真菌调节子的锌双核簇家族转录因子的制作方法

专利名称：真菌调节子的锌双核簇家族转录因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码转录因子的多肽的核酸序列，和由所述核酸序列编码的多肽。
本发明还涉及包含所述核酸序列的构建体、载体和宿主细胞。
此外，本发明涉及包括调节转录因子生产或功能的方法，并且涉及用于表达和生产目标蛋白质的宿主细胞，在所述宿主细胞中转录因子的生产或功能已经得到调节。
另外，本发明涉及目标蛋白质的体内生产方法。
背景技术：
和现有技术已知丝状真菌具有产生广泛的不同代谢物，且特别是具有各种工业化应用的分泌的酶的能力，所述工业化应用包括提供治疗或用于焙烤工业。
在研发真菌转化系统前，生产菌株的改进主要限于基于传统诱变的策略，随后筛选所需的表型或酶促活性，和选择最佳生产者菌株。
在商业上，丝状真菌目前成为广泛使用的用于生产同源和异源蛋白质的宿主细胞系统，且迄今为止，已经成功地将几种分子和遗传手段用于优化丝状真菌作为细胞工厂，特别是那些来自曲霉属(Aspergilli)的丝状真菌。
在许多情况中，这些手段已经导致了同源和异源蛋白质的产率上升，并且基本上减少了大规模实施新的生产过程所需的时间。
然而，对改进的方法仍然存在需求。
丝状真菌为纤维素分解酶和半纤维素分解酶的众所周知的生产者。这些生物体的纤维素酶降解系统由三类酶组成，即内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases)和β-葡糖苷酶。木聚糖为半纤维素，即需要更复杂的一组酶用于其降解的非均质聚合物。这些广泛被分类为木聚糖酶的酶包括内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、乙酰基木聚糖酯酶(acetylxylan esterase)、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶(arabinofuranohydrolase)、β葡糖醛酸糖苷酶、阿魏酸酯酶和对-香豆酰基酯酶(coumaroyl esterase)(方案1)。
曲霉属和木霉属(Trichoderma)物种纤维素降解酶和木聚糖降解酶的表达在转录水平上受到调节。然而，阻抑和诱导机制尚未得到完全阐明。
转录因子xlnR最初克隆自丝状真菌黑曲霉(A.niger)，并且被鉴定为编码木聚糖酶的基因的转录活化物(WO 97/00962)。实际上，已经证实它引发大量基因的转录，所述基因在若干真菌物种中参与纤维素和半纤维素的降解。基于其结构，将XlnR归于真菌转录因子家族，该家族转录因子的DNA结合结构域由螯合两个Zn原子的6个保守半胱氨酸残基组成，即所谓的Zn双核簇(Zn binuclear cluster)。
已经从各种曲霉属(构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)、川地曲霉(A.kawachii)、塔宾曲霉(A.tubingensis)、黄曲霉(A.flavus))，以及从其它真菌，如Hepocrea jecorina(无性型瑞氏木霉(T.reesei))中克隆了XlnR同源物。此外，可以在许多公众可进入的真菌基因组数据库中发现类似的序列，诸如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)、Magnaporthe grisea、Podospora anserina、Fusarium grameniarum。尽管不同物种之间的总体同源性在50-90％范围内改变，但是它在DNA结合结构域中表现出接近100％的同一性，所述的DNA结合结构域包括在蛋白质N-末端部分上的6个半胱氨酸残基的簇。特别地，由序列NQLRTK表示的第二与第三半胱氨酸之间的氨基酸残基的一段序列为极其保守的。一般而言，该序列决定了Zn2Cys6双核簇蛋白质的DNA结合特异性，就XlnR而言，该特异性可识别带有共有核心5′GGCTAR 3′的关连DNA靶标(deVries和Visser，2001；Microbiol Mol Biol Reviews v65497-522)。因此，可以预计所有这些同源物均在涉及木聚糖降解的基因的转录调节中起作用。
最近以来，已经尝试了几种手段用来自丝状真菌的重组宿主细胞改善目标蛋白质(POI)的生产。
文献中记录的用于改善分泌的同源和异源蛋白质的产率的最为直接的策略在于导入多个拷贝的目标结构基因(例如，参见Hessing等，1994)。然而，该手段并非始终导致目标基因的过量表达。真菌细胞中目标蛋白质的浓度也已经通过由强启动子表达它而得到增加(Mathieu和Felenbok，1994；Nikolaev等，2002；Rose和van Zyl，2002。
黑曲霉中木聚糖分解(xylanolytic)和纤维素分解系统的转录和作为结果的总酶生产可以通过增加xlnR的基因拷贝数而得到促进(Gielkens等，1999)。相反，基因破坏使xlnR失活导致细胞外木聚糖分解基因的转录缺失。
另一种手段意旨通过使转录因子的结合位点突变来修饰目标基因的启动子区域。米曲霉xynF1基因的启动子活性通过突变两个非典型的对一种序列的XlnR结合位点序列而得到成功地上调，该序列推定具有最高结合亲和力，所述活性根据β-半乳糖苷酶活性监测(Marui等，2003)。xynF1启动子区域中携带三个典型XlnR结合序列的转化体比那些带有真正启动子的转化体产生2.8倍更多的酶。
碳代谢中涉及的许多基因受到由全局阻抑物(global repressor)CreA介导的碳阻抑。实际上，CreA在几个水平上控制基因表达，并且可以阻抑结构和调节基因。相应启动子中CreA结合位点的缺失或突变导致转录的部分脱抑制和蛋白质生产改善(Orejas等，1999)。在creA脱抑制的背景中获得了进一步改善(Prathumpai等，2004)。
在曲霉属中，D-木糖作为木聚糖分解基因诱导物起作用(de Vries等，1999；Gouka等，1996)。此外，木聚糖酶生产在生长在含L-阿拉伯糖的培养基中的瑞氏木霉(T.reesei)(Xiong等，2004)和变灰白青霉(Penicilliumcanescens)(Vavilova等，2003)中都表现出改善。
代谢控制分析和代谢途径改造是菌株改进的其它有用方式。已经显示在前两个步骤上施加木糖代谢的流出控制(Prathumpai等，2003)。导致D-木糖减少的基因之一被破坏，导致木聚糖酶转录增加(Hasper等，2000)。
通过目标蛋白质与充分分泌的真菌蛋白质的C-末端融合，获得异源蛋白质生产产率的最巨大改善(Ward等，1990，Contreras等，1991)。
此外，具有不需要的活性的基因，如蛋白酶的缺失，表现出在提高表达方面极为有用(Van den Hombergh等，1997)。
本发明的一个目的在于提供改进的方法以增加宿主细胞中目标蛋白质生产，其中代谢调节中涉及的转录因子的活性已经得到改变。
发明概述本发明涉及新的转录因子PntR(表示戊糖调节子(pentose regulator))的鉴定，其为真菌调节子Zn双核簇家族中的成员。
在本文中描述从构巢曲霉、塔宾曲霉和黑曲霉中克隆pntR基因，并且证明对该基因的破坏可损害戊糖代谢，且特别是L-阿拉伯糖代谢，导致XlnR调节的基因的转录提高，和L-阿拉伯糖诱导型基因的下调。作为结果，木聚糖酶和β-葡聚糖酶的生产改善了几倍，而α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性稍微下降。
不希望受到任何特定理论的约束，经实验观察到在某些条件下(在L-阿拉伯糖代谢减少的真菌菌株中)，L-阿拉伯糖或其中间代谢物L-阿拉伯糖醇可以用作与D-木糖类似的XlnR表达的有效诱导物。XlnR水平升高导致XlnR调节的基因的表达增加。
可以将这类代谢受调节的菌株视为有希望的宿主，用于由XlnR控制的启动子驱动的优化的异源表达。
在一个宽泛的方面中，本发明提供了在宿主细胞中表达POI(目标蛋白质)的方法，所述POI的编码序列处于由XlnR调节的启动子的转录控制下，该方法包含在所述的宿主细胞中产生转录因子PntR的敲减。这类表达方法可以用于生产POI的生产方法中。
在一个宽泛的方面中，本发明进一步涉及生物体，诸如微生物，特别是真菌，其已经被修饰而具有转录因子PntR的敲减，以便能够产生高水平的POI，所述POI的编码序列处于由XlnR调节的启动子的转录控制下。
本发明具有优势，因为它可以提供在丝状真菌中产生目标蛋白质的改进的生产方法。
转录因子“PntR”特别意指来源于真菌且优选丝状真菌的pntR基因或蛋白质。因此，在一个优选的实施方案中，编码PntR的核苷酸序列是可获自真菌(尽管它实际上不一定获自)的PntR序列，所述PntR为被选择或靶向来在本发明宿主细胞中敲减的。在一个特别优选的实施方案中，所述的真菌选自构巢曲霉、黑曲霉和塔宾曲霉。
来自可以靶向来敲减的真菌物种的其它合适的PntR基因包括那些来源于其它曲霉属(米曲霉、川地曲霉、黄曲霉和烟曲霉)以及来自其它真菌的PntR基因，所述的其它真菌包括，但不限于隐球酵母属(Cryctococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、镰孢霉属(Neurospora)、青霉属、Piromyces、踝节菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)和木霉属的菌株。
在另一个方面中，本发明涉及分离的和/或纯化的新PntR多肽或其功能片段，其中所述的PntR多肽可来源于真菌物种。本发明还提供了编码所述PntR多肽的核酸序列。
注意到本发明提供了使用真菌生产系统体内生产蛋白质的改进方法。这类改进的方法迄今为止在本领域中尚未披露或提示。
本发明的方面在权利要求和下列说明中提供。
为便于参照，在适当的小节标题下讨论本发明的这些和其它方面。然而，各小节中的教导不一定限于每一具体的小节。
作为本发明涉及使用，术语“产生(produce)”、“生产(producing)”、“产生的(produced)”、“可产生(producible)”、“生产(production)”与相应的术语“制备(prepare)”、“制备(preparing)”、“制备的(prepared)”，“制备(preparation)”、“产生的(generated)”、“产生(generation)”和“可制备的(preparable)”同义。
作为本发明涉及使用，术语“表达(expression)”、“表达(expresses)”、“表达的(expressed)”和“可表达的(expressable)”与相应的术语“转录(transcription)”、“转录(transcribes)”、“转录的(transcribed)”和“可转录的(transcribable)”同义。
作为本发明涉及使用，术语“转化”和“转染”意指将核酸序列导入宿主、宿主细胞、组织或器官的方法。
涉及可以用于本发明的核苷酸序列的其它方面包括包含本发明序列的构建体；包含用于本发明的序列的载体；包含用于本发明序列的质粒；包含用于本发明的序列的转化的细胞；包含用于本发明的序列的转化的组织；包含用于本发明的序列的转化的器官；包含用于本发明的序列的转化的宿主；包含用于本发明的序列的转化的生物体。本发明还包括使用它们表达用于本发明的核苷酸序列的方法，诸如在宿主细胞中表达；包括用于转化它们的方法。本发明进一步包括分离核苷酸序列，诸如从宿主细胞中分离它们的方法。
涉及用于本发明的氨基酸序列的其它方面包括编码用于本发明的氨基酸序列的构建体；编码用于本发明的氨基酸序列的载体；编码用于本发明的氨基酸序列的质粒；编码用于本发明的氨基酸序列的转化的细胞；表达用于本发明的氨基酸序列的转化的组织；表达用于本发明的氨基酸序列的转化的器官；表达用于本发明的氨基酸序列的转化的宿主；表达用于本发明的氨基酸序列的转化的生物体。本发明还包括使用它们用于纯化用于本发明的氨基酸序列的方法，诸如在宿主细胞中表达；包括转化它们且然后纯化所述序列的方法。
附图简述方案1显示丝状真菌中阿拉伯木聚糖降解途径的示意图。


图1.质粒pSFH1的图谱。
图2.质粒pPntRΔ-pyrG的图谱。
图3.典型构巢曲霉ΔpntR缺失体中的一种(ΔpntR1)与受体pyrG89argB2菌株(R)比较在MM上的生长试验，用1％的如所示各碳源。
图4.来自构巢曲霉ΔpntR转化体的基因组DNA的DNA印迹分析，所述基因组DNA用ClaI限制酶消化。用pntR的5′片段探测印迹，并且在60℃使用1xSSC，0.1％SDS洗涤。
图5.用10mM D-木糖或L-阿拉伯糖醇诱导后，受体(R)和ΔpntR1缺失体(D1)菌株的酶测定(上)和转录分析(下)。
图6.来自构巢曲霉(N)、黑曲霉(402)和塔宾曲霉(1和10)菌株的基因组DNA的Southern印迹。
图7.质粒pAN7-ΔPntR的图谱。
图8.在具有1％L-阿拉伯糖的CM和MM上用质粒pAN7-ΔPntR转化的塔宾曲霉1M-7的生长试验(左图)，和缺失体Δ20和1M-7菌株的Southern印迹(右图)。
图9.塔宾曲霉1M-7受体和pntR缺失体D5和D20菌株在1％果糖+0.1％YE、1％果糖+0.1％YE+10mM L-阿拉伯糖和1％木糖+0.1％YE上生长后，木聚糖酶(Xln)、β-葡聚糖酶(Egl)和α-阿拉伯呋喃糖苷酶(Abf)的活性。将20μl培养物样品用于木聚糖酶和β-葡聚糖酶测定，而100μl用于α-阿拉伯呋喃糖苷酶。对木聚糖酶和β-葡聚糖酶而言，使反应进行10分钟，而对α-阿拉伯呋喃糖苷酶而言，使反应进行60分钟。以O.D.表示活性。
图10.塔宾曲霉1M-7受体和pntR缺失体菌株D2、D3、D5、D10、D12、D20、D22在具有甜菜浆的复合培养基上生长后，木聚糖酶(Xln)、β-葡聚糖酶(Egl)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(Abf)和β-半乳糖苷酶(Bgal)的活性。
图11.丝状真菌中阿拉伯木聚糖途径的方案，和编码PntR转录因子的基因缺失对代谢和XlnR调节的基因表达的影响。
图12.来自不同曲霉属物种的PntR同源物的序列比对。
图13.质粒pExSlac2的图谱。
图14.在构巢曲霉对照(CLac1、CLac2)和携带pExSlac2表达质粒的pntRΔ1缺失体(DpntRLac1、DpntRLac2、DpntRLac3)菌株的培养基中测定的b-半乳糖苷酶的细胞外活性。非转化的菌株(C)用作内源性活性的对照。使全部菌株在1％果糖+0.2％YE+10mM L-阿拉伯糖和1％木糖+0.2％YE上生长3天。将50ul培养物样品用于酶促测定。使反应在30℃下进行10分钟。以O.D.表示活性。
发明详述本发明在第一个方面中提供了在宿主细胞中表达目标蛋白质(POI)的方法，所述的目标蛋白质(POI)的编码序列处于由XlnR调控的启动子的转录控制下，该方法包含在所述的宿主细胞中产生转录因子PntR的敲减。
所谓的术语″转录因子″意指具有转录调控活性的多肽。
合适的情况是，该方法提供了POI表达的增加，即与在未按照本发明修饰的宿主细胞中获得的目标蛋白质的表达水平相比，目标蛋白质的表达水平增加。
XlnR调控大范围的细胞外碳水化合物水解酶的转录，包括主要的木聚糖分解酶。因此，在本发明的一个实施方案中，目标蛋白质(POI)可以由天然XlnR调控的基因编码。在曲霉属中的天然XlnR调控的基因包括例如xlnA、B、C、D、xyrA、eglA、B、C、axhA、axeA、aguA、faeA、cbhA、B和aglB(de Vries和Visser，2001)。在另一个实施方案中，POI为异源蛋白质。
所谓的术语同源蛋白质，我们理解为POI，在宿主细胞的亲代细胞中，其编码序列天然处于由XlnR调控的启动子的转录控制下。
所谓的术语同源蛋白质，我们理解为POI，在宿主细胞的亲代细胞中，其编码序列并非天然处于由XlnR调控的启动子的转录控制下。这类POIs的实例包括亲代细胞中不受由XlnR调控的启动子控制的蛋白质，或来源于非宿主的亲代细胞的生物体的蛋白质。
合适的情况是，POI为木聚糖分解(xylanolytic)酶，诸如木聚糖酶或内切葡聚糖酶。在本发明的一个优选的实施方案中，POI为异源蛋白质。这类目标POI包括，但不限于淀粉酶、氧化还原酶、脂酶、肌醇六磷酸酶、果胶分解或果胶修饰酶。
由XlnR调节的启动子的实例为来自塔宾曲霉的木聚糖酶A、xlnA和内切葡聚糖酶A、eglA的启动子。例如，xlnA启动子的序列由Graaff等，1994(Mol.Microbiol，v12479-490)描述。
本文首次鉴定了转录因子PntR。PntR为真菌调节子的Zn双核簇家族的成员。尽管本申请描述了在SEQ ID NOS1、3和5中所述的曲霉属中PntR的基因序列，但是本发明的方法还引入了对相当于或同源于曲霉属PntR的PntR的敲减。术语“相当于曲霉属PntR”意指转录因子具有与曲霉属PntR相同的序列，或具有与曲霉属PntR 60％以上同一的序列。该方法进一步引入了对其它真菌物种，且特别是其它丝状真菌物种中PntR同源物的敲减。
在一个优选的实施方案中，转录因子PntR包含如SEQ ID NO2，4或6中任一中所述的氨基酸序列。
所谓“调节(modulate)转录因子PntR”或“破坏PntR表达”意指修饰，且特别是减少PntR表达或活性，以便产生所述转录因子的降低水平或零水平。特别地，PntR的修饰、调节、破坏或敲减(knock down)意指敲除(Knockout)技术，以便通过重组技术消除或减少特异性基因序列的表达。这类技术为本领域技术人员众所周知的，并且包括通过基因沉默技术使选择的基因产生功能丧失的技术，诸如同源重组、基因破坏，反义和siRNA技术。合适的技术在实施例部分中描述。
调节进一步涉及通过诸如显性负性蛋白质表达方法在蛋白质水平上敲减转录因子功能。这类技术为本领域技术人员所熟悉。例如，可以通过导入编码功能遭破坏的PntR的核酸序列，诸如，编码PntR和缺乏编码Zn2Cy6的区域的核酸序列，调节转录因子功能。合适的宿主细胞包括丝状真菌细胞，包括曲霉属、木霉属和青霉属(Penicillium)的物种。其它合适的宿主细胞包括担子菌纲(basidiomycetes)、酵母和细菌。
在一个实施方案中，所述的方法进一步包含分离/纯化所述的POI。
在本发明的另一个方面中，提供了PntR转录因子。合适的情况是，所述的转录因子包含相当于曲霉属PntR的氨基酸序列或其功能等效物。
所谓“曲霉属PntR”意指来自曲霉属物种的PntR。特别地，曲霉属PntR意指来自构巢曲霉、黑曲霉和塔宾曲霉的PntR。其它曲霉属物种包括米曲霉、川地曲霉、烟曲霉和黄曲霉。
来自真菌物种的可以靶向敲减的其它合适的PntR基因包括那些来源于其它真菌的基因，所述的其它真菌包括，但不限于隐球酵母属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、Magnaporthe、毛霉属、镰孢霉属、青霉属、Piromyces、踝节菌属、热子囊菌属和木霉属的菌株。
术语“其功能等效物”意指与曲霉属PntR具有相同功能特征的转录因子。
优选本发明该方面的转录因子具有与曲霉属PntR相同的氨基酸序列或至少75％同一(同源)的序列。
合适的情况是，转录因子包含如SEQ ID NO2，4或6中任一中所述的氨基酸序列，或与之具有至少75％同一性(同源性)的序列，或其有效片段。在一个优选的实施方案中，本发明提供了分离和/或纯化的多肽，其具有如SEQ ID NO2，4或6中任一所述的氨基酸序列，或之具有至少75％同一性(同源性)的序列，或其有效片段。
本发明在另一个方面中提供了分离和/或纯化的核酸分子，编码曲霉属PntR的PntR转录因子的核酸或核苷酸序列，或其同源物。合适的是，所述的分离和/或纯化的核酸分子编码多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO2、4或6中任一所示的氨基酸序列，或与之具有至少75％同一性(同源性)的序列，或其有效片段。在另一个实施方案中，本发明提供了分离和/或纯化的核酸分子或包含核苷酸序列的序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO1、3或5中的任一相同或与之互补、或含有对SEQ ID NO1、3或5中任一的任一密码子的合适密码子取代，或包含与SEQ ID NO1、3或5中任一具有至少60％，65％，75％，80％，85％，90％，95％或99％序列同源性的序列。
在另一个方面中，本发明涉及如下所示的核苷酸序列和核苷酸序列的应用(a)如SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列；(b)核苷酸序列，其为如SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段；(c)核苷酸序列，其为在SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的补体；(d)核苷酸序列，其为在SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段的补体；(e)能够与SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；(f)能够与SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段杂交的核苷酸序列；(g)核苷酸序列，其为能够与SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的补体；(h)核苷酸序列，其为能够与SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段杂交的核苷酸序列的补体；(i)能够与SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的补体杂交的核苷酸序列；(j)能够与SEQ ID No.1、3或5中任一所示的核苷酸序列的变体、同源物、衍生物或片段的补体杂交的核苷酸序列。
本发明的核苷酸序列可以包含编码SEQ ID No.2、4或6中任一或其变体、同源物或衍生物的序列。
本发明的核苷酸序列可以用于产生相应序列，这些序列用于敲减用于本发明方法的细胞中的PntR表达。特别地，本发明的核苷酸序列可以用于鉴定siRNA分子或反义分子，这些分子可以用于敲减PntR表达。此外，如果鉴定pntR基因外部的侧翼区域，本发明的核苷酸序列可以是有用的，所述侧翼区域可以用于通过诸如同源重组这类技术产生pntR敲除。这些和其它合适的方法为本领域技术人员熟知的。
本发明还提供了包含如本文所述的PntR或其同源物或衍生物的质粒或载体系统。优选所述的质粒或载体系统包含SEQ ID No1、3或5中任一所述的核酸序列，或与之至少75％同源的序列，或其有效片段。合适的是，所述的质粒或载体系统为微生物中用于表达任一所述转录因子的表达载体，所述的转录因子由SEQ ID No1、3或5中任一所述的核酸序列或与之至少75％同源(同一)的序列编码。合适的表达载体如本文所述。
在本发明的一个方面中提供了用本发明任何方面的核酸转化或转染的宿主细胞。
在本发明的另一个方面中，提供了分离的核酸分子，该核酸分子被排列(arranged)以敲减转录因子PntR的表达或功能。合适的核酸分子包括那些包含遭破坏的PntR编码区域以用于同源重组手段的分子。用于产生这类构建体的方法为本领域技术人员所熟知。一种合适的方法和构建体在本文中示例。其它合适的核酸分子包括siRNA分子和反义构建体。
在本发明的另一个方面中提供了用核酸构建体转化或转染的宿主细胞，该核酸构建体被排列以敲减转录因子PntR的表达或功能。合适的情况是，PntR为如本文所述的曲霉属PntR或其同源物或衍生物。在一个实施方案中，所述的核酸构建体包含用于同源重组手段的遭破坏的PntR编码区域。
合适的情况是，所述的宿主细胞进一步包含核酸构建体，该构建体包含在受XlnR调节的启动子的转录控制下的目标蛋白质(POI)。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞为微生物，包括真菌。合适的真菌宿主细胞包括丝状真菌，包括那些选自由曲霉属、木霉属和青霉属组成的组的那些丝状真菌。
在一个实施方案中，本发明该方面的宿主细胞具有L-阿拉伯糖代谢阻滞。
所谓“L-阿拉伯糖代谢阻滞”意指与未修饰的细胞相比，用核酸构建体转化或转染的宿主细胞具有较低的L-阿拉伯糖代谢水平，所述核酸构建体被排列以敲减转录因子PntR的表达或功能。用于检测L-阿拉伯糖代谢阻滞的合适的方法如本文所述。
在另一个实施方案中，本发明的宿主细胞表现出木聚糖酶活性增加。
所谓“木聚糖酶活性增加”意指与未修饰的细胞相比，用核酸构建体转化或转染的宿主细胞具有较高的木聚糖酶水平，所述核酸构建体被排列以敲减转录因子PntR的表达或功能。用于测定所述活性的合适的方法如本文所述。
在另一个实施方案中，所述的宿主细胞包含额外的修饰，诸如，例如所述的宿主细胞可以具有蛋白酶缺陷的背景。
本发明的另一个方面提供了转录因子PntR调节在制备宿主细胞用于增加目标蛋白质(POI)的表达中的用途，所述的目标蛋白质(POI)的编码序列处于由XlnR调节的启动子的转录控制下。
优选的方面附带权利要求和下列描述和实施例部分中提供了优选的方面。
额外的优点本发明具有优点，因为它提供了用于合成各种目标蛋白质，且特别是用于合成细胞外木聚糖酶的改进的微生物学方法。
构巢曲霉和塔宾曲霉菌株中PntR的破坏损害L-阿拉伯糖代谢，导致XlnR-调节的基因转录提高和L-阿拉伯糖-诱导型基因的下调。作为结果，木聚糖酶和β-葡聚糖酶的生产改进了若干倍，而α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性稍微降低。可以将这类代谢受调节的菌株视为用于优化由受XlnR控制的启动子驱动的异源表达的有希望的宿主。
使用这种改进的微生物学方法生产的木聚糖酶在食品工业中的各种应用中是有用的，诸如焙烤和饮料产品，它们还可以用于其它应用，诸如食品生产，乃至在造纸或纺织工业中用于纸张和织物漂白。
如本文所述，PntR敲除(缺失或破坏或任何功能丧失的突变)在含有糖甜菜的工业相关复合培养基上或有L-阿拉伯糖或L-阿拉伯糖醇存在下，导致XlnR-控制的基因包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-木糖苷酶显著(3-5倍)增加。
本发明的方法能够改善木聚糖酶的生产，并且一般还可以改善异源蛋白质表达。
丝状真菌中的高水平蛋白酶通常限制了同源和异源蛋白质的高水平表达。通过使用蛋白酶缺陷菌株，曲霉属中的蛋白质生产明显改善。传统和基因破坏技术已经产生了蛋白酶背景降低的菌株。在阻抑几种蛋白酶表达的条件下观察到了产物产率的进一步改善(Van den Hombergh等，1997)。在本发明中，最佳表达条件可以为所提供的碳源有限的那些条件，其中有利的是可以将pntR敲除与蛋白酶缺陷背景组合。
分离的一方面，优选所述序列为分离的形式。术语″分离的″意指该序列至少基本上不含至少一种其它组分，而这种组分是与该序列天然相关联的，如天然所发现的那样。
纯化的一方面，优选所述序列为纯化的形式。术语″纯化的″意指该序列处于相对纯的状态-例如至少约90％纯的，或至少约95％纯的，或至少约98％纯的。
核苷酸序列本发明的范围包括编码具有如本文所定义的特定特性的转录因子的核苷酸序列。
如本文所用的术语″核苷酸序列″指寡核苷酸序列、核酸或多核苷酸序列，及其变体，同源物，片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因组或合成或重组起源的，其可以是双链或单链的，不管代表有义链还是反义链。
涉及本发明的术语″核苷酸序列″或″核酸分子″包括基因组DNA，cDNA，合成DNA，和RNA。优选其指DNA，更优选指编码本发明的cDNA序列。
在优选的实施方案中，当涉及和当被本发明的自身范围所包括时，核苷酸序列并不包括处于天然环境之中、并与其天然相关联的一个或多个序列相连的根据本发明的天然核苷酸序列，而所述天然相关联的序列也处于其天然环境之中。为了方便参考，我们将把这种优选的实施方案称为“非天然核苷酸序列”。在这点上，术语″天然核苷酸序列″意指处于其天然环境之中的完整核苷酸序列，以及当它与天然相关联的完整启动子可操作性连接之时，所述启动子也处于天然环境之中。不过，本发明的范围所包括的氨基酸序列可以是其天然生物中表达后分离和/或纯化的核苷酸序列产物。不过，本发明的范围所包括的氨基酸序列优选可以在其天然生物中由核苷酸序列所表达，但是其中所述核苷酸序列并不在该生物中与所述核苷酸序列天然相关联的启动子的控制之下。
核苷酸序列的制备一般，本发明的范围所包括的氨基酸序列或用于本发明的核苷酸序列是利用重组DNA技术制备的(即，重组DNA)。不过，在本发明的备选实施方案中，可以利用本领域公知的化学方法全部或部分地合成核苷酸序列(参见Caruthers MH(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 215-23和Horn T等，(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。
由表达所述转录因子的任何细胞或生物可以鉴定和/或分离和/或纯化出编码具有如本文所定义的特定特性的转录因子或适于修饰的转录因子的核苷酸序列。本领域已知多种方法来鉴定和/或分离和/或纯化核苷酸序列。举例来说，一旦已经鉴定和/或分离和/或纯化了合适的序列，就可以使用PCR扩增技术以制备更多序列。
作为进一步的举例，利用来自产生所述转录因子的生物的染色体DNA或信使RNA可以构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果已知该转录因子的氨基酸序列或该转录因子的部分氨基酸序列，可以合成标记的寡核苷酸探针并用来由基因组文库鉴定编码转录因子的克隆，所述文库由所述生物制备。或者，可以利用包含与另一种已知转录因子基因同源的序列的经标记的寡核苷酸探针来鉴定编码转录因子的克隆。在后一种情况中，利用低严谨度的杂交和洗涤条件。
在又一个备选方案中，可以通过已确立的标准方法合成性制备编码转录因子的核苷酸序列或用于本发明的方法的核苷酸序列，例如由BeucageS.L.等，(1981)Tetrahedron Letters 22，p 1859-1869所述的氨基磷酸酯(phosphoroamidite)方法，或由Matthes等，(1984)EMBO J.3，p 801-805所述的方法。在氨基磷酸酯方法中，例如在自动DNA合成仪中合成寡核苷酸，纯化，退火并克隆在合适的载体中。
核苷酸序列可以是混合的基因组和合成起源的，混合的合成和cDNA起源的，或混合的基因组和cDNA起源的，通过根据标准技术连接合成的、基因组的或cDNA起源(根据需要)的片段而制备。每一个连接的片段都对应于完整核苷酸序列的各部分。还可以通过聚合酶链式反应(PCR)利用特定引物来制备DNA序列，例如在US 4,683,202或在Saiki R K等，(Science(1988)239，pp 487-491)中所述的。
由于遗传密码的简并性，可以轻易地生产核苷酸序列，其中对于一些或所有由原始核苷酸序列编码的氨基酸改变了三联体密码子用法，由此产生与原始核苷酸具有低同源性的核苷酸序列，但是其编码与原始核苷酸序列所编码的相同、或变体氨基酸序列。例如，对于大多数氨基酸来说，遗传密码的简并性是在三联体密码子中的第三个位置上(摆动位置)(参考文献见Stryer，Lubert，Biochemistry，Third Edition，Freeman Press，ISBN0-7167-1920-7)，因此，所有三联体密码子都在第三位置上发生“摆动”的核苷酸序列与原始核苷酸序列将具有大约66％的同一性，然而，改变的核苷酸序列将与原始核苷酸序列编码相同或变异的一级氨基酸序列。
因此，本发明进一步涉及任何核苷酸序列，所述核苷酸序列对于编码氨基酸的至少一个三联体密码子改变了三联体密码子用法，但是其编码与原始核苷酸序列编码的多肽序列相同、或变体的多肽序列。
另外，具体的生物一般对于用来编码氨基酸的三联体密码子有所偏好。优选的密码子用法表是随处可得的，并且可以用来制备密码子优化基因。常规使用这些密码子优化技术来优化异源宿主中的转基因表达。
分子进化一旦分离和/或纯化了编码转录因子的核苷酸序列，或鉴定了编码推定的转录因子的核苷酸序列，就可以修饰选择的核苷酸序列，以便产生基因破坏或功能丧失的突变体。例如，需要对序列进行突变，以便制备显性负性转录因子或可选择的功能丧失的突变体。
可以利用合成性寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸包含位于所需突变位点侧翼的核苷酸序列。
在Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中描述了合适的方法。在Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p 147-151)中描述了将突变引入编码转录因子的核苷酸序列的另一种方法。
除了诸如上面所述的定点诱变之外，还可以例如利用商业试剂盒如来自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒，或来自Clontech的DiversifyPCR随机诱变试剂盒随机引入突变。
获得新序列的第三种方法是对非同一的核苷酸序列进行片段化，通过利用任一种限制性酶，或酶如DNA酶I，并重新组配编码功能性蛋白质的完整核苷酸序列。或者可以使用一种或多种非同一核苷酸序列并在完整核苷酸序列的组配过程中引入突变。
因而，有可能在体内或体外在核苷酸序列中产生多个定点或随机突变，随后通过各种方法筛选所编码的多肽的所需功能性。
氨基酸序列本发明的范围还包括具有如本文所定义的特定性质的转录因子的氨基酸序列。还提供了氨基酸序列，其基于本文所鉴定的转录因子，但被产生或修饰以便通过诸如显性负性手段这类方法提供所表达的PntR的敲减。
如本文所用的，术语″氨基酸序列″与术语″多肽″和/或术语″蛋白质″同义。在一些情况下，术语″氨基酸序列″与术语″肽″同义。在一些情况下，术语″氨基酸序列″与术语″酶″或“转录因子”同义。
氨基酸序列可以由合适的来源制备/分离，或者其可以合成制备或者可以通过利用重组DNA技术来制备。
当涉及或者当被本发明的自身范围所包括时，氨基酸序列优选不是天然转录因子。在这一点上，术语″天然转录因子″意指在其天然环境下的完整转录因子，并且当其由天然核苷酸序列表达。
变体/同源物/衍生物本发明还包括转录因子的任何氨基酸序列或编码这种转录因子的任何核苷酸序列的变体、同源物和衍生物的用途。
在这里，术语“同源物”意指与氨基酸序列和核苷酸序列具有一定同源性的实体。在这里，术语″同源性″可以等同于“同一性”。
在本文中，同源的氨基酸序列用来包括可以与所述序列至少75，80，81，85或90％同一，优选至少95，96，97，98或99％同一的氨基酸序列。一般而言，同源物包含相同的功能区域等，例如与本主题氨基酸序列相同的功能区域。特别地，优选同源物包含对转录因子活性而言必不可少的功能结构域，包括，例如那些对DNA识别和与转录机制相互作用而言必不可少的结构域。尽管同源性也可以用相似性(即具有类似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑，在本发明的上下文中，优选用序列同一性表示同源性。
“功能片段”意指保留该多肽的特征性特性的多肽片段。在本发明的上下文中，PntR转录因子的功能片段是保留完整蛋白质的激活子能力的片段。
在本文中，同源的核苷酸序列用来包括可以与编码本发明的转录因子的核苷酸序列(目标序列)至少60，65，75，80，81，85或90％同一，优选至少95，96，97，98或99％同一的核苷酸序列。一般，同源物将包含与目标核苷酸序列编码功能性位点等的序列相同的序列。尽管同源性也可以用相似性(即具有类似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑，在本发明的上下文中，优选用序列同一性表示同源性。
对于氨基酸序列和核苷酸序列来说，可以通过肉眼，或者更常借助于易于得到的序列比较程序来进行同源性比较。这些商业上现有的计算机程序可以计算两个或多个序列之间的％同源性。
％同源性可通过毗邻序列来计算，即，将一个序列与另一个序列进行序列对比，并且一个序列中的每个氨基酸直接与另一个序列的相应氨基酸进行每次一个残基的比较。这被称为“无缺口的”序列对比。通常，所述无缺口的对比只在相对少量的残基中进行。
尽管这是非常简单且一致的方法，但是它没有考虑到，例如，在除此之外相同的序列配对中，一个插入或缺失将导致随后的氨基酸残基被逐出序列对比，因此当进行整体排列时，将很可能导致％同源性的大幅度下降。因此，多数序列比较方法被设计成考虑到可能的插入和缺失而不会对整体同源性积分不适当地罚分，从而产生最佳的序列对比。这通过在序列对比中插入“缺口”来试图最大化局部的同源性而实现。
但是，这些更复杂的方法对序列对比中出现的每个缺口指定了“缺口罚分”，这样，对于相同数量的相同氨基酸，带有尽可能少的缺口的序列对比——反映两个比较序列之间的更高相关性-将比有较多缺口的序列获得更高的积分。一般用“远交缺口计分(Affine gap costs)”来给缺口的存在扣(charge)较多的计分，给缺口中每个随后的残基扣较少罚分。这是最普遍使用的缺口积分系统。高缺口罚分当然将产生具有较少缺口的最优化的序列对比。多数序列对比程序允许修改缺口罚分。但是当使用这种软件作序列比较时，优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit包时，氨基酸序列的缺省缺口罚分是缺口为-12，每个延伸为-4。
因此最大％同源性的计算首先需要产生考虑到缺口罚分的最佳序列对比。用于进行这种比对的合适的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等，1984，Nucleic Acids Research 12387)。可以进行序列比较的其他软件的例子包括，但不局限于BLAST软件包(参见Ausubel等，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第四版，第18章)，FASTA(Atschul等，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和GENEWORKS比较工具系列。BLAST和FASTA都可得到，用于脱机和联机检索(参见Ausubel等，1999，ShortProtocols in Molecular Biology，第7-58到7-60页)。
不过，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。一种称作BLAST2序列的新工具也可以用于比较蛋白和核苷酸序列(见FEMS MicrobiolLett 1999 174(2)247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
尽管最终同源性百分比可以根据同一性而测量，对比过程自身一般不以全或无成对比较为基础。相反，通常使用按比例绘制的(scaled)相似性评分矩阵将得分分配到每个以化学相似性或进化距离为基础而进行的成对比较。这种常用矩阵的一个例子是BLOSUM62矩阵，即BLAST程序系列的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序一般用公共默认值或如果已提供，则使用自定义符号比较表(更详细内容见用户手册)。对于一些应用，优选将公共默认值用于GCG软件包，或在使用其它软件的情况下，使用缺省矩阵，如BLOSUM62。
或者，可以利用DNASISTM(Hitachi软件)中的多重比对特征，基于类似于CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM(1988)，Gene 73(1)，237-244)的算法来计算百分比同源性。
一旦软件产生最优对比，就有可能计算％同源性，优选％序列同一性。软件一般作为序列比较的一部分进行此计算并产生以数字表示的结果。
序列也可以有氨基酸残基的缺失、插入或取代，其产生沉默改变并导致产生功能等同物。可以根据氨基酸特性(如残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或双亲性)的相似而进行有意的氨基酸取代，所以将氨基酸以官能团分类在一起是有用的。氨基酸可以仅仅基于它们的侧链特性而分类在一起。不过，包括突变数据等更加有用。由此衍生的氨基酸组有可能由于结构的原因而是保守的。这些组能够以Venn图表的形式描述(Livingstone C.D.和Barton GJ.(1993)″Protein sequence alignmentsastrategy for the hierarchical analysis of residue conservation″Compiit.ApplBiosci.9745-756)(Taylor W.R.(1986)″The classification of amino acidconservation″J.Theor.Biol.119；205-218)。例如根据下表可以制备保守性取代，所述表描述了普遍接受的氨基酸分类的Venn图表。
本发明也包含可以发生的同源取代(这里用到的取代和替代都表示现有氨基酸残基与备选残基的交换)，即相似物取代相似物，如碱性取代碱性，酸性取代酸性，极性取代极性等等。也可发生非-同源取代，即从一类残基取代为另一类，或者包括引入非天然氨基酸如鸟氨酸(以下简称Z)，二氨基丁酸鸟氨酸(以下简称B)，正亮氨酸鸟氨酸(以下简称O)，吡啶丙氨酸，噻吩丙氨酸，萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。
也可通过非天然氨基酸进行替代。
变体氨基酸序列可以包括可以插入序列的任意两个氨基酸残基之间的适当间隔子基团，包括烷基，例如甲基、乙基或丙基，以及氨基酸间隔子，如甘氨酸或β丙氨酸残基。本领域的技术人员将容易理解变异的其它形式，其包括类肽形式的一种或更多氨基酸残基的存在。为了免除怀疑，“类肽形式”用来指变体氨基酸残基，其中α碳取代基是在残基的氮原子上，而不是在α碳上。制备类肽形式的肽的方法是本领域中公知的，如Simon RJ等，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。
用于本发明的核苷酸序列可以包括合成或修饰的核苷酸。寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，和/或在分子的3′和5′端添加吖啶或多聚赖氨酸链。为了本发明的目的，要理解在此所描述的核苷酸序列可以通过本领域已有的任何方法进行修饰。可以进行这种修饰以便提高本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。
本发明还包括与本文给出的序列互补的核苷酸序列，或其任何衍生物、片段或其衍生物的用途。如果序列与其片段互补那么该序列可以用作探针来在其它生物等中鉴定类似的编码序列。
可以以多种方式获得与本发明的序列不具有100％同源性但是落在本发明范围内的多核苷酸。可以例如通过探测从许多个体，例如来自不同种群的个体制备的DNA文库，来获得本文所述的序列的其它变体。此外，可以获得其它的同源物并且这样的同源物及其片段通常能够任选地与在本文的序列表中显示的序列杂交。这样的序列可以通过探测制备自其它物种的cDNA文库或来自其它物种的基因组DNA文库，并在中度至高严格条件下，用包含在后附的序列表中的任何一个序列的全部或部分的探针探测这些文库来获得。应用类似的考虑来获得本发明的多肽或核苷酸序列的物种同源物和等位基因变体。
还可以使用简并PCR来获得变体和菌株/物种同源物，所述简并PCR使用这样的引物，所述引物被设计以靶向变体和同源物中的序列，所述序列编码本发明的序列中的保守氨基酸序列。保守序列可以例如通过比对来自数种变体/同源物的氨基酸序列进行预期。序列比对可以使用本领域已知的计算机软件来进行。例如，广泛使用GCG Wisconsin PileUp程序。
在简并PCR中使用的引物包含一个或多个简并位点并且将在这样的严格条件下使用，所述严格条件低于用针对已知序列的单序列引物克隆序列所使用的那些条件。
或者，这些多核苷酸可以通过被表征的序列的定点诱变来获得。这在例如需要沉默密码子序列变化以优化特定宿主细胞的密码子偏好的情况中可以是有用的，在所述特定宿主细胞中多核苷酸序列被表达。可能需要其它的序列变化以引入限制性酶识别位点，或改变由所述多核苷酸编码的多肽的性质或功能。
可以使用本发明的多核苷酸(核苷酸序列)来产生引物，例如PCR引物，用于选择性扩增反应的引物，探针例如，通过常规方式，使用放射性或非放射性标记标记以具有显示性的标记，或者可以将所述多核苷酸克隆入载体中。这些引物、探针和其它片段的长度将至少为15，优选至少20，例如至少25，30或40个核苷酸，并且也被本文所用的术语本发明的多核苷酸所包括。
可以重组性地，合成性地，或通过本领域技术人员已知的任何方法来生产根据本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针。其还可以通过标准技术进行克隆。
通常，将通过合成方法来生产引物，包括一次一个核苷酸来逐步生产所需的核酸序列。利用自动技术实现此的技术可以轻易在现有技术中获得。
一般将利用重组方法来生产较长的多核苷酸，例如利用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术。可以将引物设计成包含合适的限制性酶识别位点从而可以将扩增的DNA克隆入合适的克隆载体中。
生物学活性优选所述变体序列等与本文所给出的序列至少同样具有生物学活性。
如本文所用的“生物学活性”指一种序列，其具有与天然发生的序列相似的结构功能(但不必同等程度)，和/或相似的调控功能(但不必同等程度)，和/或相似的生化功能(但不必同等程度)。
杂交本发明还包括与本发明的序列互补的序列或可以与本发明的序列或其互补序列杂交的序列。
如本文所用的术语“杂交”应包括“使核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。
本发明还包含可以与这里所述序列，或其任意衍生物、片段或其衍生物互补的序列杂交的核苷酸序列的用途。
术语“变体”还包括可以与这里所述核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
优选，术语“变体”包括与可以在严谨条件下(如50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})与此处呈现的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
更优选，术语“变体”包括与可以在高严谨条件下(如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})与此处呈现的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。
本发明还涉及可以与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括本文给出序列的互补序列)。
本发明还涉及与可以与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括本文给出序列的互补序列)互补的核苷酸序列。
可以在中度到最大严谨度条件下与本文给出的核苷酸序列杂交的多核苷酸序列也包括在本发明的范围中。
在一个优选方面，本发明包含可以在严谨条件下(如50℃和0.2×SSC)与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
在一个更优选的方面，本发明包含可以在高严谨条件下(如65℃和0.1×SSC)与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。
调节蛋白质表达或功能的方法可以用合适的分子/试剂修饰PntR转录因子的功能活性，所述的分子/试剂直接或间接结合PntR蛋白质或编码它的核酸。试剂可以为天然存在的分子，诸如肽类和蛋白质，例如特异性活化的蛋白激酶，或它们可以为代谢物，如糖类或多元醇类或其衍生物，或它们可以为合成分子。
调节PntR转录因子蛋白质的表达水平的方法包括例如使用反义技术。
反义构建体，即与有义核酸或mRNA互补的核酸构建体，优选RNA，详细描述在US 6,100,090(Monia等)和Neckers等，1992，Crit Rev Oncog3(1-2)175-231中，特别将这两篇对比文件的教导引入作为参考。调节基因表达的其它方法为本领域技术人员所已知，并且包括显性负性手段以及导入抑制基因表达或功能活性的肽类或小分子。
RNA干扰(RNAi)为由直接导入双链RNA(dsRNA)诱导的转录后基因沉默(PTGS)的方法，并且已经作为在各种生物体中敲除特异性基因表达的有用工具。RNAi由Fire等在Nature 391806-811(1998)描述。其它PTGS方法是已知的并且包括例如导入转基因或病毒。一般而言，在PTGS中，合成了沉默基因的转录物，但其未蓄积，因为它被快速降解。例如，在Ambion.com互联网网站中，在目录“/hottopics/”下、在文件“rnai”中描述了用于PTGS的方法，包括RNAi。
用于体外RNAi的合适的方法为本领域技术人员所公知。一种这类方法包括导入siRNA(小干扰RNA)。目前的模型表明这些21-23个核苷酸的dsRNAs可以诱导PTGS。例如，在上述Ambion网站中描述了用于设计有效siRNAs的方法。
定点诱变一旦分离和/或纯化出编码PntR转录因子的核苷酸序列，或鉴定出编码推定的转录因子的核苷酸序列，可以预期使序列突变。例如，可以将遭破坏的PntR序列导入细胞以便通过同源重组破坏内源性PntR基因。本文描述了合适的构建体。或者，可以使PntR序列突变，以便制备中断天然表达的PntR的功能或表达的显性负性蛋白质。
可以用合成寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点的侧翼核苷酸序列。
适合的方法公开于Morinaga等(Biotechnology(1984)2，p646-649)中。另一种将突变引入编码转录因子的核苷酸序列中的方法描述于Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)。另一种方法描述于Sarkar和Sommer(Biotechniques(1990)，8，p404-407-“The megaprimermethod of site directed mutagenesis”)中。
重组的在一方面，用于本发明的序列是重组序列-即已经利用重组DNA技术制备的序列。
这些重组DNA技术是本领域普通技术人员能力范围内的技术。这些技术在文献，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring HarborLaboratory Press中进行了解释。
合成的在一方面，用于本发明的序列是合成的序列-即已经通过体外化学或酶学合成制备的序列。其包括但不限于，用宿主生物偏好的密码子用法制备的序列。
蛋白质的表达用于本发明的核苷酸序列可以被并入重组可复制载体。该载体可以用于复制、和在相容性宿主中和/或由相容性宿主以酶的形式表达该核苷酸序列。
可以用控制序列例如调控序列控制表达。
表达载体术语“质粒”、“载体系统”或“表达载体”意指能够体内或体外表达的构建体。在本发明的上下文中，这些构建体可以用来将编码所述转录因子的基因导入宿主细胞中。适当地，其表达可被导入的基因可以称作“可表达的转基因”。
在另一个实施方案中，这些构建体可以用于将基因导入宿主细胞，所述基因在XlnR启动子序列的控制下编码目标蛋白质。
优选，将表达载体掺入合适的宿主生物体的基因组。术语“掺入”优选包括稳定掺入基因组。
本文所述的核苷酸序列，包括本发明的核苷酸序列，可以存在于载体中，其中核苷酸序列被可操作性连接到调控序列上，所述调控序列能够通过适当宿主生物体提供核苷酸序列的表达。
用于本发明的载体可以被转化到下面所述的适当宿主细胞中，从而提供本发明多肽的表达。
载体例如质粒、粘粒或噬菌体载体的选择通常将取决于其将要导入的宿主细胞。
用于本发明的载体可以包含一种或多个可选择的标记基因-如赋予抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。或者，可以通过共转化来实现选择(如WO91/17243中所述)。
可以体外使用载体，例如来生产RNA，或用来转染、转化、转导或感染宿主细胞。
因而，在另一个实施方案中，本发明提供制备本发明的核苷酸序列的方法，该方法是通过将本发明的核苷酸序列导入可复制的载体，将该载体导入相容的宿主细胞中，和在能够带来载体复制的条件下生长所述宿主细胞而进行的。
所述载体可以进一步包含能够使载体在所研究的宿主细胞中复制的核苷酸序列。这些序列的实例为质粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMBl和pIJ702的复制起点。
调控序列在一些应用中，用于本发明的核苷酸序列可操作性地连接到调控序列上，所述调控序列能够提供核苷酸序列的表达，如通过选定的宿主细胞的表达。例如，本发明包括这样一种载体，其包含可操作性地连接到这种调控序列上的本发明的核苷酸序列，即所述载体是表达载体。
合适的是，就POI的表达而言，编码POI的基因可操作地与启动子序列连接，这能够使该序列处于由XlnR调节的启动子的转录控制下。合适的所述启动子序列可以为xlnA或eglA启动子序列。
术语“可操作性地连接”指一种毗连，其中所述组分的关系使得其以其所希望的方式发挥作用。以特定的方式连接“可操作性地连接”到编码序列上的调控序列，从而在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。
术语“调控序列”包括启动子和增强子和其它表达调控信号。
以本领域正常意义使用术语“启动子”，例如RNA聚合酶结合位点。
还可以通过选择异源调控区例如启动子、分泌前导区和终止子区域来增加编码本发明的POI的核苷酸序列的表达。
优选，根据本发明的核苷酸序列可操纵地与至少一个启动子连接。
指导核苷酸序列在细菌、真菌或酵母宿主中转录的合适的启动子的实例是本领域众所周知的。
构建体术语“构建体”-其与术语如“缀合物”、“弹夹”和“杂交体”同义-包括按照本发明使用的核苷酸序列。这样的构建体可以直接或间接与启动子连接。
间接连接的实例是在启动子和本发明的核苷酸序列之间提供适合的间隔子基团，如内含子序列，如Sh1-内含子或ADH内含子。涉及本发明的术语“融合的”也是如此，其包括直接或间接连接。在一些情况中，该术语不包括核苷酸序列的天然组合，所述核苷酸序列编码与野生型基因启动子相关联的蛋白质，并且当它们均处在天然环境中时。
所述构建体可以甚至包含或表达容许选择遗传构建体的标记。
对于一些应用而言，优选地，本发明的构建体至少包含与启动子可操纵连接的本发明的核苷酸序列。
宿主细胞涉及本发明的术语″宿主细胞″包括任何细胞，所述细胞包含如上所述的核苷酸序列或表达载体，并且用于重组生产具有如本文定义的特定性质的转录因子，或用于本发明的方法。
因此，本发明的另一个实施方案提供用表达本发明所述的转录因子的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。选择细胞来与所述载体相容并且所述细胞可以例如是原核生物(例如细菌)、真菌、酵母或植物细胞。优选地，所述宿主细胞不是人细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了宿主细胞，所述宿主细胞由本发明方法产生，即包含编码POI的基因，所述基因在由XlnR调节的启动子转录控制下可操作地连接，其中所述的宿主细胞进一步包含PntR表达或活性的敲减。
合适的宿主生物体的实例为真菌细胞，包括丝状真菌。
宿主细胞可以为蛋白酶缺乏或蛋白酶负型菌株，诸如曲霉属的pep-或prt蛋白酶缺乏菌株(van den Hombergh，1997，Curr Genet Jul；32(1)73-81)。
可以修饰宿主细胞的基因型以便改善表达。
宿主细胞修饰的实例包括蛋白酶缺陷、碳分解代谢物脱阻抑、稀有tRNA′的补充和细胞质中还原电势的改变以便促进二硫键形成。
生物体涉及本发明的术语″生物体″包括这样的任何生物，所述生物可以包括编码如在本发明中所述的转录因子的核苷酸序列和/或获自其中产物，和/或其中当本发明的核苷酸序列存在于所述生物中时，启动子可以容许根据本发明的核苷酸序列的表达。此外，术语“生物体”扩展至按照本发明方法产生的生物体，即被修饰以增高的水平表达POI。
合适的生物体可以包括真菌。其它合适的生物体可以包括酵母或植物细胞。
涉及本发明的术语″转基因生物″可以包括这样的任何生物，所述生物包括编码如在本发明中所述的转录因子的核苷酸序列和/或获自其中的产物，和/或其中启动子可以容许根据本发明的核苷酸序列在所述生物中的表达。优选地，将所述核苷酸序列掺入所述生物的基因组中。
术语″转基因生物″不包括当它们在其天然启动子控制下时，在它们天然环境中的天然核苷酸编码序列，所述天然启动子也在其天然环境中。
因此，本发明的转基因生物包括这样的生物，所述生物包含编码如本发明所述的转录因子的核苷酸序列，根据本发明的构建体，根据本发明的载体，根据本发明的质粒，根据本发明的细胞，根据本发明的组织，或其产物中的任何一种，或其组合。
例如，所述转基因生物还可以包括在异源启动子控制下编码本发明的转录因子的核苷酸序列。
宿主细胞/生物体的转化如上所述，宿主生物体可以为真核生物体，并且特别是真菌。特别优选丝状真菌。合适的这类宿主的实例包括属于Thermomyces、支顶孢属(Acremonium)、曲霉属、青霉属、毛霉属、链孢霉属、木霉属等属的任何成员可以使用本领域中公知的各种方法转化丝状真菌细胞-诸如包括原生质体形成和转化原生质体，随后按照公知的方式使细胞壁再生的方法。曲霉属作为宿主微生物的应用描述在EP 0 238 023中。有关转化丝状真菌的技术还综述在US-A-5741665中，该文献中描述了用于转化丝状真菌的标准技术，并且培养真菌为本领域众所周知的。例如，Davis和de Serres，MethodsEnzymol(1971)17A79-143中发现了作为应用于粗糙链孢霉(N.crassa)的技术的广泛综述。有关转化丝状真菌的额外教导综述在US-A-5674707中。
在一个方面中，所述的宿主生物体属于曲霉属，诸如黑曲霉。
用于真菌中转化的合适的标记包括，但不限于编码鸟氨酸氨甲酰转移酶、argB和乳清酸核苷-5′-一磷酸脱羧酶、pyrG的抗性基因。
还可以通过下列教导制备本发明的转基因曲霉属，例如Turner G.1994(用于遗传操作的载体Martinelli S.D.，Kinghorn J.R.(Editors)Aspergillus50 years on.Progress in industrial microbiology vol 29.Elsevier Amsterdam1994.pp.641-666)。还可以使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化转化丝状真菌(Gouka等，1999，Nat.Biotech)。丝状真菌中的基因表达综述在Punt等(2002)Trends Biotechnol 2002 May；20(5)200-6，Archer &Peberdy Crit Rev Biotechnol(1997)17(4)273-306中。
培养和生产用本发明的核苷酸序列转化的宿主细胞可以在有益于POI的产生并有利于POI从所述细胞和/或培养基中回收的条件下培养。
因此，本发明提供了表达POI的方法，它可以是生产所述POI的方法的一部分，并且进一步包含分离和/或纯化所述的POI。
用于培养细胞的培养基可以为适合于使所述宿主细胞生长并且获得酶的表达的任何常规培养基。
可以在细胞表面上展示用重组细胞生产的蛋白质。
POI可以从宿主细胞中分泌并且可以便利地使用众所周知的操作步骤从培养基中回收。
分泌可以希望使POI从表达宿主中分泌到其中POI可能更易于回收的培养基中。根据本发明，分泌前导序列可以基于期望的表达宿主进行选择。杂交体信号序列也可以用于本发明的背景中。
异源分泌前导序列的典型实例是从真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-例如来自曲霉菌的18和24个氨基酸的形式)，α-因子基因(酵母，例如，酵母属(Saccharomyces)，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)和汉森氏酵母属(Hansenula))或α-淀粉酶基因(芽孢杆菌属)起源的那些。
作为实例，在大肠杆菌中的异源蛋白质的分泌在Methods Enzymol(1990)182132-43中进行综述。
检测用于检测和测量氨基酸序列的表达的各种方法是本领域众所周知的。实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)，放射免疫测定法(RIA)和荧光激活的细胞分选术(FACS)。
广泛种类的标记和缀合技术是本领域那些技术人员已知的并且可以用在多种核酸和氨基酸测试中。
许多公司如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)，Promega(Madison，WI)，和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)提供用于这些步骤的商业试剂盒和方法。
适合的报告分子或标记包括那些放射性核素，酶，荧光，化学发光，或显色剂以及底物，辅因子，抑制剂，磁性颗粒等。教导这些标记的应用的专利包括US-A-3,817,837；US-A-3,850,752；US-A-3,939,350；US-A-3,996,345；US-A-4,277,437；US-A-4,275,149和US-A-4,366,241。
此外，可以如在US-A-4,816,567中所显示产生重组免疫球蛋白。
融合蛋白可以将根据本发明使用的氨基酸序列和根据本发明产生的POI作为融合蛋白进行制备，从而例如有助于提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，6xHis，GAL4(DNA结合和/或转录激活结构域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体和目标蛋白序列之间可以方便地包括蛋白水解剪切位点，从而容许去除融合蛋白序列。
优选地，融合蛋白不会干扰蛋白质序列的活性，虽然在一个实施方案中显性负性转录因子手段是优选的。
已经在Curr Opin Biotechnol(1995)6(5)501-6中综述了在大肠杆菌中的基因融合表达系统。
在本发明的另一个实施方案中，氨基酸序列可以连接于异源序列以编码融合蛋白。例如，为了筛选能够影响物质活性的试剂的肽库，编码表达由商购抗体识别的异源表位的嵌合物质可以是有用的。
在本发明的一个实施方案中，例如，为改善异源蛋白质生产产率，使POI的C-末端与充分分泌的真菌蛋白质，诸如葡糖淀粉酶、木聚糖酶或内切葡聚糖酶或其部分融合。
例如，还可以使用肽文库以显性负性手段中修饰PntR。
其它序列还可以结合一个或多个另外的目标蛋白质(POI)或目标核苷酸序列(NOI)来使用根据本发明应用的序列。
POIs的非限制性实例包括木聚糖或纤维素代谢中涉及的蛋白质或酶或其组合。其它合适的POIs包括，但不限于肌醇六磷酸酶、脂酶、淀粉酶或哺乳动物目标蛋白质，诸如人抗体、组织纤溶酶原激活物和白细胞介素。NOI甚至可以为那些序列中任一的反义序列。
其它序列也可以有利于分泌或增加分泌的POI的产率。这类序列可以编码伴侣蛋白，例如作为UK专利申请9821198.0中所述的黑曲霉cypB基因的产物。
可以改造编码POI的NOI，以便因许多原因而改变其活性，包括，但不限于改变其表达产物的加工和/或表达的改变。作为另一个实例，还可以修饰NOI以便优化特定宿主细胞中的表达。需要其它序列改变以便引入限制酶识别位点。
编码POI的NOI可以在其中包括合成或修饰的核苷酸-诸如甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链。
可以修饰编码POI的NOI以便增加胞内稳定性和半衰期。可能的修饰包括，但不限于在分子的5′和/或3′末端添加侧翼序列或使用分子主链内硫代磷酸酯或2′O-甲基，而不是磷酸二酯酶键。
抗体本发明的一个方面涉及与SEQ ID No.2、4或6中任一的氨基酸具有免疫反应性的氨基酸。
可以通过标准技术，诸如用本发明的物质进行免疫或通过使用噬菌体展示文库产生抗体。
出于本发明的目的，除非相反地指出，术语“抗体”包括，但不限于，多克隆，单克隆，嵌合的，单链，Fab片段，通过Fab表达文库产生的片段及其模拟物。这些片段包括完整抗体的片段，其保留它们对于目标物质，Fv，F(ab′)和F(ab′)2片段，以及单链抗体(scFv)，融合蛋白和包括抗体的抗原结合位点的其它合成蛋白质的结合活性。此外，抗体及其片段可以是人源化抗体。中和抗体，即，抑制物质多肽的生物活性的那些，对于诊断和治疗是尤其优选的。
如果需要多克隆抗体，用本发明的序列(或包含其免疫表位的序列)免疫选定的哺乳动物(例如，小鼠，兔，山羊，马等)。根据宿主的物种，可以使用各种佐剂来增加免疫应答。
收集来自被免疫的动物的血清，并根据已知的方法对其进行处理。如果包含针对本发明的序列(或包含其免疫表位的序列)的多克隆抗体的血清包含针对其它抗原的抗体，可以通过免疫亲和层析来纯化多克隆抗体。用于产生和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了可以制备这些抗体，本发明还提供本发明的多肽或其片段，其半抗原化(haptenise)成另一种多肽来在动物或人中用作免疫原。
针对本发明的序列(或包含其免疫表位的序列)的单克隆抗体还可以由本领域技术人员容易地制备，并且包括，但不限于，杂交瘤技术Koehler和Milstein(1975Nature 256495-497)，人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，(1983)Inmunol Today 472；Cote等，(1983)Proc Natl Acad Sci802026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，(1985)Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy，Alan Rickman Liss Inc，pp 77-96)。
此外，可以使用为产生“嵌合抗体”所开发的技术，剪接小鼠抗体基因与人抗体基因从而获得具有适合的抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 816851-6855；Neuberger等，(1984)Nature312604-608；Takeda等，(1985)Nature 314452-454)。
或者，可以将对于生产单链抗体所述的技术(美国专利号4，946，779)进行改进以产生物质特异性单链抗体。
还可以产生包含对于所述物质的特异性结合位点的抗体片段。例如，这样的片段包括，但不限于，可以通过用胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab′)2片段和可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键产生的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库以容许快速和容易地鉴定具有需要的特异性的单克隆Fab片段。(Huse WD等，(1989)Science 2561275-1281)。
通过将PntR-特异性抗体导入真菌以便掩蔽其功能，抗体可以用于改变PntR的功能。
大规模应用在本发明的一个优选实施方案中，本发明的方法用于大规模应用。特别地，本发明的方法可以用于大规模生产酶，诸如用于工业化应用的木聚糖酶。目标POI可以为人抗体(Ward等2004 Appl Envirom Microbiol v 702567-2576)、乳铁蛋白(Ward等，1991基因，v 122219-223)、生长激素、白细胞介素6、超氧化物岐化酶(Davies R.W.″Molecular industrial Mycologysystems and applications for filamentous fungi″(S.A.Leong和R.M.Berka，eds.)，pp.45-58.Morris-Bekker，New York-Basel-Hong Kong，1991)。
PntR序列的应用如上所述，在不同物种中鉴定转录阻抑物PntR能够产生修饰的细胞，在所述细胞中敲减了PntR表达，使得处于XlnR启动子控制下的基因表达增加。因此，PntR序列可以用于鉴定敲减表达的合适方式。
因此，本发明进一步涉及编码PntR的核苷酸序列在生产载体或系统以敲减或敲除PntR表达中的应用。例如，在本文实施例部分中描述了合适的载体，，并且包括用于基因破坏的同源重组的系统。优选这类构建体导入了缺乏Zn2Cys6双核簇的PntR变体。
此外，本发明涉及这类表达载体或系统在生产宿主细胞中的应用，所述的宿主细胞具有与天然水平相比较低水平的PntR表达，并且进一步包含在XlnR启动子控制下编码POI的基因。这类宿主细胞用于蛋白质生产。
因此，本发明进一步提供了在XlnR调节下表达POI的宿主细胞以便产生用于制造食品的POI。
食品可以将所述化合物用作食品，或用在食品的制备中。在此处，术语“食品”以广泛意义使用，并且包括用于人的食品和食物以及用于动物的食物(即饲料)。在优选的方面，所述食品用于人类食用。
根据使用和/或应用的模式和/或施用的模式，食品可以以溶液的形式或作为固体形式存在。
食品组分和添加剂POI可以用作食品组分。
本文所用的术语“食品组分”包括制品，其为或可以加入到功能性食品或膳食中，并且包括制品，所述制品可以以低水平在广泛种类的产品中使用，所述产品需要例如酸化或乳化。
食品组分可以为溶液或固体形式-取决于使用和/或应用方式和/或施用方式。
化合物可以为食品添加剂，或可以加入到食品添加剂中。
功能食品和营养药POI可以为功能性食品，或可以加入到功能性食品中。
本文所用的术语“功能性食品”意指食品，所述食品不仅能够提供营养作用和/或味道上的满足，而且能够将额外的有益作用递送给消费者。
尽管对功能性食品尚无法律意义上的定义，但是关注该领域的大部分社会团体均认为它们为作为具有特定保健作用而销售的食品。
食物产品通过本发明改进的方法生产的酶或POI可以用于制备食物产品，诸如下列中的一种或多种糖果产品；乳制品；肉类产品；禽类产品；鱼制品；和焙烤产品。
在某些方面中，优选膳食为焙烤产品-诸如面包、丹麦酥皮饼(Danishpastry)、饼干(biscuit)或小甜饼(cookies)。
本发明还提供了制备食品或食品组分的方法，该方法包含将通过本发明方法生产的POI与另一种食品组分混合。该制备方法或食品组分也为本发明的另一个方面。
造纸工业木聚糖酶，包括在XlnR控制下的那些木聚糖酶，可以用于纸张漂白。此外，其它POI，诸如内切葡聚糖酶，可以用于纺织品应用。
药物例如，POI，诸如抗体，可以用于药物。例如，参见Ward等，2004。
一般重组DNA方法技术除非另作陈述，否则，本发明使用常规的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术，它们属于本领域技术人员的能力范围。这类技术在文献中解释。例如，参见J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，ColdSpring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1995和定期增刊；CurrentProtocols in Molecular Biology，ch.9，13，和16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，和A.Kahn，1996，DNA Isolation and SequencingEssential Techniques，John Wiley & Sons；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach，Irl Press；and，D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of EnzymologyDNA Structure Part ASynthesis和Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，AcademicPress。将这些常用教科书各自引入作为参考。
实施例现在在下列非限制性实施例中进一步例示本发明。
1.真菌菌株和生长条件。构巢曲霉菌株pyrG89 argB2获自Prof.C.Scazzocchio(Institut de Genetique et Microbiologie，Orsay，France)。黑曲霉N402菌株(cspAl)获自TNO Nutrition and Food Research Institute(Netherlands).塔宾曲霉1M-7、4M-147和10M-61菌株来自Danisco collection of cultures。将菌株维持在基本培养基或完全培养基上。
基本培养基(MM)含有(每1l)1g NaNO3，1.5g of KH2PO4，0.5g of KCl，0.5g MgSO4和50ml按照Vishniac和Santer，1957的微量元素(10g EDTA，4.4g ZnSO4x7H2O，1g MnCl2x4H2O，0.32g CoCl2x5H2O，0.22g(NH4)6Mo7O24x4H2O，1.47g CaCl2x2H2O，1g FeSO4x7H2O)。除非另作陈述，否则1％果糖用作碳源。就营养缺陷型菌株而言，根据需要添加必要的补充剂10mM尿苷和2.5mM精氨酸。就完全培养基(CM)而言，给完全培养基补充10g果糖、2g胨、1.5g酪蛋白氨基酸、1g酵母提取物和无菌过滤的10ml 100x维生素溶液(50mg硫胺素HCl，10mg生物素，100mg烟酸，200mg泛酸Ca，50mg吡哆醇HCl，100mg核黄素，500mg对氨基苯甲酸(Cove，1966)。在高压灭菌前，调整培养基的pH，对塔宾曲霉而言，调整至5.5；对黑曲霉而言，调整至6；对构巢曲霉而言，调整至6.5。就固体培养基而言，将琼脂加入至3％。给液体培养物接种106个孢子/ml并且以180-220rpm在旋转摇动器上孵育。在37℃培养构巢曲霉，而在32℃培养塔宾曲霉和黑曲霉菌株。所有发酵均在烧瓶中进行。
就DNA制备而言，使真菌菌株在CM上生长过夜，并且将菌丝体样品收集在漏斗上并且冷冻在液氮中。
2.构巢曲霉pntR基因的克隆和缺失载体pPntRΔ-pyrG的构建。通过PCR从构巢曲霉基因组DNA扩增含有来自构巢曲霉毗连群1.7(http//www.broad.mit.edu/annotation/fungi/aspergillus/index.html毗连群位置23984-26497bp)的推定的XlnR同源物的区域。为了从菌丝体样品中提取DNA，将冷冻在液氮中的0.2g生物量研磨成粉末并且重新悬浮于0，8ml提取缓冲液中0.2M Tris-HCl，pH 8.0，1％SDS，1mM EDTA。在冰上孵育10-20分钟后，通过标准酚-氯仿提取方法分离DNA，并且在使用乙醇沉淀后，将其重新悬浮于100-200μl H2O，随后在37℃用50μgRNAse A(Qiagen)处理15分钟。将约50-100ng基因组DNA进一步用于PCR扩增。所有PCR反应均使用Expand High Fidelity PCR Amplification System(Roche)在50μl总体积中进行。该反应体系含有5μl 10x延伸缓冲液、3.5个单位的Taq和Pfu DNA聚合酶混合物、200μM dNTP混合物、50ng DNA模板和40pmol下列序列的每种引物R1.7T40 5′GCGGGGAGCATAATATATACAGGTCCAGTT 3′和R1.7B3795 5′TGAATCTCGTCTTGGGAAGGATTCAAGATG 3′。
使用下列程序进行扩增94℃3分钟；94°45秒、56℃1分钟和72℃3分钟，30个循环。使用在72℃10分钟的额外的延伸循环。在凝胶上纯化3.75kb PCR产物并且克隆入pCR-Blunt II载体(Invitrogen)，产生质粒pSFH1(图1)。该片段包括分别具有0.75和0.5kb的5′和3′侧翼区的推定的ORF(参见SEQ ID NO1)。可以将编码区翻译成单一ORF而不含任何终止密码子。然而，在构巢曲霉数据库中，注释该序列含有一个内含子，该内含子不会打断ORF。可以通过计算机分析预测该推定的内含子，因为此前没有有关pntRcDNA的实验数据。
图1.质粒pSFH1的图谱M13正向(5′GTAAAACGGCCAG 3′)和反向(5′CAGGAAACAGCTATGAC 3′)引物用于检查序列的可靠性和克隆的插入片段的取向。在ABI 3100序列分析仪(Applied Biosystems)上，使用BigDyeTerminator V3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)和500ng模板与3.2pmol引物进行DNA测序。
在第二步骤时，在相似条件下，使用下列提供的引物组合，通过PCR扩增部分重叠pntR序列的3.4kb上游基因组片段R1.7T Spe 603 5′GGACTAGTGCAGGATGATCGCATCGACAATTATATAAG3′R1.7B Nde 40085′AAAGTCTGGAAGGAATCAGGGAAAAGCAAG 3′。
用限制酶SpeI和NdeI切割纯化的PCR产物。注意在扩增过程中引入SpeI位点。用相同的酶消化2-3μg上述pSFH1质粒，使用Gel ExtractionKit(Qiagen)从琼脂糖凝胶上洗脱载体，并且使用Rapid Ligation Kit(Roche)与PCR产物连接。将连接混合物用于转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(Invitrogen)。在含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上选择转化体。用限制酶NdeI和BstZ171切割2μg所得载体，并且用DNA聚合酶I的Klenow片段填入(fill-in)以产生平端。然后将其用于插入包含烟曲霉pyrG基因的1.9kb片段，所述片段通过EcoRV切割分离自pCDA21质粒(Chaveroche等，2000)。通过EcoRI和KpnI消化检查插入片段的取向。用于缺失构巢曲霉基因组中的pntR基因的内源性拷贝的pPntRΔ-pyrG质粒的图示在图2中提供。在缺失构建体中，pyrG基因替代了ATG密码子上游5′侧翼序列的214bp和编码部分的301bp，包括Zn2Cys6双核簇，由此使序列的剩余部分失活(如果被表达的话)。
图2表示质粒pPntRΔ-pyrG的图谱。
3.构巢曲霉中pntR的敲除。为了缺失内源性pntR基因，用7.7kb长的线性片段将构巢曲霉受体菌株pyrG89argB2转化成尿苷原养型，所述片段是通过用限制酶EcoRV消化10μgpPntRΔ-pyrG质粒后分离的。用GelExtraction Kit(Qiagen)从琼脂糖凝胶纯化的约1-3μg片段被用于转化。使用真菌转化的标准方法(Tilburn等，1983)。简言之，在25℃下使受体菌株生长在含有1％葡萄糖和补充剂的400ml MM中过夜。收集菌丝体，用水洗涤并且将1g重新悬浮于用10mM磷酸钠，pH 5.8缓冲的10ml 1.2M MgSO4溶液中。在30℃和缓慢搅拌下用40-50mg/ml非纯化的Glucanex(Laffort，France)处理菌丝体。2-3小时孵育后，在显微镜检查后监测到足够数量的原生质体时，用相同的缓冲液稀释消化菌丝体，并且通过在其上覆盖用100mM Tris，pH 7.5缓冲的0.6M D-山梨糖醇并离心而分离原生质体。用含有10mM Tris，pH 7.5和10mM CaCl2(STC)的1.2M山梨糖醇溶液将从界面上采集的原生质体洗涤2次，并且在107-108/ml浓度下重新悬浮于STC中。将200μg原生质体溶液与1-3μgDNA片段和含有10mM Tris，pH 7.5和10mM CaCl2的50μl 60％PEG 6000溶液一起冰上孵育20分钟。在添加额外0.5ml相同PEG溶液后，将该混合物在室温下放置5分钟，并且在含有1M蔗糖和精氨酸作为补充剂的MM上铺板。针对尿苷原养型选择转化体。在37℃下孵育3天后，获得约100-150个转化体并且分析。如所示的(图3)，在含有1％的各碳源的MM测试平板上进行对pntR缺失体的最初步筛选。在62个测试的候选物中，有10个在L-阿拉伯糖上的生长严重受损，并且在D-半乳糖上的生长轻度延缓(图3)。在含有0.1％果糖与10mM L-阿拉伯糖和10μg/ml 4-甲基-伞形酮酰(umbelliferyl)-β-D-木糖苷作为底物的MM上进一步测试它们β-木糖苷酶活性的改善。在254nm下所有均表现出强的荧光，而受体菌株则不显现。
图3表示在如所示的1％的各碳源的MM上，与受体pyrG89 argB2菌株(R)相比，典型构巢曲霉ΔpntR缺失体之一(ΔpntR1)的生长试验结果。
为了检查天然pntR基因座是否得到破坏，通过Southern印迹分析分析几种转化体(Sambrook等，1989)。用50U限制酶 ClaI(Biolabs)将如上所述从不同转化体中分离的5-10μg基因组DNA切割3小时，并且在TBE缓冲液中在0.7％琼脂糖凝胶上分离。将消化的样品转至尼龙膜(Amersham)上并且与P32-放射性标记的pntR基因的DNA片段杂交。通过用EcoRI切割pSFH1质粒并且洗脱0.94kb长的片段分离该片段。使用Random PrimingKit(Stratagen)，用50μCi P32-dCTP标记50ng片段。正如图4中观察到的，转化体ΔpntR1、ΔpntR2、ΔpntR3、ΔpntR4仅含有pntR基因的不同大小的一条带，而pntR11则除此之外还含有野生型拷贝。上部的带的大小相当于插入pyrG基因后预计的大小。选择敲除菌株pntR1用于进一步研究。
图4显示来自用ClaI限制酶消化的构巢曲霉ΔpntR转化体的基因组DNA的Southern印迹分析。用pntR的5′片段探测印迹，并且在60℃下用1xSSC，0.1％SDS洗涤。
4.pntR缺失对构巢曲霉产生的细胞外糖酶(carbohydrolases)表达水平的作用。为了测试推定的XlnR同源物PntR是否影响构巢曲霉中木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的表达，在用D-木糖或L-阿拉伯糖醇诱导时检查ΔpntR1缺失体的相应活性。由于这一目的，所以首先使构巢曲霉培养物预先在CM上生长16小时，用H2O洗涤并且将1g湿菌丝体转入含有如所示的0.1％果糖与10mM终浓度的诱导糖(D-木糖或L-阿拉伯糖)或多元醇(L-阿拉伯糖醇)的100ml MM中。将不含诱导物的培养物用于监测表达的基础水平。在转移后9和24小时测定细胞外活性。在40℃下测定木聚糖酶和β-葡聚糖酶活性，而在30℃下测定β-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性。在所有试验中，将培养物样品的等分试样(20-200μl)加入到pH 5.0的30mM乙酸钠缓冲液中，再加上底物，得到终体积1ml。将一片XylazymeT-XYZ1000(Megazyme)、一片β-Glucazyme(Megazyme)、0.2mg对-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷和1mg邻-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(Sigma)分别用作木聚糖酶、β-葡聚糖酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶的底物。将酶促反应孵育不同时间，并且通过添加9ml 0.2M Tris-碱(就木聚糖酶和β-葡聚糖酶而言)或0.5ml 1M Na2CO3(就α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶而言)终止反应。分别在590、405或420nm处测定反应混合物的光密度。除非另作陈述，否则以相对O.D.单位表示活性。
正如图5中所观察到的，在用L-阿拉伯糖醇诱导时ΔpntR1缺失体对D-木糖的绝对木聚糖酶活性高于受体菌株20倍。在受体菌株中，对L-阿拉伯糖醇的木聚糖酶水平可以忽略不计。在L-阿拉伯糖上观察到类似的，但较低的作用(未显示，但进行了实验)。与此相似的是，在木聚糖酶过量表达后，α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性稍微降低。可以推定可以用L-阿拉伯糖代谢的改变解释观察到的现象(推定导致中间代谢物、L-阿拉伯糖醇或其的细胞内浓度升高)。这导致XlnR的活化能力较高，且结果是在其控制下的基因，诸如木聚糖酶的更有效转录活化，正如通过RNA印迹分析所评价的。PntR显然正面影响α-阿拉伯呋喃糖苷酶以及负责L-阿拉伯糖代谢的酶。
图5表示在用10mM D-木糖或L-阿拉伯糖醇诱导后，受体(R)和ΔpntR1缺失体(D1)菌株的酶测定(上)和转录分析(下)。在转移后9小时取用于木聚糖酶测定和RNA分离的样品，而在转移后24小时进行α-阿拉伯呋喃糖苷酶测定。为了进行木聚糖酶测定，在反应中使用100μl培养液，将其孵育10分钟。就α-阿拉伯呋喃糖苷酶而言，加入200μl至得到1ml终体积并且将反应体系孵育60分钟。在RNA印迹中每个泳道上加载约10μg总RNA并且与三种木聚糖酶来源的探针杂交。将acnA(γ-肌动蛋白)探针用作内部对照以便校准加载的RNA的量。使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)，按照供应商的推荐从菌丝体样品中分离总RNAs，用乙二醛使其变性并且如Sambrook等(1989)所述在1％琼脂糖凝胶上分离。如上所述，使用下列基因特异性引物通过PCR从基因组DNA扩增木聚糖酶探针XlnA T675 5′AATCTCTCCTAGTTCTCTGTTGCGCTGC 3′和XlnA B1380 5′TACTCTGGTACCCCTCCGTTGCAACAAT 3′；XlnB T651 5′ATGGTCTCCTTCTCATCCCTTCTCCT 3′和XlnB B1354 5′CGGTAATAGAAGCAGATCCACTGCTC 3′；XlnC T1053 5′TGATCTTTTTGTCGCGGCCGGCAAAT 3′和XlnC B1876 5′TGGCGTAGCTCGCAGAGTCCAGGCTAAT 3′.
由pSF5质粒的2.5kb BamHI-KpnI片段制备acnA探针(Fidel等，1988)。在55℃下用1xSSC，0.1％SDS洗涤印迹。
此外，我们测定了细胞内L-阿拉伯糖和D-木糖还原酶以及L-阿拉伯糖醇和D-木糖醇脱氢酶的活性并且监测其转录。
5.从黑曲霉克隆pntR同源物。来自构巢曲霉的pntR基因的结构部分和来自烟曲霉数据库的等同序列进行序列对比后设计引物，使用引物对黑曲霉402基因组DNA进行PCR扩增来克隆pntR同源序列。使用下列引物PntR1.7 T104 5′GTGACTCTTGTCATGCTCGCCGCGTTCGATGCGAC3′和PntR1.7B65935′AGAGCCAACCCGGTTCCCTTCCTTGTCCAC 3′。
PCR条件与如上所述的相同，但退火温度为54℃，且扩增时间为2分钟。按照供应商(Invitrogen)的说明将获得的PCR产物克隆入pCR 4 TOPO载体。将用于转化的感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)在含有100mg/ml氨苄西林的LB平板上铺板以便选择合适的构建体。将最终的质粒pPntR-AN14用作模板以便对基因组插入片段进行测序。从反向和正向引物以及基因特异性引物PntR 1201 5′TGGAGTCGAGCTTGCCTCGAAAGC 3′；和PntR B1500 5′CAGGAAGAAGCCGAAGATAGAG 3′建立2.3kb的推定的黑曲霉pntR基因的部分序列。
SEQ ID NO3显示了序列。注意缺乏编码N-末端DNA结合结构域和COOH-末端的部分。与构巢曲霉相反，位置1063-1115bp的一个推定内含子打断来自黑曲霉的pntR同源物的ORF，内含子的位置根据在其5′和3′边界上发现的保守序列的性质预测。尽管序列对比显示在两种基因之间69％的同一性，但是在交叉杂交时它们在DNA印迹上未得到明显的信号(图6)。然而，塔宾曲霉基因组含有与黑曲霉极为相似的pntR相关序列。
图6显示来自构巢曲霉(N)、黑曲霉(402)和塔宾曲霉(1和10)菌株的基因组DNAs的Southern印迹。如所示的用不同的限制酶将5-10μg DNAs消化至完全，在0.7％琼脂糖凝胶上分离，转至尼龙膜(Amersham)并且与构巢曲霉或黑曲霉pntR探针杂交。将来自质粒pSFH1的3kb长Spel-PstI片段用作构巢曲霉探针，而将来自质粒pPntR-AN14的2.3kb EcoRI片段用作黑曲霉探针。两种探针均主要覆盖相应pntR基因的结构部分。在55℃下用2xSSC和0.1％SDS洗涤印迹。
6.从塔宾曲霉克隆pntR基因。从相应的基因组文库克隆来自塔宾曲霉4M-147菌株的pntR同源序列。为了形成这类文库，如上所述分离黑曲霉4M-147基因组DNA，并且用Tsp509I(New England BioLabs)部分消化10μgDNA。使用Gel Extraction Kit(Qiagen)从0.7％琼脂糖凝胶纯化约5-10kb大小的片段。使用2个Weiss单位的T4DNA连接酶(Roche)以5μl总体积将100ng片段连入1μg EcoRI消化的和脱磷酸化的ZAP II载体(Stratagene)中。按照供应商的推荐将2μl连接混合物包装入Gigapack II包装提取物(Stratagene)。使用大肠杆菌XL1-Blue菌株作为宿主在一级文库(primary libray)中获得总计约6.5×105独立个的空斑形成单位。如手册(Stratagene)中所示扩增2.5×105pfu而得到3×108pfu/ml的滴度，其中约6％不含插入片段。
在初级筛选中测试的3-5×104pfu中，有20-25个在与含有黑曲霉pntR基因的pPntR-AN14质粒的P32-标记的2.3kb EcoRI片段进行滤膜杂交时产生阳性信号。将其中的5个纯化成单个噬斑，并且使用Rapid Excision Kit(Stratagene)分离相应的噬菌粒DNA。使用正向和反向引物以及pntR基因特异性引物PntR1.7B1785′AGAGCCATTTGGAACTGGGCCAGACCCTGC 3′建立插入片段的序列。
最终，使用下列寡核苷酸对携带具有最长的5′和3′侧翼区的完整塔宾曲霉pntR基因的克隆之一，pPntR-AT12，进行部分测序PntR At T15′GGCTAAGGACCGGTTCTTTCGC 3′；PntR At B15′GCCGATGGCCTGCGGATGCG 3′；寡核苷酸PntR 1201和PntR B1500的序列如前述部分中所示。
总之，测定了3914bp的序列，其包括以上游485bp和下游878bp为侧翼的pntR基因的完整结构部分(参见SEQ ID NO5)。与黑曲霉相似，塔宾曲霉pntR基因的编码区被一个内含子打断，启动子的相对位置在基因内是保守的。为了检查塔宾曲霉中的pntR缺失是否对木聚糖酶生产具有与在构巢曲霉中相似的有益作用，破化相应的基因。
7.塔宾曲霉1M-7菌株中pntR基因的破坏。与pntR部分缺失的构巢曲霉相反，通过插入大肠杆菌的hph基因从而赋予真菌细胞潮霉素B抗性打断塔宾曲霉中pntR基因的内源性拷贝。通过将缺乏N-和C-末端的塔宾曲霉pntR编码区的部分克隆入质粒pAN7-1制备破坏构建体。该载体中携带在gpdA启动子控制下的潮霉素B抗性基因(Punt和van den Hondel，1992)。在这种情况中，pntR片段内的同源重组将导致pntR的两个破坏的拷贝。一个在3′末端截短，另一个在5′末端截短。
由于这一目的，借助于下列引物通过PCR扩增631bp-2803bp的pntR片段PntR T631 5′ATCGAGCCTTTCCCAGATCTCGCTGCCTTCGCAG 3′和PntR BSal 5′CGCTTGTCGACGCAGCCGCTCTACAATCAGCAAGAGAAG3′。
在退火温度56℃、延伸时间2分钟下，使用20ng质粒pPntR-AT12作为模板进行PCR反应。用限制酶SalI和BglII(各10个单位)消化纯化的PCR产物(0.5μg)，限制酶SalI和BglII的限制位点在扩增过程中被引入两个末端。然后将所述的PCR产物克隆入用XhoI和BglII切割的pAN7-1载体。这些消化消除了部分gpdA启动子，然而该启动子仍然保持了功能。将0.2μg洗脱的载体和0.3μg的插入片段在含有10μl 2x连接缓冲液(Roche)的20μl总体积中与3个Weiss单位的T4 DNA连接酶连接。将连接反应转化入在含有100μg/ml氨苄西林的LB平板上铺板的大肠杆菌TOP10感受态细胞(Invitrogen)。破坏构建体pAN7-ΔPntR的图示在下文中提供(图7)。
图7显示质粒pAN7-ΔPntR的图谱。
该质粒用于转化塔宾曲霉1M-7菌株。转化条件如下所示与用于构巢曲霉的那些条件相似，只是稍有改变。使1M-7菌株在CM上生长过夜，并且在用50mg/ml Glucanex(Laffort)处理菌丝体后，用5-10μg质粒pAN7-ΔPntR转化收集的原生质体。在含有1M蔗糖和100μg/ml潮霉素B的MM上选择转化体。总计获得了300-400个抗性菌落。并且如通过在1％L-阿拉伯糖的平板生长试验所判定的，在分析的70个转化体中，有25个呈阳性(图8)。未生长的转化体(测试15个)在含有0.1％果糖与10mM L-阿拉伯糖和10μg/ml 4-甲基-伞形酮酰-β-D-木糖苷的MM平板上表现出强荧光，表明β-木糖苷酶的上调。通过Southern印迹分析几个转化体的塔宾曲霉1M-7基因组中天然pntR基因座的破坏。杂交的典型模式如图8中所示。使用50单位的NcoI将来自受体和转化体Δ2和Δ20的5μg DNAs切割完全，并且用pntR基因的631bp-2803bp的P32-标记的PCR片段探测，正如预计的，与来自受体样品的单一条带相反，在Southern印迹上观察到因塔宾曲霉pntR基因座上pAN7-ΔPntR质粒整合产生的两个条带。
图8表示用质粒pAN7-ΔPntR转化的塔宾曲霉1M-7在含有1％L-阿拉伯糖的CM和MM上的生长试验结果(左侧)，和缺失体Δ20和1M-7菌株的Southern印迹(右侧)。用NcoI消化DNA，并且如所示的用pntR片段探测。显示了破坏质粒pAN7-ΔPntR的同源整合方案。
8.塔宾曲霉ΔpntR缺失体菌株中木聚糖酶和β-葡聚糖酶生产的改善。为了检查pntR破坏对蛋白质生产的作用，在不同生长条件下培养塔宾曲霉，并且测定培养液中许多细胞外蛋白质的酶促活性。在第一组实验中，将塔宾曲霉菌株在含有1％果糖和0.1％酵母提取物的含有或不含有10mML-阿拉伯糖的MM上培养40小时。相似地，使它们在1％木糖和0.1％酵母提取物上生长。将纯粹含有果糖的培养基视为中性的未诱导的条件，而L-阿拉伯糖或D-木糖诱导细胞外活性。在生长过程中蓄积的生物量对所有菌株而言近似相等。如对构巢曲霉那样测定活性，不同之处在于在0.2M磷酸Na-0.1M柠檬酸缓冲液，pH 3.5中检测木聚糖酶。
正如图9中所示，木聚糖酶和β-葡聚糖酶活性在含有L-阿拉伯糖的培养基上增加。实际上，木聚糖酶活性的绝对值高于木糖诱导条件5倍。同时，α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性下降了将近3倍。总之，这些结果表明塔宾曲霉和构巢曲霉中敲除pntR基因在L-阿拉伯糖诱导条件下产生了完全相同的表型和木聚糖酶和其它XlnR调节的基因，如β-木糖苷酶和β-葡聚糖酶表达水平的改善。此外，L-阿拉伯聚糖降解复合物的活性不明显，这有益于工业化应用中使用的木聚糖酶制品。
图9表示塔宾曲霉1M-7受体和pntR缺失体D5和D20菌株在1％果糖+0.1％YE、1％果糖+0.1％YE+10mM L-阿拉伯糖和1％木糖+0.1％YE上生长后，木聚糖酶(Xln)、β-葡聚糖酶(Egl)和α-阿拉伯呋喃糖苷酶(Abf)的活性。将20μl培养物样品用于木聚糖酶和β-葡聚糖酶测定，而100μl用于α-阿拉伯呋喃糖苷酶测定。对木聚糖酶和β-葡聚糖酶而言，使反应进行10分钟，并且对α-阿拉伯呋喃糖苷酶而言，使反应进行60分钟。以O.D.表示活性。
在另一实验中，在含有3％甜菜浆、3％麸皮和0.17％(NH4)2SO4，pH 3.5的工业化使用的复合培养基上将塔宾曲霉菌株发酵4-6天。在发酵后，测定培养液样品中的活性(图10)。木聚糖酶和β-葡聚糖酶活性再次增加了2-3倍，而α-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶稍微下降。这些条件与在低廉培养基上从木聚糖酶或任何其它强XlnR-调节的启动子工业化生产木聚糖酶或异源蛋白质相关。
图10显示塔宾曲霉1M-7受体和pntR缺失体菌株D2、D3、D5、D10、D12、D20、D22在含有甜菜浆的复合培养基上生长后，木聚糖酶(Xln)、β-葡聚糖酶(Egl)、α-阿拉伯呋喃糖苷酶(Abf)和β-半乳糖苷酶(Bgal)的活性。将0.5μl培养物样品用于木聚糖酶和β-葡聚糖酶测定，而将25μl用于α-阿拉伯呋喃糖苷酶和β-半乳糖苷酶。对所有酶促测定而言，使反应进行10分钟。以O.D.表示活性。
9.编码PntR转录因子的基因缺失对代谢和XlnR调节的基因表达的作用图11显示丝状真菌中阿拉伯木聚糖的途径示意图，和编码PntR转录因子的基因缺失对代谢和XlnR调节的基因表达的作用。
AcE表示水解阿拉伯木聚糖上的各种侧链基团所必需的所有辅助酶。XDC和ADC表示由丝状真菌产生的细胞外酶的木聚糖和L-阿拉伯聚糖降解复合物。其中特别指定木聚糖酶(xlnA、xlnB和xlnC)和L-阿拉伯呋喃糖苷酶(abfA和abfB)。XlnD编码β-D-木糖苷酶且Mst表示单糖转运蛋白。木糖还原步骤可能由一种已知的还原酶XyrA以外的其它酶施加。可能包括第二种推定的木糖诱导的还原酶XyrB，或尚未知的阿拉伯糖还原酶(ArrA)。至少在瑞氏木霉(T.reesei)中，可以用木糖醇脱氢酶(XdhA)和L-阿拉伯糖醇脱氢酶(LadA)转化木糖醇。然而，L-阿拉伯糖醇仅由LadA氧化。
PntR的破坏(用交叉十字表示)导致包括ladA在内的其靶基因基础水平的转录，导致LadA酶促活性下降(用向下的箭头表示)，由此停止下游代谢流程。这导致细胞内L-阿拉伯糖醇库增加，细胞内L-阿拉伯糖醇直接或间接活化XlnR，而XlnR介导xlnA和其它基因的转录。
10.pntR基因的一级结构的分析及其来自不同曲霉属的推定的氨基酸序列对迄今为止可得到的真菌数据库的分析显示，发现pntR主要存在于曲霉属物种中。对4种曲霉属物种的pntR编码区的核苷酸比较显示58％的同一性。除构巢曲霉外，来自其它物种的pntR含有一个内含子。在蛋白质水平上，同源性甚至更高(70％)(参见图12)。序列对比显示来自构巢曲霉和烟曲霉的蛋白质比黑曲霉和塔宾曲霉彼此在进化上更接近。DNA结合结构域且尤其是在C-末端部分内的同源性接近100％。DNA结合结构域决定了这种转录因子的特异性。基于与XlnR的DNA结合基序的比较，可以预计PntR识别其它DNA靶标。保守C-末端区的功能是未知的，但该部分与XlnR最为相似。可以推测它涉及类似的功能，例如，与诱导物的相互作用或响应诱导物存在的分子内相互作用，因为证实这两种因子都被L-阿拉伯糖醇活化。对Zn2Cys6蛋白质家族真菌调节子而言典型的另一保守区域定位(map)至492-503位氨基酸，该区域包括一段序列EEHREERRRTWW。使用VectorNTI 9程序包进行所有DNA和蛋白质分析和比较。
11.分泌的b-半乳糖苷酶LacA在塔宾曲霉xlnA启动子下控制下在构巢曲霉中的异源表达。
为了测定pntR缺失是否异源蛋白质的提高表达提供适当的背景，我们使用编码分泌的b-半乳糖苷酶的黑曲霉lacA基因作为报道标记。由于这一目的，构建表达载体，其中lacA表达受塔宾曲霉1M-7xlnA启动子和终止子区域控制。为了有效分泌，使xlnA信号序列与lacA编码区进行框内融合。即使用相应引物LacA T1315′CTAGTCTAGAGCCCTGTTGCAGAAATACGTCACTTGGGATG3′；LacA B3031 5′TCCGCTCGAGCTAGTATGCACCCTTCCGCTTCTTGTACTT3′，通过PCR从黑曲霉402基因组DNA扩增3kb lacA基因。
PCR扩增程序与实施例2中所述相同。纯化的PCR产物在扩增过程中在两个末端上引入的XbaI和XhoI限制位点上切割，这两个位点是在扩增过程中在两个末端上引入的，并且使用标准操作步骤克隆入pExpressS1表达载体的相应位点。该载体含有1.1kb启动子区域、编码信号肽的序列、和由多接头分隔的塔宾曲霉1M-7xlnA基因的0.78kb终止子区域。最终表达质粒pExSlac2的示意图如图13中所示。
将10-15mkg pExSlac2与0.5-2mkg携带构巢曲霉argB基因的pILJ16(Johnstone等，1985)共转染入对照构巢曲霉菌株pyrG89 argB2 pPyrG)和缺失体ΔpntR1菌株(pyrG89 argB2pntRΔ::pyrG)。如实施例3中所述进行转化，但针对精氨酸原养型在MM平板上选择转化体。在含有20mM D-木糖和0.005％Xgal的MM平板上筛选随机挑取的转化体的b-半乳糖苷酶活性。形成强烈颜色的那些转化体在液体培养物中进一步测试。整合了pExSlac2弹夹的构巢曲霉转化体生长在含有1％果糖与10mM L-阿拉伯糖和0.2％酵母提取物或1％木糖和0.2％酵母提取物的MM上72小时。在生长过程中蓄积的生物量对所有菌株而言近似相等。使用邻-硝基苯基-β-D-半乳糖苷作为底物，如实施例4中所述测定培养基中b-半乳糖苷酶活性。
正如图14中所观察到的，在两种生长条件下，b-半乳糖苷酶的内源性水平在对照构巢曲霉菌株中保持忽略不计。正如预计的，在对照菌株中，lacA仅由D-木糖诱导，而pntR缺失则除此之外还产生由L-阿拉伯糖引起的显著诱导。不同表达载体拷贝数或其整合位点可以解释转化体之间活性水平的变异。本实施例表明pntR敲除显著(3-5倍)改善了异源宿主构巢曲霉中由异源塔宾曲霉1M-7xlnA启动子驱动的黑曲霉b-半乳糖苷酶的L-阿拉伯糖特异性表达。
图14描绘了构巢曲霉对照(CLac1、CLac2)和携带pExSlac2表达质粒的pntRΔ1缺失体(DpntRLac1、DpntRLac2、DpntRLac3)菌株在培养基中测定的细胞外b-半乳糖苷酶活性。将非转化的菌株(C)用作内源性活性的对照。使所有菌株在1％果糖+0.2％YE+10mM L-阿拉伯糖和1％木糖+0.2％YE上生长3天。将50ul培养物样品用于酶促测定。在30℃下使反应进行10分钟。以O.D.表示活性。
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将上述说明书中提及的所有公开文献和所述公开文献中引述的参考文献引入本文作为参考。本领域技术人员显然可以在不脱离本发明范围和实质的情况下对本发明所述的方法和系统进行各种修改和变型。尽管结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应理解所请求保护的本发明不应过度限于这类具体的实施方案。实际上，分子生物学或相关领域技术人员显然可以对用于实施本发明的所述方式进行各种变型，指定它们属于下列权利要求的范围。
权利要求
1.编码PntR转录因子的分离的核酸序列，所述核酸序列包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO1、3或5中的任一序列相同、互补、或包含取代SEQ ID NO1，3或5中的任何密码子的任何合适的密码子取代，或包含与SEQ ID NO1、3或5中的任一序列具有至少60％序列同源性的序列。
2.权利要求1的分离的核酸序列，其编码PntR转录因子多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO2，4或6中的任一序列所示的氨基酸序列，或与其具有至少75％同一性的序列，或其有效片段。
3.权利要求2的分离的核酸序列，所述序列获自曲霉属、木霉属或青霉属细胞。
4.权利要求3的分离的核酸序列，所述序列获自曲霉属细胞。
5.包含权利要求1-4中任一项的核酸序列的质粒或表达载体系统。
6.用权利要求5的质粒或表达载体系统转化或转染的宿主细胞。
7.一种多肽，其包含对应于曲霉属PntR的氨基酸序列或其功能等效物。
8.权利要求7的多肽，其具有与曲霉属PntR的序列相同的氨基酸序列或与曲霉属PntR的序列至少75％相同的序列。
9.权利要求7或8的多肽，包含如SEQ ID NO2、4或6中任一序列所示的氨基酸序列或与其具有至少75％同一性的序列或其有效片段。
10.被排列来敲减转录因子PntR的表达或功能的核酸构建体。
11.权利要求10的核酸构建体，其包含编码功能上受到破坏的PntR的核酸序列。
12.权利要求11的核酸构建体，其包含编码PntR并且缺乏编码Zn2Cy6区域的核酸序列。
13.权利要求10的核酸构建体，其包含权利要求1-4中任一项的核酸序列的全部或片段。
14.包含权利要求10-13中任一项的核酸构建体的质粒或载体系统。
15.破坏细胞中PntR表达的方法，包含将权利要求10-13中任一项所述的核酸构建体或权利要求14中所述的质粒或载体系统导入所述细胞。
16.用核酸构建体转化或转染的宿主细胞，所述核酸构建体被排列来敲减权利要求10-13中任一项所述的转录因子PntR、或权利要求14所述的质粒或载体系统的表达或功能。
17.权利要求16的宿主细胞，其进一步包含核酸构建体，所述核酸构建体包含目标蛋白质(POI)的编码序列，所述编码序列在由XlnR调节的启动子的转录控制下。
18.权利要求16或权利要求17的宿主细胞，其中该宿主细胞选自曲霉属、木霉属和青霉属组成的组。
19.能够产生细胞外木聚糖酶的权利要求16-18中任一项的宿主细胞。
20.权利要求16-19中任一项的宿主细胞，其中所述细胞为蛋白酶缺陷的。
21.权利要求16-20中任一项的宿主细胞，其中所述细胞具有L-阿拉伯糖代谢阻滞。
22.权利要求16-21中任一项的宿主细胞，其中所述细胞表现出木聚糖酶活性增加。
23.权利要求16-22中任一项的宿主细胞，其中所述细胞对于POI的生产是有用的。
24.在宿主细胞中表达POI的方法，所述POI的编码序列处于由XlnR调节的启动子的转录控制下，所述方法包含调控所述宿主细胞中的转录因子PntR。
25.权利要求24的方法，包含下列步骤提供PntR缺陷的宿主细胞，所述宿主细胞包含在XlnR转录控制下的编码POI的基因，并且在合适的条件下培养所述宿主细胞。
26.权利要求24-25中任一项的方法，其中PntR具有如SEQ ID NO1、3或5中任一所给出的核酸序列或与之具有大于60％同一性的序列。
27.权利要求24和26中任一项的方法，包含使用权利要求16-23中任一项的宿主细胞。
28.权利要求24-27中任一项的方法，其中POI为同源蛋白质。
29.权利要求24-27中任一项的方法，其中POI为异源蛋白质。
30.权利要求24-29中任一项的方法，其中宿主细胞为丝状真菌细胞，并且优选曲霉属、木霉属或青霉属的菌种。
31.权利要求24-30中任一项的方法，其中所述表达POI的方法为生产所述POI的方法的组成部分，并且进一步包含分离/纯化所述的POI。
32.生产POI的方法，包含在宿主细胞中表达POI，所述POI的编码序列处于由XlnR调节的启动子的转录控制下，所述方法包含在所述宿主细胞中调控转录因子PntR。
33.转录因子PntR的调控在制备宿主细胞以增加目标蛋白质(POI)的表达中的用途，所述POI的编码序列处于由XlnR调节的启动子的转录控制下。
全文摘要
本发明涉及编码PntR转录因子的分离的核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO1、3或5相同、互补、或包含对SEQ ID NO1，3或5的任何密码子的任何合适密码子取代的核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO1，3或5中的任何一个具有至少60％序列同源性的序列，以及相应的多肽、载体系统和包含它们的宿主细胞。特别地，本发明涉及获自曲霉属、木霉属或青霉属细胞的序列。本发明进一步涉及破坏细胞中PntR表达的方法和在宿主细胞中表达或生产POI的方法，在所述宿主细胞中PntR表达已经受到破坏。
文档编号C12N15/63GK101056889SQ200580038425
公开日2007年10月17日 申请日期2005年11月10日 优先权日2004年11月11日
发明者艾戈·尼古莱夫, 苏珊·M·马德里德 申请人:丹尼斯科公司