专利名称：一个锌指蛋白家族的人类新基因znf329的制作方法
技术领域：
本发明涉及锌指蛋白家族的人类新基因ZNF329及其克隆、在成人各组织和人体胚胎发育的不同阶段的表达，以及该基因在不同物种间同源基因的同源程度，以探索利用该基因进行人类疾病的诊断及治疗。
背景技术：
锌指蛋白家族一般具有该家族的特征性结构----锌指蛋白结构域，是最先在果蝇中被确立的、为中枢神经系统和肌肉等组织分化所必需的调控因子(POSTIGO AA，SHEPPARD A M，MUCENSKI M L，et al.EuropeanMolecular Biology Organization of Journal，1997，16(13)3924-3834)。已知zfh-1基因在早期果蝇胚胎的中胚层以及晚期胚胎的多种中胚层衍生结构中表达，其中包括背侧内脏、性腺支持细胞和成肌细胞等；此外还主要在发育时的中枢神经系统运动神经元中表达。研究表明，Zfh-1蛋白是果蝇中调节肌细胞和性腺细胞分化的转录抑制因子；zfh-1基因参与调节果蝇的尾部中胚层(CVM)的早期分化；参与调节表达eve基因的心脏前体细胞(EPC)的形成；还与tinman基因一同调节包括性腺中胚层在内的外侧中胚层的进一步分化(LAI Z C，FORTONI M E，RUBIN C M et al，Mechanism of Development，1991，34(1-2)123-124；POSTIGO AA，DEAN D C.Proceeding NationalAcademic Science USA.2000，1997(12)6391-6396；KUSCH T，REUTER R.Development，1999，126(18)3991-4003；SU M T，FUJIOKA M，GOTO T，etal，Development，1999，126(14)3241-3251).
zfh-1在脊椎动物中的同源基因也有相似的功能。如ZEB基因的表达产物ZEB-1和ZEB-2蛋白，在包括肌肉、中枢神经系统、T淋巴细胞等组织中均有表达，而最近发现ZEB蛋白包含两个独立的区域，分别调节哺乳动物肌细胞和淋巴细胞的分化(POSTIGO AA，DEAN D CDevelopment，1999，19(12)7961-7971)。
小鼠的zfp-35基因则是精子发生中粗线期精母细胞发育的上游调节基因(CUNLIFFE V，KOOPMAN P，MCLAREN A et al，European MolecularBiology Organization of Joural，1990，9(1)197-205)。而人类锌指基因ZNF家族已被发现参与调节某些肿瘤的形成(OGURI T，KATOHO，TAKAHASHI T et al，Gene，1998，222(1)61-67.)。
发明内容
本发明旨在提供一个锌指蛋白家族的人类新基因ZNF329全部cDNA序列，并分析它在人体各组织和胚胎不同发育阶段的表达，在染色体上的定位，以及不同物种间同源基因的同源度分析。
本发明利用果蝇zfh-1基因的cDNA序列在基因组序列数据库中检索，得到了该cDNA的各种人类同源序列所编码的氨基酸序列，在其中发现了一个新的蛋白质，由此得到了ZNF329的部分cDNA序列，以该序列为基础，利用RACE试剂盒和数据库检索，获得5’端和3’端序列，从而获得全长cDNA序列。
本发明根据该序列设计引物，以正常人胎盘组织cDNA为模板，通过PCR扩增获得该基因的开放阅读框序列，并将开放阅读框克隆到TOPO TA载体上并测序，测序结果与计算机检索结果完全吻合。以开放阅读框的酶切片段为探针，与正常成人组织的总RNA膜进行Nothern杂交，结果表明ZNF329mRNA全长2.9kb，且在大脑组织有较强表达。在开放阅读框5’端设计引物，利用TakaRa公司的5’端RACE试剂盒，以大脑组织的mRNA为模板，做5’端RACE，获得该基因的5’端序列。以胎盘组织cDNA为模板，利用获得的5’端序列设计5’引物，利用数据库检索得到的3’端同源EST序列设计3’端引物，PCR扩增得到ZNF329全长cDNA，克隆到TOPO TA cloning载体(由Invitroten公司提供)上并测序(图1)。该基因cDNA全长2918bp，其中5’端非翻译区为260bp，编码区为542bp，编码542个氨基酸组成的蛋白质，3’端非翻译区为1092bp(图2)，其近5’端有一个起始密码子ATG，近3’端有一个终止密码子TGA以及末端的加尾信号ATAAA。
该基因位于第19染色体的BAC CTD2623H2上，共有5个外显子，跨越基因组24.6kb。用遗传学标记进行精确定位，发现该BAC定位于19q13.4区域。根据数据库最新资料，这一区域是缺失畸变易发区。目前已有结果表明，有一个与甲状腺癌相关的抑癌基因位于该区域。同时，这一区域还是锌指蛋白基因富集区，至少有6个以上的锌指蛋白基因位于该区域。
以ZNF329cDNA作探针，与成人免疫组织的mRNA膜杂交，发现该基因在肝脏、胸腺、淋巴结和脾脏中均有表达，而且在肝脏中的表达最强。说明该基因在免疫功能方面可能起着重要的作用。
另外，以开放阅读框的酶切片段为探针，同时与人体胚胎5个不同发育时期的总RNA模杂交，结果表明该基因在胚胎发育的不同阶段存在表达差异，从18周胚胎到26周胚胎，在大脑中都有较强的表达，在肝脏中只有第26周没有表达信号。在肠的表达是从25周开始的，26周也有表达，但是在此之前的18周、19周和2l周的胚胎中都没有表达。ZNF329在18周胚胎的肾中表达，但是在19周和2l周无表达，在25周有较弱表达，在6周又有较强表达(图3)。这些结果表明，ZNF329的表达存在空间和时间差异性，在人体发育的早期阶段的不同组织起着不同的作用。
用该基因编码的蛋白质检索蛋白质数据库，得到了该基因在不同物种中的同源基因。ZNF329与小鼠RIKEN基因具有最高的同源度，547个氨基酸中有75％的同源，与小鼠另一个基因也有较高的同源度，483个氨基酸中77％同源。与狗bc3基因的同源度为52％(477个氨基酸)，人类的锌指蛋白家族的其他几个基因ZNF1111，ZNF180，ZNF，以及蛋白flj12586与ZNF329的同源度分别为55％(418)，47％(554)，100％(374)，57％(382)(图5)。ZNF329具有锌指蛋白家族基因特征的结构域Cys2/His2结构(Tommerup N，VissingH，Genomics 1995 May 20；27(2)259-264.。研究表明，具有Cys2/His2结构的基因往往是转录调控因子，表明ZNF329也可能是一种转录因子。
本发明的优点1、提供了全新的ZNF329基因的全长cDNA序列，它的编码产物属于锌指蛋白。
2、ZNF329基因的蛋白序列具有锌指蛋白家族的特征Cys2/His2结构域，这种结构域是DNA的结合位点，具有该结构的基因往往参与转录调节，表明ZNF329的编码蛋白能够作为转录因子，在细胞的增殖和分化中起作用，有可能成为基因工程的产品。
3、ZNF329在正常人组织中广泛表达，显示该基因在细胞内具有重要的作用，也可以为疾病的诊断提供指标。
4、NF329在人体胚胎不同发育阶段有不同的表达，表明该基因参与人体的早期发育，为疾病的早期基因治疗提供了可能。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
图1.ZNF329的cDNA序列图2.ZNF329的编码蛋白图3.在人体胚胎不同发育阶段的Northern杂交图3a 18周胚胎1肝2肠 3肾上腺 4心脏 5肺 6舌 7大脑8小脑9肾10肌肉11胃 12脾有阳性信号的组织1肝 5肺 7大脑 8小脑 9肾图3b 19周胚胎1肝 2肠 3心脏 4肺 5肾 6肌肉 7胃有阳性信号的组织 1肝 7大脑 8小脑图3c 21周胚胎1肝 2肠 3肾上腺 4心脏 5肺 6大脑 7小脑8肾 9肌肉 10胃有阳性信号的组织1肝 3肾上腺 5肺 6大脑 7小脑图3d 25周胚胎1肝 2肠 3心脏 4肺 5肾 6肌肉 7胃有阳性信号的组织1肝 2肠 3心脏 4肺 6肌肉图3e 26周胚胎1肝 2肠 3肾上腺 4心脏 5肺6舌 7大脑8肾9肌肉10胃有阳性信号的组织2肠 3肾上腺 5肺 6舌 7大脑 8肾图4.在人体免疫系统组织的Northern杂交1脾 2淋巴结 3胸腺 4外周血 5骨髓 6胎儿肝图5.ZNF329编码的蛋白在不同物种间的同源性比较实施例1 ZNF329全长cDNA的克隆与测序1、ZNF329开放阅读框的克隆以胎盘组织的cDNA为模板，利用部分cDNA序列设计引物，PCR扩增得到该基因开放阅读框序列，经T载体克隆并测序。
引物序列Z1S5-TGA ATG GAT CCC TCT GCC TTT C-3Z1AS5-ACC ATT ATG TTT CCA TGG GTT GCT C-32、利用TakaRa公司的5’端RACE试剂盒做ZNF329基因的5’端RACE以开放阅读框序列设计RACE引物5’端磷酸化RT primer5-TTG CCT CAA GTG TCC CTC C-3primer A15-TCG ATG GTT GCT GGA CAT T-3primer S15-TTA GGT GAT GGT TGG GAC TG-3primer A25-TGG TTG CTG GAC ATT AGC C-3primer S25-CCA GGA GGG ACA CTT GAG G-3上述引物均由上海生工公司合成。
本实验中取大脑组织mRNA 5ug为模板。具体操作按该公司protocol进行。
3、ZNF329全长cDNA的克隆以胎盘组织的cDNA为模板，利用5’端RACE获得的5’端序列设计5’引物，利用数据库检索得到的3’端同源EST序列设计3’端引物，PCR扩增得到ZNF329全长cDNA，T载体克隆并测序(图1)。该基因cDNA全长2918bp，其中5’端非翻译区为260bp，编码区为542bp，编码542个氨基酸组成的蛋白质，3’端非翻译区为1092bp(图2)，其近5’端有一个起始密码子ATG，近3’端有一个终止密码子TGA以及末端的加尾信号ATAAA。
引物序列5’端引物(Z2S)5-TAA ATG CCT GCG CGT CCG CCC-3
3’端引物(Z2AS)5-CCA GTC CCC AAA GAA AAC C-3实施例2 Northern杂交1组织总RNA的提取(按王雁云等，一种快速的总RNA提取方法，生命科学研究，5(1)88-90(2001)进行)。
2总RNA的电泳及转膜，均按《现代分子生物学实验技术》介绍的方法进行(卢圣栋主编，第二版)。
3Northern杂交将固定有人各种组织的总RNA的尼龙膜，放在杂交袋中，加入变性10ml68℃预热的快速杂交液(Clontech公司)，68℃预杂交的30分钟，加入变性的同位素标记的ZNF329cDNA探针，42℃杂交过夜。2XSSC，0.05％SDS洗膜，42℃洗两次，15分钟/次。0.1XSSC，0.1％SDS 42℃洗两次，15分钟/次。
4.-80℃曝光12小时，洗出X光片即得图3.4。
权利要求
1.一个锌指蛋白家族的人类新基因ZNF329，其特征在于该人类新基因ZNF329的cDNA核苷酸序列与氨基酸序列如下＞znf329的cDNA序列exon1TAA 34 AAT GCC TGC GCG TCC GCC CCG AGG CAA GTC CAC GCC AGG GTA ATG4849AAT AAC CCG GTA CCC GCG GCC GCC CCA GCG TTG GGC GGG GGA AGC9394TCG GGG ACT CCG CGC ACG CGC ACA TCC TTG TCC CGG CAG CCG CGC138exon2139 AAG CGC AAT CGC CCG GAA CAT GGC TGC CGC CGG CCG CCA ACC/ GAT 183184 GGC TGG AGC CGT GTG GAT GGG CAT AAA TGG CTA ATG TCC AGC AAC228229 CAT CGA TGT CAA GTA TCC ACA CAC CTG GCC TGA ATG GAT CCC TCT273exon3274 GCC TTT CAG A/GA GTT TGG GAT ATG AGA TTG AAA ATG ACG ACT CGG 318319 AAT TTT CCT GAG AGA GAA GTA CCC TGT GAT GTA GAA GTG GAA AGA363364 TTC ACA AGG GAA GTT CCC TGC TTG TCC AGT TTA GGT GAT GGT TGG408409 GAC TGT GAG AAC CAG GAG GGA CAC TTG AGG CAA TCA GCT TTA ACT453454 CTG GAG AAA CCA GGG ACT CAG GAA GCA ATT TGT GAA TAT CCT GGT498499 TTT GGG GAG CAT TTG ATT GCA AGC TCA GAC CTT CCA CCG TCT CAG543544 AGA GTT CTG GCA ACA AAT GGT TTC CAT GCA CCT GAC TCA AAT GTT588589 AGT GGT CTG GAT TGT GAC CCC GCC TTA CCC AGC TAT 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全文摘要
本发明涉及锌指蛋白家族基因。本发明的一个锌指蛋白家族的人类新基因ZNF329,它的cDNA全长2918bp,编码542个氨基酸组成的蛋白质;该基因位于第19染色体的BAC2623H
文档编号C07H21/04GK1341717SQ0112868
公开日2002年3月27日 申请日期2001年10月17日 优先权日2001年10月17日
发明者吴秀山, 朱传炳, 戴琦, 袁婺洲, 李永清, 王跃群, 罗开梅, 曾伟奇 申请人:湖南师范大学