析结果。
[0058] 图7表示含有各重组蛋白溶解液的管的照片。
[0059] 图8表示0sHRZ2表达抑制株中的、使用定量RT-PCR得到的0sHRZ2的mRNA的表 达水平的分析结果。
[0060] 图9表示在缺铁栽培条件下的0sHRZ2表达抑制株的最新叶中的叶绿素含量的定 量结果。
[0061] 图10表示在石灰质土壤长期栽培下的0SHRZ2表达抑制株的最新叶中的叶绿素含 量的定量结果。
[0062] 图11表示在石灰质土壤中栽培28天下的未处理（NT)的稻和0sHRZ2表达抑制株 的株高的照片。
[0063] 图12表示OsHRZ破坏株中的基因组PCR的结果。
[0064] 图13表示在缺铁栽培条件下的OsHRZ破坏株的最新叶中的叶绿素含量的定量结 果。
[0065] 图14表示在铁充足条件下和缺铁条件下水培7天后的0sHRZ2表达抑制株的叶中 的蓄积铁浓度。
[0066] 图15表示在石灰质土壤中和通常的土壤中盆培后的0sHRZ2表达抑制株的稻杆中 的蓄积铁浓度。
[0067] 图16表示在石灰质土壤中和通常的土壤中盆培后的0sHRZ2表达抑制株的种子中 的蓄积铁浓度。
[0068] 图17表示在隔离田内的通常土壤中栽培后的0sHRZ2表达抑制株的糙米和白米中 的蓄积铁浓度。
[0069] 图18表示在石灰质土壤中和通常的土壤中盆培后的0sHRZ2表达抑制株的种子中 的蓄积锌浓度。
[0070] 图19表示在隔离田内的通常土壤中栽培后的0sHRZ2表达抑制株的糙米和白米中 的蓄积锌浓度。
[0071] 图20表示在通常的土壤中盆培后的OsHRZ破坏株的种子中的蓄积铁浓度。
[0072] 图21表示在通常的土壤中盆培后的OsHRZ破坏株的种子中的蓄积锌浓度。
[0073] 图22表示在通常的土壤中盆培后的OsHRZ破坏株的稻杆中的蓄积铁浓度。
[0074] 图23表示在通常的土壤中盆培后的OsHRZ破坏株的稻杆中的蓄积锌浓度。
[0075] 图24表示在铁充足条件下和缺铁条件下水培后的0sHRZ2表达抑制株的根中的、 使用44K微阵列得到的基因表达谱的分析结果。
[0076] 图25表不通过微阵列分析，对于在铁充足条件下的0sHRZ2表达抑制株的根中确 认到表达上升的基因，使用定量RT-PCR进行验证的结果。
【具体实施方式】
[0077] 〈OsHRZ 蛋白质〉
[0078] 本发明的蛋白质由下述（a)?（c)中任一种氨基酸序列构成，并且为铁锌结合性 调控因子。
[0079] (a)序列号1或2所示的氨基酸序列，
[0080] (b)在序列号1或2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个?多个氨基酸而成 的氨基酸序列，或者，
[0081] (C)与序列号1或2所示的氨基酸序列的同源性为80%以上的氨基酸序列。
[0082] 上述（a)的氨基酸序列为序列号1或2所示的氨基酸序列。
[0083] 本发明人将由序列号1和2所示的氨基酸序列构成的蛋白质分别命名为包含 水稻虫丘蝴血红蛋白模体的真正感兴趣新基因型锌指蛋白（Oryza sativa Hemerythrin motif-containing Really Interesting New Gene (RING)-and Zinc-finger protein,以下 称为 OsHRZ) 1 和 0sHRZ2。
[0084] 如图1所示，OsHRZl从N末端侧到C末端侧包括：三个推定的蚯蚓血红蛋白（也作 为HHE而公知）结构域、推测参与转录调控/转录后调控/蛋白质分解调控等的两个Zn指 结构域（CHY样Zn指结构域和CTCHY样Zn指结构域）、作为E3连接酶起作用而参与蛋白质 分解调控的RING-Zn指结构域和推测为了传递电子而形成铁硫簇的红素氧还蛋白样模体。
[0085] 另外，如图1所示，0sHRZ2从N末端侧到C末端侧包括：一个蚯蚓血红蛋白结构域、 三个Zn指结构域（CHY样Zn指结构域、CTCHY样Zn指结构域和RING-Zn指结构域）和红 素氧还蛋白样模体。
[0086] 在缺铁栽培条件下，编码这些OsHRZ蛋白质的基因的表达被诱导。
[0087] 认为植物中合成的OsHRZ蛋白质通过蚯蚓血红蛋白结构域与铁和锌结合，作为对 植物细胞内的铁与其他金属的浓度比进行检测的铁传感器起作用。
[0088] 此外，OsHRZl和0sHRZ2蛋白质通过推测参与转录调控/转录后调控/蛋白质分 解调控等的上述三个Zn指结构域，主要在铁充足条件的栽培下抑制铁摄取相关基因和铁 迁移相关基因的表达。
[0089] 作为上述（b)，例如可举出：在蚯蚓血红蛋白结构域以外的部位具有突变（缺失、 插入、取代或添加）的蛋白质、或者具有位于蚯蚓血红蛋白结构域且保持铁锌结合活性的 突变的蛋白质。
[0090] 另外，作为上述（b)，可举出例如：在推测参与转录调控/转录后调控/蛋白质分 解调控等的上述三个Zn指结构域以外的部位具有突变的蛋白质、或者具有位于上述Zn指 结构域且保持铁摄取相关基因和铁迁移相关基因的表达抑制能力的突变的蛋白质。
[0091] 在此，作为可以被缺失、取代或添加的氨基酸的数量，优选1?10个，更优选1? 7个，进一步优选1?5个，特别优选1?3个，最优选1?2个。
[0092] 构成本发明的蛋白质的氨基酸序列中，对一个或多个氨基酸引入突变可以使用公 知技术容易地进行。
[0093] 例如，根据公知的定点诱变法，可以使编码蛋白质的基因中的任意碱基发生突变。 另外，可以设计与编码蛋白质的基因中的任意部位对应的引物来制作缺失突变体或者添加 突变体。
[0094] 作为上述（c)，可举出例如：在蚯蚓血红蛋白结构域以外的部位具有突变（缺失、 插入、取代或添加）的蛋白质、或者具有位于蚯蚓血红蛋白结构域且保持铁锌结合活性的 突变的蛋白质。
[0095] 另外，上述（c)，可举出例如：在推测参与转录调控/转录后调控/蛋白质分解调 控等的上述三个Zn指结构域以外的部位具有突变的蛋白质、或者具有位于上述Zn指结构 域且保持铁摄取相关基因和铁迁移相关基因的表达抑制能力的突变的蛋白质。
[0096] 在此，作为与序列号1或2所示的氨基酸序列的同源性（氨基酸序列的同源性）， 优选为80 %以上，更优选85 %以上，进一步优选90 %以上，特别优选95 %以上，最优选98 % 以上。
[0097] 作为表达本发明的蛋白质中使用的表达载体，可举出：在宿主细胞中表达本发明 的蛋白质的细胞系载体、和在由从适当的细胞提取出的具有蛋白质合成能力的成分构成的 蛋白质翻译系统中表达本发明的蛋白质的无细胞系载体。
[0098] 作为细胞系载体，可以使用适合宿主细胞的公知的表达载体。例如可举出大肠杆 菌中以PBR322诱导体为代表的ColEI系质粒、具有pl5A起点的pACYC系质粒、pSC系质粒、 来源于Bac系等的F因子的mini-F质粒。此外，还可以举出具有trc、tac等色氨酸启动 子、lac启动子、T7启动子、T5启动子、T3启动子、SP6启动子、阿拉伯糖诱导启动子、冷休 克启动子、四环素诱导性启动子等的表达载体。
[0099] 作为无细胞系载体，可举出在细胞系载体中列举的具有T7启动子的表达载体、具 有T3启动子的表达载体；具有SP6启动子或T7启动子的pEU系质粒等小麦无细胞蛋白质 合成用载体等。
[0100] 使用无细胞系载体的蛋白质合成中，首先，使用转录系统对cDNA进行转录，合成 mRNA。作为该转录系统，可举出利用RNA聚合酶进行转录的现有公知的转录系统。作为RNA 聚合酶，可举出例如T7RNA聚合酶。
[0101] 接着，使用作为翻译系统的无细胞蛋白质合成系统对mRNA进行翻译，从而合成蛋 白质。该系统中包含核糖体、翻译起始因子、翻译延伸因子、解离因子、氨酰-tRNA合成酶等 翻译所必需的要素。作为这样的蛋白质翻译系统，可举出：大肠杆菌提取液、兔网织红细胞 提取液、小麦胚芽提取液等。
[0102] 此外，还可举出上述翻译所必需的要素仅由独立纯化的因子构成的再构成型无细 胞蛋白质合成系统。
[0103] 使用细胞系载体或无细胞系载体合成的蛋白质可以在细胞成分提取液中使用，也 可以纯化后再使用。作为纯化方法，可举出盐析法、使用各种层析法的方法。在表达载体以 在目的蛋白质的N末端或C末端表达组氨酸标签等标签序列的方式设计的情况下，可举出 使用镍、钴等对该标签具有亲和性的物质的利用亲和柱的纯化方法。此外，也可以通过将离 子交换层析法、凝胶过滤层析法等适当组合后进行纯化来提高本发明的蛋白质的纯度。
[0104] 〈OsHRZ 基因〉
[0105] 本发明的基因编码由上述（a)?（c)中任一种氨基酸序列构成且为铁锌结合性调 控因子的蛋白质。
[0106] 另外，本发明的基因编码由以下的（d)?（g)中任一种DNA构成且为铁锌结合性 调控因子的蛋白质。
[0107] (d)由序列号3或4所示的碱基序列构成的DNA，
[0108] (e)由在序列号3或4所示的碱基序列中缺失、取代或添加一个?多个碱基而成的 碱基序列构成的DNA，
[0109] (f)由与序列号3或4所示的碱基序列的同源性（碱基序列的同源性）为80%以 上、优选为85%以上、更优选为90%以上、进一步优选为95%以上、特别优选为98%以上的 碱基序列构成的DNA，或者，
[0110] (g)由能够与由序列号3或4所示的碱基序列构成的DNA的互补碱基序列构成的 DNA在严格的条件下杂交的碱基序列构成的DNA。
[0111] 在此，作为可以被缺失、取代或添加的碱基的数量，优选1?30个，更优选1?20 个，进一步优选1?15个，特别优选1?10个，最优选1?5个。
[0112] 本发明和本申请说明书中，所谓"在严格的条件下"，例如可举出Mo 1 e cu 1 ar Cloning-A LABORATORY MANUAL (分子克隆实验指南）第三版（Sambrook等、冷泉港实验室 出版社）中记载的方法。例如可举出通过在由5XSSC(20XSSC的组成：3M氯化钠、0. 3M柠 檬酸溶液、PH7. 0)、0. 1重量％ N-月桂酰肌氨酸、0. 02重量％的SDS、2重量％的核酸杂交 用封闭试剂和50%甲酰胺构成的杂交缓冲液中在55?70°C下进行数小时至过夜的温育来 进行杂交的条件。作为温育后的洗涤时使用的洗涤缓冲液，优选为含有〇. 1重量％ SDS的 1 X SSC溶液、更优选为含有0. 1重量％ SDS的0. 1 X SSC溶液。
[0113] 〈OsHRZ基因表达抑制载体〉
[0114] 本发明的载体为能够抑制上述的本发明的基因的表达的载体。优选能够表达可在 mRNA水平抑制上述基因的表达的RNAi诱导性核酸。
[0115] RNAi诱导性核酸是指通过导入到植物细胞内而能够诱导RNA干扰的核酸。所谓 RNA干扰是指，含有与mRNA (或其部分序列）互补的碱基序列的RNA抑制该mRNA的表达的 效果。
[0116] RNAi诱导性核酸的作为标靶的mRNA可以是编码区，也可以是非编码区。作为 上述RNAi诱导性核酸，优选为序列号5所示的碱基序列，该RNAi诱导性核酸以OsHRZ的 3' UTR(untranslated region,非翻译区）全长和编码区的一部分作为标革巴。
[0117] 另外，作为RNAi诱导性核酸，例如可举出siRNA、miRNA。作为导入到植物细胞内、 与 siRNA 同样地引起RNAi 的载体,可举出 shRNA(short hairpin RNA/small hairpin RNA， 短发夹RNA/小发夹RNA)表达载体。
[0118] 利用本发明的载体，能够提高植物的耐缺铁性和铁锌蓄积。
[0119] 在此，"植物的耐缺铁性"是指即使在可溶化的铁分少的土壤中也能生长的特性， 例如，在碱性土壤中不易发生称为萎黄病（由于叶绿素缺陷导致的黄色化）的缺铁症的等 特性。
[0120] 另外，"铁锌蓄积"是指能够在稻的地上部、特别是作为可食用部分的种子中蓄积 高浓度的铁和锌的特性。例如，将使用上述载体制作的转化体在隔离田（是指基于规定的 手续而设置的基因重组用的隔离田）内的普通土壤中栽培而得到的种子与未处理的稻的 种子相比，含有约3. 8倍量的铁，含有约1. 2倍量的锌。
[0121] 本发明的载体可以利用公知的基因重组技术来制作。
[0122] 〈转化体及耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作方法〉
[0123] 本发明的转化体（有时也称为表达抑制株）是将本发明的载体导入宿主中而得到 的。如上所述，本发明的载体能够使作为宿主的植物的耐缺铁性和铁锌蓄积提高。因此，本 发明的转化体的耐缺铁性优良，并且特别是能够在可食用部分中蓄积高浓度的铁锌。
[0124] 另外，本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作方法是指用于制作耐 缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物体的方法。本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植 物的制作方法只要包含将本发明的载体导入植物体内的步骤，则没有特别限定。
[0125] 在使用重组表达载体的情况下，植物体的转化中应使用的载体只要是能够在该植 物内抑制本发明的基因的表达的载体，则没有特别限定。
[0126] 作为这样的载体，例如可举出：具有花椰菜花叶病毒的35S启动子等在植物细胞 内使基因进行结构性表达的启动子的载体；具有因外部刺激而诱导性活化的启动子的载 体。
[0127] 本发明中作为转化对象的植物表示整个植物体、植物器官（例如叶、花瓣、茎、根、 种子等）、植物组织（例如表皮、韧皮部、柔软组织、木质部、维管束、栅栏组织、海绵组织等） 或植物培养细胞、或者各种形式的植物细胞（例如，悬浮培养细胞）、原生质体、叶的切片、 愈伤组织等中的任意一种。作为转化中使用的植物，没有特别限定，优选为稻科植物，更优 选为稻、大麦、小麦或玉米。
[0128] 基因向植物中的导入可以使用本领域技术人员公知的转化方法（例如，土壤杆菌 法、基因枪、PEG法、电穿孔法等），大致分为土壤杆菌介导的方法和直接导入植物细胞的方 法。使用土壤杆菌法时，可以使用将构建的植物用表达载体导入适当的土壤杆菌（例如，根 癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens))中，依照叶盘法（内宫博文著、植物基因操作 指南（1990)27?31页、讲谈社SCIENTIFIC、东京）等使该菌株感染无菌培养叶片，从而得 到转化植物的方法。
[0129] 另外，可以使用 Nagel 等的方法（Micribiol. Lett.，（1990)νο1· 67, pp325)。该 方法为如下方法：首先，将表达载体导入土壤杆菌，接着，将转化后的土壤杆菌用Plant Molecular Biology Manual (植物分子生物学指南）（S.B.Gelvin等、学术出版社出版）中 记载的方法导入植物细胞或植物组织中。在此，"植物组织"包括通过植物细胞的培养得 到的愈伤组织。使用土壤杆菌法进行转化时，可以使用pBI系的双元载体（例如，pBIG、 pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221 和 pPZP202 等）。
[0130] 另外，作为将基因直接导入植物细胞或植物组织的方法，可举出电穿孔法、基因枪 法等。使用基因枪时，作为导入基因的对象，可以直接使用植物体、植物器官、植物组织本 身，也可以制备切片后使用，还可以制备原生质体后使用。可以使用基因导入装置（例如 PDS-1000 (伯乐公司）等）对这样制备的试样进行处理。处理条件因植物或试样而异，通常 以约450?2000psi的压力、约4?12cm的距离进行。
[0131] 对于基因导入后的细胞或植物组织，首先利用潮霉素抗性等药剂抗性进行选择， 接着通过常规方法再生为植物体。从转化细胞向植物体的再生可以根据植物细胞的种类通 过本领域技术人员公知的方法来进行。作为选择标记物，并不限定于潮霉素抗性，例如可举 出对博莱霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的抗药性。
[0132] 在使用植物培养细胞作为宿主的情况下，例如可举出显微注射法、电穿孔法、聚乙 二醇法、基因枪（粒子枪）法、原生质体融合法、磷酸钙法等。通过这些方法将重组载体导 入培养细胞而进行转化。作为转化结果而得到的愈伤组织、根、毛状根等可以直接用于细胞 培养、组织培养或器官培养。可以使用这些现有公知的植物组织培养法，通过施用适当浓度 的植物激素（生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯、芸苔素内酯等）等使其再生为植 物体。
[0133] 基因是否已被导入植物可以通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等进 行确认。例如，由转化植物制备DNA，设计DNA特异性引物并进行PCR。PCR可以在本领域技 术人员公知的条件下进行。然后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或 毛细管电泳等，利用溴化乙锭、SYBR Green液等进行染色。然后，使扩增产物成为单链来进 行检测，由此可以确认已被转化。另外，也可以使用预先由荧光色素等标记的引物进行PCR 并检测扩增产物。此外，还可以采用使扩增产物结合到微孔板等固相上、利用荧光或酶反应 等来确认扩增产物的方法。
[0134] -旦获得在基因组内整合有本发明的载体的转化植物体，则可以通过该植物体的 有性生殖或无性生殖获得后代。另外，可以由上述植物体或其后代、或者它们的克隆得到例 如种子、果实、穗、块茎、块根、根株、愈伤组织、原生质体等，并在它们的基础上大量生产上 述植物体。
[0135] 因此，本发明的转化体也包括以可表达的方式导入有本发明的载体的植物体、或 与该植物体具有相同性质的上述植物体的后代、或者来源于它们的组织。
[0136] 〈基因破坏株〉
[0137] 本发明的基因破坏株通过整合插入序列而具有本发明的基因被破坏的基因组 DNA。例如，如图2所示，通过利用同源重组使T-DNA(hrzl-l)插入到基因组DNA中、或者通 过转座子（hrz2-l)的转移，使基因组DNA上存在的本发明的基因被破坏，从而使其表达被 抑制。
[0138] 利用本发明的基因破坏株，本发明的基因和蛋白质的表达被抑制。因此，铁摄取相 关基因、铁迁移相关基因的稳定表达抑制被解除，能够提商植物中的耐缺铁性和铁锋畜积。
[0139] 作为本发明的基因破坏株，优选Tosl7插入株ND6059(稻基因组资源中心）。该插 入株不是转化植物，因此，从可在一般的田地中快速生长的方面而言优良。
[0140] 本发明的转化体和基因破坏株除了如上所述可食用部分中的铁锌蓄积的显著提 高，还兼具优良的耐缺铁性。因此，对于在半干燥地带、石灰质土壤等容易潜在缺铁的栽培 条件下稳定地生产富铁食物而言是特别有用的。
[0141] 〈耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用组合物、以及制作用试剂盒〉
[0142] 本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用组合物含有本发明的载 体。另外，本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用试剂盒包括本发明的载 体。在此，"组合物"是指各种成分含有在一种物质中的方式。"试剂盒"是指各种成分中的 至少一种含有在另一物质中的方式。
[0143] 另外，"耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用组合物"为用于制作耐缺铁 性和铁锌蓄积得到提高的植物体的组合物。"耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作 用试剂盒"为用于制作耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的试剂盒。
[0144] 本发明的转化体通过将本发明的载体导入宿主（植物）而得到。由此，本发明的 基因的表达被抑制，耐缺铁性和铁锌蓄积能够提高。并且，如上所述，如果使用本发明的载 体，则能够将本发明的载体导入植物体中。因此，包括本发明的载体的组合物或包括载体的 试剂盒优选用于制作耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物。
[0145] 即，本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用组合物、或耐缺铁性 和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用试剂盒可以作为上述的本发明的耐缺铁性和铁锌蓄 积得到提高的植物的制作方法中的载体的供给源使用。
[0146] 本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用组合物除了包括本发明 的载体以外，还可以包括溶剂、分散介质、试剂等。
[0147] 另外，本发明的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的制作用试剂盒除了包括本 发明的载体以外，还可以包括溶剂、分散介质、试剂、用于使用它们的说明书等。在此，本发 明的试剂盒中，除说明书以外还"包括"溶剂等是指包含在构成试剂盒的各个容器（例如， 瓶、板、管、碟等）中的任意一种的内部。
[0148] 另外，本发明的试剂盒例如可以将物质A和物质B混合包括在同一容器内，可以包 括在分开的容器内。"说明书"可以书写在纸或其他介质上，也可以印刷在纸或其他介质上， 或者还可以附于磁带、计算机可读磁盘或磁带、CD-ROM等这样的电子介质上。另外，本发明 的试剂盒可以包括内包有稀释剂、溶剂、洗涤液、其他试剂的容器。
[0149] 〈抗体〉
[0150] 本发明的抗体只要是与本发明的蛋白质特异性结合的抗体，则没有限定，可以为 针对上述蛋白质的多克隆抗体等，但优选为针对上述蛋白质的单克隆抗体。单克隆抗体从 下述方面而言优良：具有性质均匀且易于供给，可以将其产生细胞以杂交瘤的形式半永久 地保存等。
[0151] 作为本发明的抗体，可举出免疫球蛋白（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM和它们的Fab片 段、F(ab'）2片段、Fc片段），具体而言，可举出多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体和抗独特 型抗体等，但不限定于这些。
[0152] 需要说明的是，本发明的抗体可以依照各种公知的方法来制作。例如，单克隆抗体 可以通过使用该领域中公知的技术（例如，杂交瘤法（Kohler, G.和Milstein，C.，Nature 256, 495-497 (1975))、三瘤体法、人类 B-细胞杂交瘤法（Kozbor, Immunology Today 4, 72 (I983))和 EBV-杂交瘤法（参照 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss，Inc.，77-96(1985))等）来制作。
[0153] 另外，肽抗体可以依照该领域中公知的方法（例如，Chow, Μ·，等，Proc. Natl. Acad. Sci.USA(1985)vol. 82, ρρ· 910-914 ;Bittle，F.J.等，J. Gen. Virol. (1985) vol. 66, pp2347-2354)来制作。
[0154] 本发明的抗体如上所述包括Fab片段、F(ab'）2片段等片段。这样的片段代表地 可以通过使用木瓜蛋白酶（生成Fab片段）或胃蛋白酶（生成F(ab'）2片段）等酶对抗体 进行蛋白质分解来产生。
[0155] 或者，这样的片段可以通过应用重组DNA技术或化学合成来产生。
[0156] 〈育种方法〉
[0157] [第一实施方式]
[0158] 本实施方式的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的育种方法包括对提取自植 物的提取物中含有的本发明的蛋白质进行检测的步骤。
[0159] 本实施方式的耐缺铁性和铁锌蓄积得到提高的植物的育种方法只要包括为了判 断在植物体内本发明的蛋白质的表达是否被抑制而对本发明的蛋白质进行检测的步骤即 可。基于本发明的蛋白质的表达的有无，筛选具有耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的 植物。
[0160] 如上所述，本发明的蛋白质抑制在植物从土壤中获得铁时具有重要作用的基因的 表达。因此，上述蛋白质的表达被抑制的植物获得铁的能力高，耐缺铁性和铁锌蓄积提高。
[0161] 另外，依照本实施方式的方法育种得到的植物体可以为天然的植物体，也可以为 转化体。
[0162] 提取自植物的提取物可以使用利用液体氮气的冷冻破碎法、市售的提取试剂盒来 获得，但并不限定于此。另外，"提取物"可以为粗提纯物，也可以为经过若干纯化步骤后的 纯化标准品。
[0163] 本实施方式的育种方法中，作为上述对提取自植物的提取物中含有的本发明的蛋 白质进行检测的步骤，可举出通过使提取自该植物的提取物与本发明的抗体反应来对本发 明的蛋白质进行检测的步骤。如上所述，上述抗体与本发明的蛋白质特异性结合而形成免 疫复合物，因此，通过检测该复合物的形成，能够容易地检测在植物体内表达的上述蛋白 质。
[0164] 上述复合物的形成例如使用将上述抗体预先用同位素等标记的方法、或者使用针 对上述抗体的二次抗体的方法等来检测。具体而言，可以使用公知的蛋白免疫印迹法、蛋白 芯片法等。
[0165] 另外，本发明的抗体优选用于本实施方式的耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积 得到提高的植物的育种方法。因此，含有本发明的抗体的组合物或者包括上述抗体的试剂 盒优选用于耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积得到提高的植物的育种。
[0166] [第二实施方式]
[0167] 本实施方式的植物的育种方法包括对提取自植物的提取物中含有的本发明的基 因进行检测的步骤。
[0168] 上述对提取自植物的提取物中含有的本发明的基因进行检测的步骤优选包括将 本发明的基因的片段或由其互补序列构成的寡核苷酸与上述提取自植物的提取物进行温 育的步骤，更优选包括使提取自植物的提取物与来源于目标植物的基因组DNA、mRNA或针 对mRNA的cDNA杂交的步骤。
[0169] 通过使用本实施方式的育种方法对杂交后的靶基因进行检测，能够容易地检测本 发明的基因的表达被抑制的植物体。
[0170] 此外，如上所述，本发明的蛋白质在植物体对缺铁的应答中发挥重要的作用。因 此，上述蛋白质的氨基酸序列的微小突变可能会给植物的耐缺铁性和可食用部分中的铁锌 蓄积带来影响。通过使用PCR法、杂交法、微阵列法等公知惯用的技术，能够检测基因的一 个碱基单元的突变，因此，利用这些技术，能够检测上述基因所编码的蛋白质的氨基酸序列 的微小突变。
[0171] 因此，通过使用本实施方式的植物的育种方法，基于给植物的耐缺铁性和可食用 部分中的铁锌蓄积带来影响的上述蛋白质的氨基酸序列的微小突变，也能够对植物的耐缺 铁性和可食用部分中的铁锌蓄积得到提高的植物进行育种。
[0172] 本实施方式中，寡核苷酸是指数个至数十个或者数百个核苷酸结合而成的物质。
[0173] 本实施方式的育种方法中使用的寡核苷酸可以作为用于得到本发明的基因或其 片段的PCR引物或者杂交探针来使用。
[0174] 作为本实施方式中使用的寡核苷酸的长度，优选7个碱基以上，更优选15个碱基 以上，进一步优选20个碱基以上，最优选40个碱基以上。这些寡核苷酸例如利用应用生物 公司的（ABI，林肯中心道850号，福斯特市，CA 94404) 392型合成仪等来合成。
[0175] 这样，通过将本实施方式的育种方法中使用的寡核苷酸作为检测编码本发明的蛋 白质的基因的杂交探针、或者用于扩增上述基因的引物来利用，能够容易地检测本发明的 基因的表达被抑制的植物体或组织。
[0176] [实施例]
[0177] 下面示出实施例进一步详细说明本发明，但本发明不限定于以下的实施例。
[0178] [来源于稻的新的铁结合蛋白质的鉴定]
[0179] 本发明人使用微阵列对缺铁诱导性基因群进行了分析（0go，Y.，等，J.Exp. Bot. (2006) vol. 57, pp. 2867-2878)。着眼于这些基因群中作为铁传感器的一个候选基因 AK068028(NCBI的收录号：序列号4)。如上所述，该基因包含编码推定的蚯蚓血红蛋白（也 作为HHE被公知）结构域的基因（参照图1)。蚯蚓血红蛋白结构域在无脊椎动物、细菌和 哺乳类中具有保守性，已知其与二价铁和分子态氧结合。
[0180] 无脊椎动物中，具有蚯蚓血红蛋白结构域的蛋白质作为输送氧的蛋白质起作用。
[0181] 另一方面，对于人类而言，作为具有蚯蚓血红蛋白结构域的蛋白质，已知有 人类FBXL5蛋白质（参照图3)。已知人类FBXL5蛋白质中蚯蚓血红蛋白结构域作为 铁传感器起作用，FBXL5通过作为泛素-蛋白酶体系统的E3连接酶起作用的F-盒结 构域来识别铁调节蛋白2(Iron Regulatory Protein 2;以下称为IRP2)并将其分解 (Rouault, T. A.，Science(2009)vol. 326, ρρ· 676-677 ;Vashisht，A.，等，Science (2009) vol. 326, ρρ· 718-721 ;Salahudeen，A. A.，等，Science (2009) vol. 326, ρρ· 722-726)。
[0182] 有趣的是，序列号4所示的基因所编码的蛋白质不含F-盒结构域，但包含与F-盒 结构域同样作为E3连接酶起作用的RING-Zn指结构域（参照图1)。序列号4所示的基因 所编码的蛋白质包含推测参与转录调控/转录后调控/蛋白质分解调控等的两个其他Zn 指结构域和、推测为了传递电子而形成铁硫簇的红素氧还蛋白样模体（参照图1)。
[0183] 通过数据库检索，在稻中进一步找到了 2个包含编码蚯蚓血红蛋白结构域的基因 的基因（参照图3 ;0sH0RZl和后述的OsHRZl)，在拟南芥中找到了 4个（参照图3 ;BTS、 At3g54290、Atlg74770、Atlgl8910)。这些基因中，AK288394(NCBI 的收录号：序列号 3)所 编码的蛋白质含有序列号4所示的基因所编码的蛋白质具有的全部域结构，并且进一步具 有2个蚯蚓血红蛋白结构域（参照图1)。
[0184] 因此，本发明人将序列号3和4所示的基因所编码的蛋白质分别命名为"包含 水稻虫丘蝴血红蛋白模体的真正感兴趣新基因型锌指蛋白"（Oryza sativa Hemerythrin motif-containing Really Interesting New Gene (RING)-and Zinc-finger protein,以下 称为 OsHRZ) 1 和 0sHRZ2。
[0185] 从稻栽培品种"月之光"的cDNA池中使用PCR扩增OsHRZl和0sHRZ2的cDNA，将 该扩增产物插入PCR(注册商标）_Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0(注册商标）载体中，确认碱基序列。
[0186] [应答于缺铁栽培条件的OsHRZl和0sHRZ2的表达水平的变化]
[0187] 使用定量RT-PCR对稻品种"日本晴"的叶和根中的、铁充足条件下和缺铁条件下 的OsHRZl和0sHRZ2的mRNA的表达水平的变化进行分析。
[0188] 详细而言，对于提取自水培的稻的根或叶身中的RNA样品，使用Nuc 1 eoSpin植物 RNA小量制备试剂盒（MACHEREY-NAGEL公司制造）和ReverTra Ace逆转录酶（Τ0Υ0Β0公司 制造）、或者RNeasy植物小量制备试剂盒（凯杰公司制造）和含gDNA去除剂的ReverTra Ace qRT-PCR RT Master混合物（TOYOBO公司制造），使用DNasel进行处理，供于逆转录 反应。接着，使用通过逆转录反应合成的cDNA，利用StepOnePlus (商标）实时PCR系统 (应用生物系统公司制造）进行实时PCR。作为试剂，使用SYBR Green I和ExTaq (商标） Real-Time-PCR version (TaKaRa 公司制造）、或者 TaqMan Gene Expression Assays (应用 生物系统公司制造）。以稻α-2微管蛋白的转录水平对作为目标的转录产物的量进行修 正，以每1 μ g总RNA的拷贝数来表示。
[0189] 将结果示于图4。图4的图横轴表示铁充足条件下和缺铁条件下的栽培天数。+7d 表示来源于铁充足条件下栽培7天后的稻的样品，-Id表示来源于缺铁条件下栽培1天后 的稻的样品，_7d表示来源于缺铁条件下栽培7天后的稻的样品。图4的图纵轴表示每 1 μ gRNA的OsHRZl或0sHRZ2的拷贝数。图4(a)为表示根中的表达水平的图，图4(b)为表 示叶中的表达水平的图。图4左边为表示OsHRZl的表达水平的图，图4右边为表示0sHRZ2 的表达水平的图。另外，在以下的实施例中，通过t检验对显著差异进行检验。在以下的图 中，* 表示 P〈〇. 05, ** 表示 P〈0. 01。
[0190] 如图4所示，对于叶和根两者，在缺铁条件下均确认到OsHRZl和0sHRZ2的mRNA 的表达水平的上升。
[0191] [重组OsHRZl蛋白质和0sHRZ2蛋白质的铁结合能力的评价]
[0192] 植物来源的蚯蚓血红蛋白结构域是否具有与铁结合的能力还不得而知。本发明人 首先制作了将在编码麦芽糖结合蛋白（MBP)的基因的下游连接有全长HRZ基因或HRZ缺失 突变基因的基因插入PMAL-C2 (新英格兰生物实验室公司制造）而得到的表达载体。
[0193] 接着，使这些融合有麦芽糖结合蛋白（MBP)的OsHRZ重组蛋白的多种缺失突变体 在大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS中表达来制作。重组蛋白的表达纯化使用MBP融合系统（新 英格兰生物实验室公司制造）。将大肠杆菌在22°C?25°C下培养并且从柱缓冲液中除去 EDTA，除此以外，依照指导手册进行。将重组蛋白供于SDS-PAGE进行分离后，通过考马斯亮 蓝染色确认重组蛋白的纯度。将表达的重组蛋白使用ro-10柱（GE health care公司制 造）脱盐后，使用阴离子交换柱（Q-琼脂糖；GE health care公司制造）进行纯化。制成 的重组蛋白的域结构示于图5。
[0194] 图5中，OsHRZl FL表示OsHRZl蛋白全长，OsHRZl Λ RZ表示从OsHRZl蛋白质全 长中使包含位于C末端侧的第3个蚯蚓血红蛋白结构域、推测参与转录调控/转录后调控 /蛋白质分解调控等的三个Zn指结构域和推测为了传递电子而形成铁硫簇的红素氧还蛋 白样模体的C末端结构域缺失的蛋白质。OsHRZl Λ Η表示从OsHRZl蛋白质全长中使包含 全部三个蚯蚓血红蛋白结构域的N末端结构域缺失的蛋白质。OsHRZl Λ HRZ表示从OsHRZl 蛋白质全长中使包含位于N末端侧的全部2个蚯蚓血红蛋白结构域的N末端结构域以及包 含位于C末端侧的第3个蚯蚓血红蛋白结构域、三个Zn指结构域和红素氧还蛋白样模体的 C末端结构域缺失的蛋白质。
[0195] 图5中，〇8服22?1^表示〇8服22蛋白质全长，〇8服21八!1表示从〇8服22蛋白质全 长中使包含蚯蚓血红蛋白结构域的N末端结构域缺失的蛋白质。BTS FL表示OsHRZl和 0sHRZ2的拟南芥同系物的蛋白质全长（参照图3)。
[0196] 通过感应耦合发射光谱测定结合在这些蛋白质上的金属浓度。详细而言，使用伯 乐蛋白分析试剂盒（伯乐公司制造）对纯化后的蛋白质进行定量，使用MarsXpress烘箱 (CEM公司制造）将0. 1?lmg的纯化蛋白溶解液用2mL 13. 4M ΗΝ03在220°C下处理20分 钟，进行湿法灰化。使用ICP发光分析装置（ICPS-8100 ;岛津制作所制造）测定铁和锌的 摩尔浓度。结果示于图6。
[0197] 图6中，图横轴表示使用的重组蛋白的种类，图纵轴表示1摩尔蛋白质上结合的铁 或锌的摩尔数。如图6所示，OsHRZl蛋白质全长和0sHRZ2蛋白质全长含有约2倍摩尔的 量的铁和锌，其结合能力由于缺失蚯蚓血红蛋白结构域而减小至约〇. 5倍摩尔以下。另一 方面，即使缺失三个Zn指结构域和红素氧还蛋白样模体，每1摩尔蛋白质的铁和锌结合量 也未显著减少。
[0198] 由以下也可以看出这一点：如图7所示，包含蚯蚓血红蛋白结构域的OsHRZl FL蛋 白质的浓缩溶解液与不含蚯蚓血红蛋白结构域的OsHRZl Λ Η蛋白质的浓缩溶解液相比较， 呈现出由铁产生的红棕色。
[0199] 由此确认，OsHRZ蛋白质中，相较于Zn指结构域、红素氧还蛋白样模体，铁和锌更 主要与蚯蚓血红蛋白结构域结合。另外，拟南芥的BTS蛋白质也与OsHRZl蛋白质和0sHRZ2 蛋白质同样显示出与铁和锌的结合，由此发现，蚯蚓血红蛋白样的铁锌结合性蛋白质在植 物种间具有保守性。
[0200] [抑制了 OsHRZ基因的表达的稻中的耐缺铁性能的确认]
[0201] 为了考察OsHRZ的功能，通过RNAi法制作抑制了 OsHRZ的表达的转化稻。具体而 言，对相当于0sHRZ2的3'UTR全长和编码区的一部分的335bp的片段（序列号5所示的碱 基序列）进行扩增，将该扩增产物插入PENTR(注册商标）-Blunt ΙΙ-Τ0Ρ0(注册商标）载 体中。接着，通过LR克隆酶反应，利用连接序列将该片段以正反两个方向各1个拷贝插入 目标载体 pIG121-RNAi-DEST(0go，Y·，等，Plant J. (2007) vol. 51，ρρ· 366-377)中，制成表 达载体。
[0202] 接着，依照常规方法，制成0sHRZ2的表达被抑制了的3个转化体（2i_l?2i_3) (Hiei，Y·，等，Plant J. (1994) vol. 6, ρρ· 271-282 ;Kobayashi，T·，等，Planta (2001) vol. 212, pp. 864-871) 〇
[0203] 将制成的转化体在缺铁条件下栽培7天，使用上述的定量RT-PCR法考察各转化体 中的0sHRZ2的mRNA的表达水平。
[0204] 如图8所示，在这些转化体中，确认到0sHRZ2的表达抑制。此外还确认，这些转化 体在通常的栽培条件下健康地生长而未表现出显著的表现型。
[0205] 另外，为了考察缺铁栽培条件给这些转化体带来的影响，对缺铁栽培条件下的最 新叶中的叶绿素含量进行了定量。结果示于图9中。图9中，纵轴表示最新叶中的叶绿素 (SPAD值），横轴表示缺铁栽培条件下的栽培天数。如图9所示，0sHRZ2表达抑制株的叶与 未处理（NT)的稻的叶相比，即使在缺铁条件下也显示出高叶绿素含量。由此确认，转化体 对缺铁栽培条件显示出耐受性。
[0206] 此外，为了评价这些转化体在有效铁含量少的特殊土壤中的生长状态，本发明人 在石灰质土壤中进行了这些转化体的长期试验。结果示于图10中。图10中，纵轴表示最 新叶中的叶绿素量（SPAD值），横轴表示移植后的栽培天数。
[0207] 如图10所示，在移植后20天以内，在全部稻中观察到叶中叶绿素量的减少。但是， 就其减少的程度而言，确认0sHRZ2表达抑制株的减少程度低于未处理的稻。此外，0sHRZ2 表达抑制株的叶中的叶绿素量在移植后22天以后逐渐恢复。如图11所示，OsHRZ2表达抑 制株的株高反映出耐缺铁性。可以确认，在收获期，0sHRZ2表达抑制株与未处理（NT)的稻 相比显示出更高的稻杆资源量和谷物收获量。
[0208] 此外，本发明人获得了在稻的基因组基因中插入有T-DNA的OsHRZl破坏株和插入 有Tosl7的0sHRZ2破坏株，并进行了分析。OsHRZl破坏株为由韩国P0STECH(浦项科技大 学）获得的3A-06066株。0sHRZ2破坏株为由稻基因组资源中心获得的ND6059株。图2示 出OsHRZl破坏株和0sHRZ2破坏株中的、插入序列（hrzl-1、hrz2_l)在基因组中的插入状 态。
[0209] 使用 100 μ 1 的 10mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)-0· ImM EDTA 溶液，从 OsHRZl 破坏株和 0sHRZ2破坏株的约0. lcm2的叶断片中提取基因组DNA。使用K0D FX Neo(T0Y0B0公司制 造）将提取到的基因组DNA供于PCR。结果示于图12中。
[0210] 图12中，箭头表示使用的引物，与图2中示出的退火至基因组DNA上的引物对应。
[0211] 如图12所示，确认hrzl-Ι和hrz2-l分别在OsHRZl和0sHRZ2中特异性地发生了 基因片段的插入。
[0212] 将这些破坏株在缺铁条件下进行水培，对最新叶中的叶绿素量进行定量。将结果 示于图13中。图13中，纵轴表示最新叶中的叶绿素量（SPAD值），横轴表示缺铁条件下的 栽培天数。图13(a)示出未处理（野生株：WT)的稻和OsHRZl破坏株中的最新叶中的叶绿 素量，图13(b)示出未处理（野生株：WT)的稻和0sHRZ2破坏株中的最新叶中的叶绿素量。 如图13所示，OsHRZl破坏株保持了稍高于未处理稻的叶绿素量。另外，0sHRZ2破坏株保持 了明确高于未处理稻的叶绿素量，确认其对缺铁栽培条件显示出耐受性。
[0213] [抑制了 OsHRZ基因的表达的稻的叶中的铁蓄积的确认]
[0214] 为了考察OsHRZ表达抑制株对缺铁栽培条件的耐受性机制，对水培7天后的稻的 叶中的金属浓度进行了定量。将结果示于图14中。图14中，横轴表示所使用的稻的种类， 纵轴表示叶中的铁含量。如图14所示可确认，0sHRZ2表达抑制株的叶与未处理株的叶相 t匕，在铁充足条件下（图14(a))和缺铁条件下（图14(b))均蓄积了高浓度的铁。
[0215] [抑制了 OsHRZ基因的表达的稻的稻杆和种子中的铁和锌的蓄积的确认]
[0216] 为了考察抑制了 OsHRZ基因的表达的稻的可食用部分中的铁的蓄积，对盆培后的 稻的稻杆和种子中的铁浓度进行了定量。
[0217] 将稻杆中的铁蓄积的结果示于图15中，将种子中的铁蓄积的结果示于图16中。图 15和图16中，横轴表示所使用的稻的种类，纵轴表示稻杆或种子中的铁含量。图15(a)和 图16(a)示出使用石灰质土壤的缺铁条件下的结果，图15(b)和图16(b)示出使用普通土 壤的铁充足条件下的结果。
[0218] 如图15和图16所不可确认，0sHRZ2表达抑制株的稻杆和种子与未处理株的稻杆 和种子相比，在铁充足条件下（图15(b)和图16(b))和缺铁条件下（图15(a)和图16(a)) 均蓄积了高浓度的铁。由该结果可以认为，稻杆虽然不是可食用部分，但本发明能够应用于 叶菜类等的铁富集。
[0219] 同样地考察了在隔离田内的普通土壤中栽培的糙米和白米中的铁的蓄积。
[0220] 将结果示于图17中。图17(a)示出糙米中的结果，图17(b)示出白米中的结果。 图17(a)和图17(b)中0sHRZ2表达抑制株的种子与未处理株的种子相比均蓄积了高浓度 的铁，由此确认了抑制了 OsHRZ基因的表达的稻的可食用部分中的高浓度的铁的蓄积。
[0221] 另外，为了考察抑制了 OsHRZ基因的表达的稻的可食用部分中的锌的蓄积，对盆 培后的稻的种子中的锌浓度进行了定量。图18(a)示出使用石灰质土壤的缺铁条件下的结 果，图18(b)示出使用普通土壤的铁充足条件下的结果。如图18所示可确认，0sHRZ2表达抑 制株的种子与未处理株的种子相比，在铁充足条件下和缺铁条件下（图18(a)和图18(b)) 均蓄积了高浓度的锌。
[0222] 对于同样的稻，考察了在隔离田内的普通土壤中栽培的糙米和白米中的锌的蓄 积。将结果示于图19中。图19(a)示出糙米中的结果，图19(b)示出白米中的结果。图 19(a)和图19(b)中0sHRZ2表达抑制株的种子与未处理株的种子相比均蓄积了高浓度的 锌，由此确认了抑制了 OsHRZ基因的表达的稻的可食用部分中的高浓度的锌的蓄积。
[0223] 此外，使用OsHRZl破坏株（hrzl-Ι)和0sHRZ2破坏株（hrz2_l)进行了与上述同 样的使用普通土壤的盆培试验。将结果示于图20中。
[0224] 图20(a)示出OsHRZl破坏株（hrzl-Ι)的种子中的铁蓄积的结果，图20(b)示出 0sHRZ2破坏株（hrz2-l)的种子中的铁蓄积的结果。图20(a)和图20(b)中，与未处理的稻 (野生株：WT)的种子相比，OsHRZ破坏株的种子均蓄积了高浓度的铁。由此确认了 OsHRZ 破坏株的可食用部分中的高浓度的铁的蓄积。
[0225] 另外，在同样的栽培条件下考察了 OsHRZ破坏株的种子中的锌的蓄积。将结果示 于图21中。图21(a)示出OsHRZl破坏株（hrzl-Ι)的种子中的锌蓄积的结果，图21(b)示 出0sHRZ2破坏株（hrz2-l)的种子中的锌蓄积的结果。图21 (a)和图21 (b)中，与未处理的 稻（野生株：WT)的种子相比，OsHRZ破坏株的种子均蓄积了高浓度的锌。由此确认了 OsHRZ 破坏株的可食用部分中的高浓度的锌的蓄积。
[0226] 另外，在同样的栽培条件下考察了 OsHRZ破坏株的稻杆中的铁和锌的蓄积。将结 果示于图22和图23中。图22示出OsHRZ破坏株（hrz 1-1和hrz2-l)的稻杆中的铁蓄积 的结果，图23示出OsHRZ破坏株（hrzl-Ι和hrz2-l)的稻杆中的锌蓄积的结果。图22和 图23中，与未处理的稻（野生株：WT)的稻杆相比，OsHRZ破坏株的稻杆均蓄积了高浓度的 铁锌。由此确认了 OsHRZ破坏株的稻杆中的高浓度的铁锌的蓄积。
[0227] 综上，抑制了 OsHRZ的表达的转化稻和OsHRZ破坏株这两者表现出相同的表现型， 由此确认，通过抑制OsHRZ基因的表达，稻的可食用部分中的铁锌蓄积提高。
[0228] [抑制了 OsHRZ基因的表达的稻的根中的铁摄取相关基因、铁迁移相关基因的表 达增强的确认]
[0229] 本发明人使用44K微阵列分析考察了在铁充足条件下和缺铁条件下水培的 0sHRZ2表达抑制株（2i-l?2i-3)的基因表达谱。基于由稻全长cDNA项目得到的序列信 息，稻44K微阵列（安捷伦科技公司制造）含有43144个种类的60mer的寡核苷酸。使用 NucleoSpin植物RNA小量制备试剂盒（Macherey-Nagel公司制造）从水培的0sHRZ2表 达抑制株的根中制备总RNA。按照以前报道的内容进行微阵列杂交、数据获取和数据分析 (0go, Y.，等，J. Exp. Bot. (2006) vol. 57, ρρ· 2867-2878)，以（0sHRZ2 表达抑制株的平均信 号值V(未处理（NT)的稻的平均信号值）算出表达比。将结果示于图24中。
[0230] 图24为示出各种基因的表达谱的图。如图24所示，0sHRZ2表达抑制株的根中， 特别是在铁充足条件下，显示出多种铁摄取相关基因和铁迁移相关基因的表达增强。
[0231] 进而，使用定量RT-PCR对铁充足条件下的微阵列分析的结果进行了验证。将结果 示于图25中。图25中，横轴表示所使用的稻，纵轴表示各基因（0sIR02、0sNAS2、0sYSL2) 的mRNA的表达强度。如图25所示可确认，各基因的表达变化与微阵列分析的结果一致。
[0232] 由此确认，OsHRZ蛋白质为缺铁应答的负调控因子，通过抑制OsHRZ蛋白质的表 达，能够解除主要在铁充足条件下的铁摄取相关基因、铁迁移相关基因的表达抑制。
[0233] 产业上的利用可能性
[0234] 根据本发明，能够获得耐缺铁性提高的植物，因此，能够获得在可溶化的铁分少的 碱性土壤等中也能生长的作物。
[0235] 此外，根据本发明，能够获得在可食用部分中显著蓄积铁和锌、特别是铁的植物， 因此，能够获得减轻缺铁症和缺锌症的作物。
[0236] 特别是根据本发明，能够得到同时兼具上述的耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄 积的性质，因此，认为对于在半干燥地带、石灰质倾向土壤等容易潜在缺铁的栽培条件下稳 定生产富铁食物而言极为有利。
[0237] 因此，本发明可以优选用于"新的铁锌结合性调控因子及利用其表达调节提高植 物的耐缺铁性且促进可食用部分中的铁锌蓄积的技术"，在产业上极为有用。
【权利要求】
1. 一种蛋白质，其特征在于，由下述（a)?（c)中任一种氨基酸序列构成，并且为铁锌 结合性调控因子， (a) 序列号1或2所示的氨基酸序列， (b) 在序列号1或2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个?多个氨基酸而成的氨 基酸序列，或者， (c) 与序列号1或2所示的氨基酸序列的同源性为80%以上的氨基酸序列。
2. -种基因，其特征在于， 编码权利要求1所述的蛋白质。
3. -种基因，其特征在于， 由下述（d)?（g)中任一种DNA构成，并且编码作为铁锌结合性调控因子的蛋白质， (d) 由序列号3或4所示的碱基序列构成的DNA， (e) 由在序列号3或4所示的碱基序列中缺失、取代或添加一个?多个碱基而成的碱基 序列构成的DNA， (f) 由与序列号3或4所示的碱基序列的同源性为80%以上的碱基序列构成的DNA，或 者， (g) 由能够与由序列号3或4所示的碱基序列所构成的DNA的互补碱基序列构成的DNA 在严格的条件下杂交的碱基序列构成的DNA。
4. 一种载体，其特征在于， 能够抑制权利要求2或3所述的基因的表达。
5. 如权利要求4所述的载体，其能够表达可在mRNA水平上抑制所述基因的表达的 RNAi诱导性核酸。
6. 如权利要求5所述的载体，其中， 所述RNAi诱导性核酸为序列号5所示的碱基序列。
7. -种转化体，其特征在于， 通过将权利要求4?6中任一项所述的载体导入宿主中而形成。
8. -种基因破坏株，其特征在于， 具有权利要求2或3所述的基因由于整合插入序列而被破坏的基因组DNA。
9. 一种抗体，其特征在于， 与权利要求1所述的蛋白质特异性地结合。
10. -种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作方法，其特征在于， 包括将权利要求4?6中任一项所述的载体导入植物中的步骤。
11. 一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用组合物，其特征 在于， 具备权利要求4?6中任一项所述的载体。
12. -种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的制作用试剂盒，其特征 在于， 具备权利要求4?6中任一项所述的载体。
13. -种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法，其特征在于， 包括对来自植物的提取液中含有的权利要求1所述的蛋白质进行检测的步骤。
14. 一种提高了耐缺铁性和可食用部分中的铁锌蓄积的植物的育种方法，其特征在于， 包括对来自植物的提取液中含有的权利要求2或3所述的基因进行检测的步骤。
【文档编号】C12N5/10GK104245933SQ201380018432
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年7月19日 优先权日:2012年7月26日
【发明者】小林高范, 西泽直子 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构