专利名称：Muc5ac抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质工程、基因工程和生物医药领域，具体涉及MUC5AC抗体及其在诊断肿瘤中的用途。
背景技术：
Mucins是组成黏液的主要成分，它们是由上皮中分泌型细胞分泌的的一种高分子量的O型糖蛋白。其主要作用是作为有机体细胞的防御机制来抵御外界环境对细胞表皮的侵害以及润滑细胞表皮。此外，它们还在生长、胎儿发育以及上皮的更新、分化、完整性、癌变过程和转移中起到一定的作用。分析其氨基酸表明，它是由含高比例的丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸和氨基乙酸的VNTR(variable numberof tandem repeats)和O型糖链组成。
MUC5AC是一类高分子量的糖蛋白，属于mucin家族中凝胶体型(gel-forming)。其分布于11号染色体p15.5区域上的一段400kb，富含CpG岛的区域。其去糖基化后的蛋白骨架中富含半胱氨酸。MUC5AC在foveolar细胞中以及窦部高表达。
在正常组织和癌变的组织中，MUC5AC的表达量和糖基化形式都发生变化，因此，MUC5AC在多种肿瘤检测中都有所应用，但是都以免疫组化为试验基础，没有应用于临床。在这些试验中证实，不同类型的胃癌中MUC5AC的表达形式不同，而且早期胃癌以及混合型胃癌较其他种类的胃癌MUC5AC高表达。
因此，还需要进一步研究确定该蛋白是否可以作为血清检测的肿瘤标志物，能否应用于肿瘤的诊断和治疗，特别是消化道上皮肿瘤如胃癌的诊断和治疗。
发明内容
为实现上述发明目的，本发明首先提供了一对能特异性识别MUC5AC的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.1509、CGMCC NO.1511的杂交瘤细胞产生。
本发明另一方面提供了一种用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含一对抗体，由保藏号为CGMCC NO.1509的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第一抗体，以及由保藏号为CGMCC NO.1511的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第二抗体。
本发明另一方面还涉及MUC5AC抗体、尤其是上述单克隆抗体在制备用于血清学检测肿瘤的诊断剂中的用途。
本发明的MUC5AC抗体，尤其是本发明获得的单克隆抗体能够用于血清学检测各种肿瘤。本发明的其它目的和优点可从以下的详细描述中得知。
图1显示实施例1中密度梯度离心的结果。
图2显示了用MUC5AC单克隆抗体进行Western检测的结果。
图3显示了抗体配对的标准曲线，其中横坐标表示抗原浓度，纵坐标表示酶标值。
具体实施例方式
本发明第一方面提供了两个能特异性识别MUC5AC的单克隆抗体，所述单克隆抗体分别由保藏号为CGMCC NO.1509、CGMCC NO.1511的杂交瘤细胞产生。
本文所用的术语“抗体”指由至少一个抗体结合位点组成的一个或一组多肽，其具体包括单克隆抗体(包括全长的单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段(例如Fab、F(ab′)2和Fv)，只要它们表现出所需的生物活性(即与MUC5AC特异性结合)。术语“抗体片段”指全长抗体的一部分，通常是抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为Fab片段，每个片段有单个抗原结合部位)，以及一个残余的“Fc”片段(如此称呼是因为它很容易结晶)。用胃蛋白酶处理产生一个F(ab′)2片段(它具有两个能与抗原交联的抗原结合片段)以及一个残余的其它片段(称为pFc′)。其它片段可包括二抗体、线性抗体、单链抗体分子和抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用的，关于抗体的术语“功能性片段”是指Fv，F(ab)和F(ab′)2片段。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一群基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的各个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规(多克隆)抗体制剂(通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。本文的单克隆抗体还包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)(其中重链和/或轻链的一部分与特定动物种类衍生的、或是属于特定的抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，而链的其余部分则与另一动物衍生的、或是属于另一抗体类或亚类的抗体的对应序列相同或同源)以及这些抗体的片段，只要这些片段具有所需的生物活性即可。
针对MUC5AC的单克隆抗体可用常规方法制得。通常，首先用MUC5AC蛋白来免疫合适的动物，较佳的是小鼠、大鼠、家兔或山羊。所述MUC5AC蛋白可从商业途径获得，或是根据常规分子克隆和基因重组表达技术来获得，另外也可用胶层析与密度梯度离心等方法从诸如HT-29等细胞株分离获得。
由于可获得的血清体积多，能获得标记的抗家兔和抗山羊抗体，因此对于制备多克隆抗血清来说，家兔和山羊是较佳的。免疫通常这样进行将蛋白以盐水(较佳的以佐剂如弗氏完全佐剂)混合或乳化，然后肠胃外(通常是皮下或肌内)注射该混合物或乳剂。随后用盐水(较佳的是用弗氏不完全佐剂)配的蛋白质注射一次或多次以强化免疫。另外可以用本领域已知的方法进行体外免疫来产生抗体。
用Kohler和Milstein的标准方法[Nature(1975)256495-96]或其改进方法可制得单克隆抗体。通常，如上所述对啮齿类动物如小鼠和大鼠进行免疫。当然，也可用家兔、羊或蛙细胞。采用大鼠可能会有某些优点，但是小鼠是较佳的，其中BALB/c小鼠是最佳的，它是最常用的动物，通常能提供较高比例的稳定融合。为了产生单克隆抗体，在免疫接种后，选择具有生产抗体潜力的体细胞，具体是B淋巴细胞(B细胞)，以用于单克隆抗体生产程序。这些细胞可从活检的脾脏、扁桃体或淋巴结、或周围血液样品获得。脾细胞和周围血细胞是较佳的，因为前者是处于分裂的浆母细胞阶段的抗体产生细胞的丰富来源，而后者周围血液很容易获得。通常是对一组动物免疫接种，取出抗体滴度最高的动物的脾脏。用注射器将脾脏匀浆，获得脾淋巴细胞。免疫接种过的小鼠的脾脏通常含有约5×107至2×108的淋巴细胞。
然后，使免疫接种的动物的产生抗体的B细胞与无限增殖骨髓瘤细胞系(通常与免疫接种动物的种类相同)融合。适用于产生杂交瘤融合程序的骨髓瘤细胞系最好不产生抗体，融合效率较高，且有酶缺陷，使得它们不能在某些只支持所需融合细胞(称为杂交瘤)生长的选择性培养基中生长。可采用许多骨髓瘤细胞中的任何一种，它们是本领域技术人员中已知的。例如，当免疫接种的动物是小鼠时，可采用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp2/0、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；对于大鼠，可采用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均可与人细胞融合结合。一种较佳的小鼠骨髓瘤细胞系是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1)，它可从NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository通过要求细胞系保藏号GM3573获得。可采用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性的小鼠骨髓瘤SP2/0非生产型细胞系。
产生抗体产生性脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交物的方法通常包括在促进细胞膜融合的一种或数种试剂(化学或电)存在下，以2∶1的比例混合体细胞和骨髓瘤细胞，但是比例也可分别从约20∶1至约1∶1。Kohler & Milstein(1975；1976)已经描述了采用Sendai病毒的融合方法，Gefter等(1977)描述了采用聚乙二醇(PEG)(如37％(v/v)PEG)。采用电诱导的方法也是适用的。
融合步骤产生存活杂交细胞的频率通常较低。然而，这并不成问题，因为通过在选择性培养基中培养可将存活的融合杂交细胞与亲代未融合细胞(特别是会继续正常无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)中区分开来。选择性培养基通常含有阻断组织培养基中核苷酸从头合成的试剂。典型的较佳的试剂是氨基喋呤、氨甲喋呤和重氮丝氨酸。氨基喋呤和氨甲喋呤阻断了嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅仅阻断嘌呤的合成。当采用氨甲喋呤或氨甲喋呤时，在培养基中补充入次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸源(HAT培养基)。当采用重氮丝氨酸时，在培养基中补充加入次黄嘌呤。
较佳的选择培养基是HAT。只有能进行核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤在补救途径中缺少关键性酶，如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)，它们不能存活。B细胞能进行该途径，但是它们在培养基中的生命期有限，通常会在大约两周内死亡。因此在选择性培养基中存活的细胞只有骨髓瘤和B细胞形成的杂交瘤细胞。
这一培育提供了一群杂交瘤，从中选出具体的杂交瘤。通常，杂交瘤的选择是在微量滴定板中单克隆稀释，然后测试各个克隆的上清液是否具有所需反应性。该试验应当灵敏、简单而迅速，例如放射性免疫试验、酶免疫试验、细胞毒性试验、空斑试验、斑点免疫结合试验、酶联免疫吸附试验等。然后系列稀释所选杂交瘤，并克隆成单个的抗体产生细胞系，然后就可使克隆无限增殖以提供单克隆抗体。
在本发明的实施方案中，发明人通过数轮筛选获得了两株对MUC5AC有高特异性的单克隆抗体杂交瘤细胞株和Muc5A02和Muc5A03，并于2005年月日保藏于，保藏号为。
细胞系可利用两种基本的方式来生产单克隆抗体。一种方式是将杂交瘤样品注射入用来提供体细胞和骨髓瘤细胞进行最初融合的组织相容性动物中，通常注射入腹膜腔内。注射过的动物产生的肿瘤分泌出由杂交融合细胞产生的特异性单克隆抗体。然后可抽出动物的体液(如血清或腹水)以提供高浓度的单克隆抗体。任选地，在注射细胞前给予动物一种烃类(具体说是油，如降植烷Pristane(四甲基十五烷)、石蜡等)。
本发明的单克隆抗体也可用本领域熟知的体外方法进行繁殖。体外繁殖可在合适的培养基(如Dulbecco改进的Eagle培养基或RPMI 1640培养基)中进行，还可任意的补加入哺乳动物血清(如胎牛血清)或微量元素以及维持生长的补充物，如饲养细胞(如正常小鼠腹膜渗出液细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞等)。体外生产提供了较纯的抗体制品，并允许放大规模来大量提供所需抗体。在组织培育条件下大规模培育杂交瘤的技术是本领域中已知的，其包括均相悬浮培养，例如在气升式反应器或连续搅拌罐反应器中，或固定或截留细胞培养。如果需要，用任一方法产生的单克隆抗体可用过滤、离心和各种层析方法(如HPLC或亲和层析)进一步纯化。
应当理解，本发明的术语“单克隆抗体”还涵盖了该单克隆抗体的功能性片段和偶联物。本发明的单克隆抗体的片段可从上述制得的单克隆抗体获得，方法例如包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜酶)消化和/或用化学还原来断裂二硫键。本发明的单克隆偶联物也可用本领域熟知的方法制得，例如，在偶联剂(如戊二醛或高碘酸盐)存在下使上述制得的单克隆抗体与酶反应。在这些偶联剂存在下或通过与异硫氰酸盐反应，制得带荧光素标记的偶联物。类似地制得带金属螯合剂的偶联物。可与抗体偶联的其它物质包括放射性核素，如3H、125I、131I、32P、35S、14C、51Cr、36Cl、57Co、58Co、59Fe、75Se、152Eu和99mTc以及可与抗体偶联的其它有用的标记物。本发明的放射性标记过单克隆抗体可根据本领域熟知的方法制得。例如，通过与碘化钠和碘化钾以及化学氧化剂(如次氯酸钠)或酶氧化剂(如乳过氧化物酶)接触，可使单克隆抗体碘化。本发明的单克隆抗体可通过配体交换方法或直接标记方法来标记锝99m。交换方法例如是用亚锡溶液还原高锝酸盐，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，然后将抗体施加到该柱上；直接标记方法例如是培育高锝酸盐、还原剂(如SNCl2)、缓冲液(邻苯二甲酸钠-钾溶液)和抗体。
如果需要，抗体可用常规技术来标记。合适的标记包括荧光团、发色团、放射活性原子(尤其是32P和125I)、密电子试剂、酶、以及具有特异性结合配偶的配体。酶通常靠其活性来检测。例如，辣根过氧化物酶通常是检测其将3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)转变成蓝色的能力，可用分光光度计定量测定。其它特异性结合配偶包括生物素和亲和素或链亲和素，IgG和蛋白A，以及本领域已知的许多受体-配体对。应理解，上述内容并非要将各种标记分成不同的类，因为同一标记可在几种不同的模型中起作用。例如，125I可作为放射活性标记，或作为密电子试剂。HRP可作为酶或单抗的抗原。另外，一种物质可以和各种标记组合以获得所需的效果。其它替换和可能性对于本领域普通技术人员来说是显而易见的，所以应认作属于本发明范围内的等价方案。
本发明另一方面涉及用本发明的MUC5AC抗体来检测样品(如血清)中的MUC5AC水平，并将其与正常参考值比较，从而实现检测肿瘤的目的。
本发明的抗体可用来检测各种肿瘤如肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌等。在较佳的实施方案中，本发明的抗体宜用来检测胃癌。
所述检测可通过标准免疫化学方法，例如ELISA、Western印迹方法、RIA以及其它非酶联抗体结合试验等来实现。
在典型的ELISA中，将本发明的一对单克隆抗体中的一个固定在具有蛋白亲和性的选定表面上，例如聚苯乙烯微滴板的测试孔。然后，在测试孔中加入怀疑含有抗原的待测组合物，例如临床样品如血清。在结合、并洗涤去除非特异性结合的免疫复合物后，就可以检测被结合的抗原。检测通常是通过加入另一种抗体(如本发明的另一单克隆抗体)来完成的，所述抗体对要求检测的抗原具有特异性并连接有可测标记。这类ELISA是一种简单的“夹心ELISA”方法。也可以先加入对所需检测抗原具有特异性的第二抗体，然后加入对第二抗体有结合亲和性的第三抗体来进行测定，所述第三抗体连接有可测标记。另外，也可以使用竞争ELISA，使待测样品与已知量的标记抗原或抗体竞争结合，在与包被测试孔孵育前或孵育过程中，将样品与已知的标记反应物混合来测定未知样品中反应物的量。
不论采用何种方式，各种ELISA有一些共同的特征步骤，例如包被、孵育或结合、洗涤去除非特异性结合物、和检测结合的免疫复合物。下面将对此进行说明。
在用抗原或抗体包被测试板时，通常是将测试板孔与抗原或抗体溶液一起孵育过夜或一定的时间。然后，洗涤测试板孔以去除不完全吸附的物质。然后，在测试孔的剩余表面“包被”以非特异性蛋白，此蛋白对待测抗血清在抗原性上是中性的。这类蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、伴刀豆蛋白和奶粉溶液。此步包被封闭了固相表面上的非特异性吸附位点，由此减弱因抗血清与表面的非特异性结合引起的背景。
在抗原性物质与测试孔结合，用非反应性物质包被以减弱背景和洗涤去除未结合物质后，使固相化表面在一定条件下与待测的抗血清或临床或生物学提取物接触形成(抗原/抗体)免疫复合物。这类条件宜包括用胎牛血清(BSA)、牛γ球蛋白(BGG)和磷酸盐缓冲液(PBS)/吐温等稀释剂来稀释抗血清。加入的这些试剂还有助于减弱非特异性背景。孵育之后，洗涤接触过抗血清的表面去除非免疫复合的物质。洗涤过程宜包括用例如PBS/吐温或硼酸盐缓冲液之类溶液进行洗涤。
在待测样品与结合的抗体之间形成了特异性免疫复合物并经洗涤后，可以用对抗原有特异性的第二抗体来测定有无所形成的免疫复合物甚至测定其含量。为了提供检测手段，第二抗体宜含有与之偶联的酶，该酶在与合适的生色底物孵育后会显现出颜色。
在与酶标记第二抗体一起孵育并洗涤去除未结合物质后，通过与生色底物一起孵育来测定标记的量，所述底物例如脲和溴甲酚紫，如果酶标记是过氧化物酶，则底物为2，2’-偶氮-二-(3-乙基-苯并噻唑林-6-磺酸)(ABTS)和H2O2。然后通过测定生色程度来定量，例如使用可见光光谱分光光度计。或者，可以是化学发光标记。
在较佳的实施方案中，本发明获得了能够配对用于夹心ELISA法的两株单克隆抗体，这样就能实现通过检测对象血清中MUC5AC的水平来快速诊断对象是否患有肿瘤。
因此，本发明的另一方面还提供了一种用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含一对抗体，其中由保藏号为CGMCC NO.1509的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第一抗体，由保藏号为CGMCC NO.1511的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第二抗体。在较佳的实施方案中，所述抗体还可与标记物偶联。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例1 MUC5AC抗原的纯化和鉴定MUC5AC抗原通过胶层析与密度梯度离心的方法，从人类肠道细胞株HT-29获得。具体而言，人类肠道细胞株HT-29用含有L-谷氨酸盐以及10％胎牛血清的RPMI 1640培养基培养5天。收集培养基并用等体积的8M GdmCl，然后用4M的GdmCl的CL-2B层析柱层析。将洗脱的高分子量的mucins与培养基中的小分子量的蛋白及糖蛋白分离。之后mucins通过CsCl/4M Gdml密度梯度离心方法纯化。密度范围在1.33-1.34g/ml的富含醣类的峰即为凝胶体型的mucins MUC5AC和MUC5B。
为了确认分离得到的mucins，将其与特异识别mucin的多克隆抗血清反应。结果表明，分离得到的片断与MUC2和MUC5B的反应很微弱，而与MUC5AC的反应则很明显，并与主要的醣类峰相吻合(图1)。将mucin解聚并用Mono Q离子交换柱分析并洗脱，洗脱下来的组分通过1％的琼脂糖凝胶电泳，并用购买的一株MUC5AC的单克隆抗体进行western检测，可以明显看到条带，增加曝光时间可以看到两条条带，其中迁移速率较快的一条是单体(图2)。因此可以证实通过此中方法获得的mucin即为MUC5AC。
实施例2 Mucin5AC单克隆抗体的制备1.免疫小鼠动物选择雌性BALB/c 6-8周龄免疫方案长期第一次第一天 50ug抗原/只+CFA sc第二次第十五天50ug抗原/只+IFA sc第三次第二十九天 50ug抗原/只+生理盐水 ip第三十二天融合备注CFA福氏完全佐剂；IFA福氏不完全佐剂；Ip腹腔注射；Iv静脉注射；Sc皮下注射2.融合前测血清效价(表1)。
表1
1血清稀释50倍 2血清稀释250倍 3血清稀释1250倍 4血清稀释6250倍 5血清稀释12500倍 6血清稀释25000倍 7血清稀释50000倍 8血清稀释100000倍 9血清稀释200000倍 10血清稀释400000倍 11血清稀释800000倍 12血清稀释1600000倍AB为复孔一号小鼠 CD为复孔二号小鼠 EF为复孔空白小鼠二号小鼠免疫的效果较好，选择它做融合3.融合当天收集骨髓瘤细胞SP2/0，直接从细胞培养瓶收集4.取免疫小鼠脾脏，收集脾细胞，计数，与SP2/0细胞按10∶1的比例混合。
5.细胞融合A准备1)一支15ml的离心管装10ml1640不完全培养基(终止液)放置37℃水浴2)PEG一份(0.7ml)放置37℃水浴3)配制HAT培养基1640不完全培养基50*HATFBS 20％100*双抗100*HEPESB融合1)脾细胞与SP2/0混合液离心960rpm*8min2)去上清(尽量吸干)，将细胞弹松。
3)1分钟内加入PEG，逐滴加，边加边轻轻混合均匀。
4)37℃水浴1.5分钟。
5)5分钟内加入终止液(沿管壁滑入，勿吹打细胞)轻轻搅匀。
6)取一滴于载玻片观察融合效果，余者960rpm离心8min。
7)弃上清后加入上述HAT培养基。
8)接种与96孔培养板(200ul/孔)置37℃5％CO2培养6.融合后10天左右，待融合细胞克隆长成，用ELISA检测融合细胞是否分泌抗体。
表2
B1muc5A02 F9muc5A037.有限稀释法筛选阳性克隆根据ELISA结果(表2)，选取阳性孔(倾斜粗体)，用移液枪将孔中细胞吹下，计数后取100个细胞溶于20ml1640完全培养基(含20％FBS)，接种于96孔培养板，余细胞置培养瓶中培养。
8.10天左右再复筛。
表3
muc5A02和muc5A03随机挑16个克隆测ELISA，根据结果(表3)，选取阳性孔(倾斜粗体)，用移液枪将孔中细胞吹下，计数后取100个细胞溶于20ml1640完全培养基(含20％FBS)，接种于96孔培养板，余细胞置培养瓶中培养。
9.10天左右再复筛。
表4
muc5A02(A行)和muc5A03(B行)随机挑12个单克隆测ELISA，限据结果(表4)，选取阳性孔(倾斜粗体)，用移液枪将孔中细胞吹下，计数后取100个细胞溶于20ml1640完全培养基(含20％FBS)，接种于96孔培养板，余细胞置培养瓶中培养。
10.10天左右再复筛。
表5
muc5A02(A行)和muc5A03(B行)随机挑12个单克隆测ELISA，根据结果(表5)，选取阳性孔(倾斜粗体)，用移液枪将孔中细胞吹下，计数后取100个细胞溶于20ml1640完全培养基(含20％FBS)，接种于96孔培养板，余细胞置培养瓶中培养。
11.10天左右再复筛。
表6
muc5A02(A行)和muc5A03(B行)随机挑12个单克隆测ELISA，根据结果(表6)，选取阳性孔(倾斜粗体)，由于呈100％阳性两次，用移液枪将孔中细胞吹下，置培养瓶中培养，保存细胞株。所得的两个细胞株muc5A02和muc5A03已经于2005年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所)，其保藏号分别为CGMCC No.1509和CGMCC No.1511，分类命名为Balb/c小鼠杂交瘤细胞。
ELISA的方法如下1.包被把抗原稀释成所需浓度，通常为10ug/10ml，用包被液稀释，100ul/孔加至酶标板，4℃过夜。
2.封闭洗去包被液，用10％胎牛血清或1％的BSA封闭，每孔200ul，37℃放置1.5小时，或室温放置2小时。
3.用洗板机洗涤三次，200ul/次，拍干。
4.加样品第一孔抗体稀释为10*-7mol/l，以后每孔对倍稀释。100ul/孔，37℃放置1小时。
5.重复步骤3。
6.加酶标二抗为酶标羊抗小鼠IgG，用40％小牛血清60％去离子水1∶1000稀释，100ul/孔，37℃放置1小时。
7.重复步骤3。
8.加底物TMBA液+B液(1∶1)，即用即配，100ul/孔，37℃放半小时。
9.终止加2M的硫酸，50ul/孔。
10.酶标仪读数450nm波长测定。
实施例3小鼠腹水制备和抗体提取1.注射0.5ml石蜡至经产孕鼠。
2.两周后，收集muc5A02和muc5A03的单克隆抗体细胞各10*6个注射至上述小鼠。
3.10天左右，当小鼠腹部股出并有一点发黑，体毛有一些竖起时，拉颈处死，打开腹腔取出腹水。
4.3000rpm，15mm。
5.取上清，分装，-20℃保存。
6.购买Amersham Biosciences公司的HITRAP PROTEIN G HP来提纯，请按说明书操作。
实施例4抗体标酶a)称0.004gHRP溶于0.4mlddH2O(溶液1)，称0.006gNaIO4溶于0.469mlddH2O(溶液2)。
b)取(溶液2)0.4ml逐滴加入溶液1，混匀放于4℃，避光30min至溶液呈墨绿色c)取0.4ml1％乙二醇逐滴加入上述液体，混匀放于4℃，避光30min至溶液呈深棕色d)取muc5A03抗体0.5mg加入150ul反应液，放入CBS中4℃透析过夜。
e)取出透析的溶液，计算体积。
f)现配5mg/ml的NaBH4g)加入20ul NaBH4，放于4℃，避光2hr。
h)加入等体积饱和(NH4)SO4，混匀放于4℃，避光3hr。
i)5000rmp离心30minj)取沉淀，用0.5mlPBS溶解，放入PBS中4℃透析过夜。
k)取出标记好的抗体做配对。
实施例5抗体配对1.包被把muc5A02稀释成10ug/10ml，用包被液稀释，100ul/孔加至酶标板，4℃过夜。
2.封闭洗去包被液，用10％胎牛血清，每孔200ul，37℃放置1.5小时，或室温放置2小时。
3.用洗板机洗涤三次，200ul/次，拍干。
4.加Mucin5AC抗原，100ul/孔，37℃放置1小时。
5.重复步骤3。
6.加muc5A03酶标二抗10ug/10ml，100ul/孔，37℃放置1小时。
7.重复步骤3。
8.加底物TMBA液+B液(1∶1)，即用即配，100ul/孔，37℃放半小时。
9.终止加2M的硫酸，50ul/孔。
加入不用浓度的抗原，检测信号强弱是否可以随抗原浓度变化而变化，结果见下表7。
表7
其标准曲线如图3所示。
实施例6临床实验1.本发明者首先对400份正常人血清中MUC5AC的含量进行了检测。健康人均为参与健康体检的人群，没有已诊断明确的疾病，女性同时排除怀孕的情况。健康男性共234人，22-84岁，平均年龄58岁，健康女性共166人，23-85岁，平均53岁。
检测400份健康人血清，并对数据统计分析。
PercentilesSmallest1％ -.6400884 -.7470675％ -.4601312 -.661484110％-.368383 -.6400884 Obs 40025％-.2513477 -.5713412 Sum of Wgt. 40050％-.1221406 Mean -.036624Largest Std.Dev. .454922175％.0160879 1.88638990％.3369825 1.950576 Variance .206954195％.7916414 2.385622 Skewness 3.51276799％75.9697 113.5056 Kurtosis 6.446286从检测结果中，根据百分位数法制定参考值范围，得到其95％的可信区间，从而确定正常人血清中MUC5AC的参考值为0.79μg/ml。
2.检测了100份胃癌患者的血清，99份结肠癌患者血清，以及其他恶性肿瘤血清共计408份。下表8为对恶性肿瘤细胞病人情况的统计。
表8
将测定值超过正常参考值确定为指标阳性，统计各种疾病中的指标阳性率。
恶性肿瘤病人血清中MUC5AC含量要明显高于正常人血清中MUC5AC的含量(mean±SD1.0051674μg/ml±0.5342731μg/ml，p＜0.001)a)疾病病人检测结果统计良性病人为到医院就诊的其他非恶性肿瘤病人。共50例。包括肝硬化9例，慢性乙肝病人(大三阳)7例，慢性支气管炎7例，胃溃疡23例，胃粘膜息肉4例。在良性肿瘤和炎性病人的样品中MUC5AC有不同程度的升高，但是与正常人血清中MUC5AC含量差别不大。(mean±SD0.8234126μg/ml±0.3845618μg/ml，P＞0.05)。
讨论本发明者运用单克隆抗体技术得到了MUC5AC的一系列单克隆抗体细胞株，并从中找到了一对可配对抗体。在临床检测中，通过对408份癌症病人，50份良性病人，400份正常人血清的检测，发现MUC5AC的血清学水平在胃癌病人中要明显高于正常人的，从而可以得出结论本发明所制备的muc5A02和muc5A03这两个单抗细胞株能很好的检测血清中MUC5AC水平；MUC5AC可以作为恶性肿瘤血清学诊断的肿瘤标志物。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。
权利要求
1.特异性识别MUC5AC的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.1509、CGMCC NO.1511的杂交瘤细胞产生。
2.一种用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含一对抗体，由保藏号为CGMCC NO.1509的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第一抗体，以及由保藏号为CGMCC NO.1511的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体作为第二抗体。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其中所述肿瘤选自肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其中所述第一抗体和第二抗体中的任一抗体与标记物偶联。
5.MUC5AC抗体在制备用于血清学检测肿瘤的诊断剂中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、食管癌、胰腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自胃癌。
8.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述单克隆抗体为由保藏号为CGMCCNO.1509、CGMCC NO.1511的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及特异性识别MUC5AC的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.1509、CGMCC No.1511的杂交瘤细胞产生。本发明还涉及包含上述单克隆抗体的用于血清学诊断肿瘤的试剂盒，以及MUC5AC抗体在制备用于血清学检测肿瘤的诊断剂中的用途。
文档编号A61K39/395GK1958612SQ20051003089
公开日2007年5月9日 申请日期2005年10月31日 优先权日2005年10月31日
发明者许晔, 胡明慧 申请人:中资汉脉(北京)生物技术有限公司