Cd47抗体及其使用方法
【专利摘要】本发明一般涉及识别CD47的单克隆抗体，更具体地涉及不引起显著的细胞凝集的CD47抗体、制备这些抗体的方法以及使用这些单克隆抗体作为治疗物质的方法。
【专利说明】CD47抗体及其使用方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求于2012年2月6日提交的美国临时申请第 61/595, 216号以及2012年6月14日提交的美国临时申请第61/659, 752号的优选权，这些 申请各通过引用全文纳入本文。
【技术领域】
[0003] 本发明一般涉及识别⑶47的单克隆抗体、更具体地涉及不引起显著的人血红细 胞血凝反应的⑶47抗体、制备这些抗体的方法以及使用这些单克隆抗体作为治疗物质的 方法。
[0004] 发明背景
[0005]CD47,也称作整联蛋白相关蛋白（IAP)、卵巢癌抗原0A3、Rh相关抗原和MER6,是一 种属于免疫球蛋白超家族的多次跨膜受体。CD47的表达和/或活性涉及许多疾病和失调。 因此，需要以⑶47为目标的疗法。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了识别并结合CD47(尤其是人CD47)的单克隆抗体。本发明的抗体能 够调节（如阻断、抑制、减少、拮抗、中和或干扰）CD47的表达、活性和/或信号传递，且这 些抗体不会导致人血红细胞（本文中也称作红细胞）出现显著的血凝反应。然而，本发明 的抗体结合细胞表面的CD47且不产生细胞凝集现象的能力不限于血红细胞。本发明的抗 体以不促进CD47阳性细胞凝集的方式特异性结合CD47。本发明的抗体及其衍生物能够调 节（如阻断、抑制、减少、拮抗、中和或干扰）CD47与SIRPa(信号调节蛋白a)之间的相互 作用，且这些抗体不会导致人血红细胞出现显著的血凝反应。本发明所提供的抗体统称为 "⑶47抗体"。本发明的⑶47抗体是现有的⑶47抗体基础上的显著改进，现有的⑶47抗体 导致人血红细胞出现血凝反应（参见例如KikuchiY、UnoS、YoshimuraY等，Abivalent single-chainFvfragmentagainstCD47inducesapoptosisforleukemiccells?(抗 0)47的二价单链Fv片段诱导白血病细胞发生凋亡），BiochemBiophysResCommun2004; 315:912 - 8)。例如，本发明的CD47抗体是现有的CD47抗体B6H12、BRC126和CC2C6基础 上的显著改进，上述每个抗体均阻断SIRPa，但引起RBC的血凝反应，如下文详细描述。本 发明的全IgGCD47抗体（例如2A1及其人源化衍生物，包括表1中所提供的抗体）不会以 显著水平凝集细胞。例如，本发明的CD47抗体不会凝集血红细胞（RBC)。本文所描述的是 全IgG形式的第一类⑶47抗体，其阻断SIRPa但不会导致显著的血凝反应。
[0007] 本发明的CD47抗体表现出多种需要的特性，如通过非限制性实施例的方式有效 地阻断⑶47与其配体SIRPa的相互作用，同时不导致显著的红细胞血凝反应，以及有效的 抗肿瘤活性。例如，与不存在本文所述CD47抗体时CD47与SIRPa之间的相互作用水平相 t匕，本发明的⑶47抗体阻断了⑶47与SIRPa之间至少40%、至少45%、至少50%、至少 55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少95%或至少 99 %的相互作用。
[0008] 本发明的CD47抗体不会导致显著的细胞凝集，例如本发明的CD47抗体不会导致 显著的血红细胞血凝反应。在一些情况下，显著的细胞凝集指现有⑶47抗体存在时的凝集 水平。在一个方面，与现有CD47抗体存在时的凝集水平相比，本发明的CD47抗体存在时 的凝集水平下降了至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少 60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或至少99 %。在一些实施方式中，如果与现有⑶47 抗体存在时的凝集水平相比，本发明的CD47抗体存在时的凝集水平下降了至少5%、至少 10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少 90%或至少99%，则说明本发明的CD47抗体未导致显著的凝集水平。在其他实施方式中， 如果与现有〇)47抗体184(包括分别由360 10勵:80和3￡0 10勵:81提供的可变重链和 可变轻链序列）存在时的凝集水平相比，本发明的CD47抗体存在时的凝集水平下降了至 少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少 80%、至少90%或至少99%，则说明本发明的⑶47抗体未导致显著的凝集水平。优选地， 在抗体浓度介于10pM和10yM之间（例如抗体浓度为50pM、100pM、InM、10nM、50nM、100nM、 1iiM或5yM)时，本发明的⑶47抗体不会导致显著的细胞凝集。
[0009] 与本领域已知的抗体相比，在肿瘤模型中本发明的抗体也显著有效。例如，与现 有CD47抗体存在时巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力相比，本发明的CD47抗体存在时巨噬细 胞吞噬肿瘤细胞的能力升高了至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少 50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少99%。
[0010] 本领域的技术人员会认识到人们可以不经过度实验对凝集水平进行定量，例如 RBC的血凝反应。例如，本领域的技术人员会认识到可在本发明的CD47抗体存在的条件下 进行血凝反应试验，其后测量RBC斑点的面积以确定血凝反应的水平，如下文实施例中所 述。在一些情况下，对存在本发明的CD47抗体时的RBC斑点面积与不存在本发明的CD47 抗体时（即零血凝反应条件下）的RBC斑点面积进行了比较。在这种方式下，相对于基线 对照对血凝反应进行定量。RBC斑点的面积越大表明血凝反应的水平越高。或者，也可使用 RBC斑点的密度分析对血凝反应进行定量。
[0011] 本文所述CD47抗体可用于治疗、延缓癌症或其他肿瘤病症的进展、避免其复发或 缓解其症状。例如，本文所述⑶47抗体可用于治疗血液恶性肿瘤和/或肿瘤，例如血液恶 性肿瘤和/或肿瘤。例如，本文所述CD47抗体可用于治疗CD47+肿瘤。作为非限制性实施 例，本文所述CD47抗体可用于治疗非霍奇金淋巴瘤（NHL)、急性淋巴细胞性白血病（ALL)、 急性骨髓性白血病（AML)、慢性淋巴细胞性白血病（CLL)、慢性骨髓性白血病（CML)、多发性 骨髓瘤（MM)、乳腺癌、卵巢癌、头颈癌、膀胱癌、黑素瘤、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、平滑肌瘤、 平滑肌肉瘤、胶质瘤、成胶质细胞瘤等。实体瘤包括例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、黑 素瘤、结直肠癌、肺癌、头颈癌、膀胱癌、食道癌、肝癌和肾癌。
[0012] 在本文中，"血液癌症"表示血液的癌症，包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等。"白血 病"表示一种血液癌症，其中制造了过多无法有效对抗感染的白细胞，从而排挤组成血液的 其他部分，如血小板和血红细胞。应理解可将白血病的病例分为急性或慢性。作为非限制性 实施例，白血病的某些形式包括急性淋巴细胞性白血病（ALL);急性骨髓性白血病（AML); 慢性淋巴细胞性白血病（CLL);慢性骨髓性白血病（CML);骨髓性增生疾病/肿瘤（MPDS); 和脊髓发育不良综合征。"淋巴瘤"可表示霍奇金淋巴瘤，无痛性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、 伯基特淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤（小细胞和大细胞）等。骨髓瘤可表示多发性骨髓瘤（MM)、 巨细胞骨髓瘤、重链骨髓瘤和轻链或本斯_琼斯骨髓瘤。
[0013] 本发明的示例性单克隆抗体包括例如本文所述抗体。示例性抗体包括具有选自 SEQIDN0:5-30的可变重链和选自SEQIDN0:31-47的可变轻链的抗体。所述抗体还包括 具有与SEQID勵:5-30中的至少一个序列有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或更高相同性的可变重链和与SEQIDN0:31-47中的至少一个序列有至 少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高相同性的可变轻链的抗 体。优选地，所述抗体识别并结合人⑶47且不导致显著的人血红细胞血凝反应。本文中， 这些抗体分别被称作⑶47抗体。⑶47抗体包括全人单克隆抗体，以及人源化单克隆抗体和 嵌合抗体。这些抗体显示出对人⑶47的特异性，且其能够调节（如阻断、抑制、减少、拮抗、 中和或干扰）CD47的表达、活性和/或信号传递，同时不会导致血红细胞出现显著的血凝反 应。
[0014] 本发明提供的CD47抗体表现出抑制活性，例如抑制CD47的表达（如抑制细胞表 面⑶47的表达）、活性和/或信号传递，或干扰⑶47和SIRPa之间的相互作用。本发明提 供的⑶47抗体在结合⑶47 (如人⑶47)或与其相互作用后完全或部分地降低或调节⑶47 的表达或活性。在抗体与人⑶47多肽和/或肽之间相互作用后，⑶47生物学功能的降低 或调节是完全、显著或部分的。当与不存在同本文所述的抗体相互作用（如结合）时CD47 的表达或活性水平相比，存在抗体时⑶47的表达或活性水平降低了至少95 % (例如降低了 96 %、97 %、98 %、99 %或100 %)时，所述抗体被认为能够完全抑制⑶47的表达或活性。与 不存在同本文所述的CD47抗体结合时CD47的表达或活性水平相比，存在CD47抗体时CD47 的表达或活性水平降低了至少50% (例如降低了 55%、60%、75%、80%、85%或90%)， 此时所述CD47抗体被认为能够显著抑制CD47的表达或活性。与不存在同本文所述的抗体 相互作用（如结合）时CD47的表达或活性水平相比，存在抗体时CD47的表达或活性水平 降低了少于 95% (例如降低了 10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、85%或 90% )，此时所述抗体被认为能够部分抑制CD47的表达或活性。
[0015] 本发明的抗体还包括特异性结合CD47的单克隆抗体，所述抗体不导致显著的凝 集水平，例如血红细胞血凝反应（"RBC血凝反应"）。本发明的抗体以不促进CD47阳性细 胞凝集的方式特异性结合CD47,但本发明的抗体在细胞表面结合CD47且不引起细胞凝集 现象的能力不限于血红细胞。
[0016] 本发明的药物组合物可包括本发明的抗体和运载体。这些药物组合物可包括于试 剂盒中，如诊断试剂盒。
[0017] 本发明提供了结合CD47或其免疫活性片段的单克隆抗体，所述抗体在给药后不 导致显著的细胞凝集，例如所述抗体在给药后不导致显著的血红细胞血凝反应。在一些实 施方式中，所述抗体是嵌合、人源化或全人的。在一些实施方式中，所述抗体结合人CD47。 在一些实施方式中，所述抗体或其免疫活性片段阻止⑶47与SIRPa相互作用。与不存在 同所述抗体相互作用（如与所述抗体结合）时CD47/SIRPa的相互作用水平相比，存在抗 体时⑶47/SIRPa的相互作用水平降低了至少95% (例如降低了 96%、97%、98%、99%或 100% )，此时所述抗体被认为能够完全抑制CD47与SIRPa之间的相互作用。与不存在同本 文所述抗体相互作用（如与所述抗体结合）时CD47/SIRPa的相互作用水平相比，存在抗 体时⑶47/SIRPa的相互作用水平降低了少于95% (例如降低了 10%、20%、25%、30%、 40%、50%、60%、75%、80%、85%或90%)，此时所述抗体被认为能够部分抑制0)47/ SIRPa的相互作用。
[0018] 足够治疗或预防对象中癌症的抗体量为例如足够降低CD47信号的量（参 见例如Yamauchi等，2013Blood,Jan4?[电子出版先于印刷出版];Soto-Pantoja 等，2013ExpertOpinTherTargets, 17:89-103;Irandoust等，2013PLoS One,EpubJan8;Chao等，2012CurrOpinImmunol, 24:225-32；Theocharides等， 2012JExpMed,209 (10):1883-99;Csdnyi等，2012ArteriosclerThrombVase Biol，32:2966-73;Maxhimer等，2009SciTranslMed,l:3ra7;Sarfati等，2008Curr DrugTargets，9:842 - 850;Miyashita等，2004MolBiolCell, 15:3950 - 3963; E.J.Brown和W.A.Frazier, 2001TrendsCellBiol, 11:130 - 135 ;01denborg等，2001J ExpMed, 193:855 - 862;Blazar等，2001JExpMed, 194:541 - 549 ;01denborg等，2000 Science, 288:2051 - 2054;以及Gao等，1996JBiolChem, 271:21 - 24)。例如，足够治疗或 预防对象中癌症的抗体量为足够降低巨噬细胞中由⑶47/SIRPa信号轴上的⑶47/SIRPa 相互作用生成的吞噬细胞抑制信号的抗体量，即本发明的抗体促进了巨噬细胞介导的对表 达CD47的细胞的吞噬作用。本文所用术语"下降"表示存在本发明的抗体时减少的CD47 信号传递。CD47介导的信号传递下降指本发明的CD47抗体存在时CD47信号传递水平低于 CD47的对照水平（即不存在抗体时的CD47信号传递水平），降低的幅度大于或等于5%、 10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、99%或100%。可使 用多种标准技术测量CD47信号传递水平，如作为非限制性实施例，测量下游基因激活和/ 或响应CD47激活的荧光素酶报告试验。本领域技术人员应理解可使用多种试验测量CD47 信号传递水平，包括例如市售可得的试剂盒。
[0019] 在一些实施方式中，所述抗体或其免疫活性片段是IgG同种型。在一些实施方式 中，所述抗体的恒定区是人IgGl同种型，具有如下氨基酸序列：
[0020]
【权利要求】
1. 一种分离的单克隆抗体，其结合CD47或其免疫活性片段，所述抗体在给药后不会引 起显著的细胞凝集。
2. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体是嵌合、人源化或全人的。
3. 如权利要求1所述的抗体，所述⑶47是人⑶47。
4. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段阻止CD47与信号调节蛋白 a (SIRPa)相互作用。
5. 如权利要求4所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段促进巨噬细胞介导的对表达 ⑶47的细胞的吞噬作用。
6. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段是一种IgG同种型，所述IgG 同种型选自下组：IgGl同种型、IgG2同种型、IgG3同种型和IgG4同种型。
7. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段包含选自SEQ ID NO: 5-30的 可变重（VH)链区。
8. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段包含选自SEQ ID NO:31-47 的可变轻（VL)链区。
9. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段包含SEQ ID NO: 5-30中任一 序列提供的VH区和SEQ ID NO:31-47中任一序列提供的VL区。
10. 如权利要求9所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段包含SEQ ID NO: 5、7、8、11、 12、15-17、20-22和 27-30 中任一序列提供的VH区和与之配对的SEQIDN0:31、32、35、40、 41、42、43、44和47中任一序列提供的VL区。
11. 如权利要求9所述的抗体，所述抗体包含选自表1所列组合的VH链区与VL链区的 组合。
12. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段包含SEQ ID NO: 50、SEQ ID N0:57,SEQ ID N0:58,SEQ ID N0:59,SEQ ID N0:60,SEQ ID N0:6USEQ ID N0:62,SEQ ID N0:63、SEQ ID N0:64、SEQ ID N0:65 或 SEQ ID N0:66 中所列的 VH 互补决定区 1(CDR1)序 列，SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75 或 SEQ ID NO :76 中所列的 VH CDR2 序列，SEQ ID NO :52 或 SEQ ID NO :77 中所列的 VH CDR3 序列，SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:67 或 SEQ ID NO:68 中所列的 VL CDR1 序列，SEQ ID NO:54、SEQ ID N0:69、SEQ ID N0:70 或 SEQ ID N0:71 中所列的 VL CDR2 序列，以及 SEQ ID N0:55 中所列 的VL CDR3序列。
13. 如权利要求12所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段包含SEQ ID NO:50中所列 的 VH CDR1 序列，SEQ ID N0:51 中所列的 VH CDR2 序列，SEQ ID N0:52 中所列的 VH CDR3 序列，SEQ ID NO:53中所列的VL CDR1序列，SEQ ID NO:54中所列的VL CDR2序列，以及 SEQ ID N0:55中所列的VL CDR3序列。
14. 如权利要求12所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段包含SEQ ID NO: 50中所列 的 VH CDR1 序列，SEQ ID N0:72 中所列的 VH CDR2 序列，SEQ ID N0:52 中所列的 VH CDR3 序列，SEQ ID NO:53中所列的VL CDR1序列，SEQ ID NO:71中所列的VL CDR2序列，以及 SEQ ID N0:55中所列的VL CDR3序列。
15. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体以头对侧的方向结合至CD47,所述抗体的VH 链靠近表达⑶47的细胞的细胞膜，且所述抗体的VL链封闭了⑶47上的SIRP a结合位点。
16. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体以头对侧的方向结合至CD47,所述抗体的VL 链靠近表达⑶47的细胞的细胞膜，且所述抗体的VH链封闭了⑶47上的SIRP α结合位点。
17. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体结合至⑶47上的不连续表位。
18. 如权利要求17所述的抗体，所述抗体结合至包括SEQ ID NO:56的⑶47环。
19. 如权利要求17所述的抗体，所述不连续表位包含⑶47的氨基酸残基Y37、K39、 K41、K43、G44、R45、D46、D51、H90、N93、E97、T99、E104 或 E106 的不连续表位，编号依据 SEQ ID NO:147。
20. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体在给药后不会引起显著的血红细胞血凝反应。
21. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体或其免疫活性片段是选自IgG4P和IgGPE的 IgG同种型。
22. -种分离的抗体或其免疫活性片段，所述抗体与前述权利要求中任一项所述的抗 体竞争阻止⑶47与SIRP α相互作用。
23. -种多肽，其包含 CD47 的氨基酸残基 Y37、K39、K41、K43、G44、R45、D46、D51、H90、 N93、E97、T99、E104 和 E106 的多肽，编号依据 SEQ ID N0:147。
24. -种药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体或其免疫活性片段以及运载体。
25. -种缓解癌症或其他肿瘤病症症状的方法，所述方法包括将权利要求1所述的抗 体或其免疫活性片段以足够缓解对象中癌症或其他肿瘤病症症状的量给予有需要的对象。
26. 如权利要求25所述的方法，所述对象是人。
27. 如权利要求25所述的方法，所述抗体是嵌合、人源化或全人的。
28. 如权利要求25所述的方法，所述⑶47是人⑶47。
29. 如权利要求25所述的方法，所述抗体或其免疫活性片段阻止⑶47与SIRP α相互 作用。
30. 如权利要求25所述的方法，所述抗体或其免疫活性片段是一种IgG同种型，所述 IgG同种型选自下组：IgGl同种型、IgG2同种型、IgG3同种型和IgG4同种型。
31. 如权利要求25所述的方法，所述抗体或其免疫活性片段是选自IgG4P和IgGPE的 IgG同种型。
32. 如权利要求25所述的方法，所述方法还包括进行化疗。
33. 如权利要求32所述的方法，所述化疗是放射疗法。
【文档编号】C12P21/08GK104271757SQ201380017900
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2012年2月6日
【发明者】B·埃克尔曼, J·蒂莫, A·拉扎伊, Q·德福罗, K·琼斯, P·L·恩古 申请人:印希彼有限责任公司