猪生殖与呼吸综合征分离株及其使用方法

专利名称：猪生殖与呼吸综合征分离株及其使用方法
技术领域：
本发明是关于新的野生型PRRS病毒分离株及其相应的改良型减毒PRRS病毒，该减毒病毒在疫苗及免疫组合物中的用途，以及检测该病毒分离株病毒血症水平，生长速度，抗体反应，或其组合的方法。更具体的，本发明提供一种预测新的或先前未表征的PRRS分离株的致病性的方法，减毒该分离株的方法，以及该病毒分离株在疫苗与免疫组合物中的用途。
背景技术：
猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种具包膜的单链RNA病毒，是属于披衣病毒科(Arteriviridae)(Cavanaugh，1997年)。该病毒会造成一种普遍性的猪疾病，此症在1987年首先出现于美国(Hill，1990年)并被称为神秘猪病(mystery swine disease)。其临床病征在于造成各年龄层猪的呼吸道疾病，而导致某些较年轻猪的死亡，以及对处于生殖年龄的母猪造成严重的生殖问题。
PRRSV的动态特性使其在疾病中持续地改变，为新的病毒分离株的出现充分提供了的机会(Andreyev等人，1997年；Murtaugh等人，1998年；Meng，2000年)。由于PRRSV不断地演变，加上对猪农造成破坏性难题的能力，使其成为一个重要的主题而得到研究(Mengeling等人，1998年；Pejsak等人，1997年)、开发疫苗以及寻找其它降低传染力的方法。病毒分离株致病性标准的差异，已在猪的肺部损伤及死亡情形中得以证明(Halbur等人，1996年)，但将这些生物学及免疫学上的差异与特定基因变异的相关的尝试则多半失败(Albina等人，1998年；Key等人，2001年；Yuan等人，2001年；Murtaugh等人，2002年；Grebennikova等人，2004年)。Labarque等人(2003年)，Mengeling等人(2003年a)及Nodelijik等人(2001年)的研究中，测试了PRRS疫苗的安全性及效率。这些研究证明，在实验情况下，改良的PRRS活疫苗可降低病毒血症的量和持续性，以及减轻病毒侵袭后造成的热病和肺部损伤。
Opriessing等人(2002年)证明，当病毒分离株在开放读框5(open readingframe 5，简称ORF5)具有高度氨基酸序列相似时，会造成猪有显著不同程度的肺炎(pneumonia)产生。宿主差异也会影响猪对于PRRSV有不同反应(Mengeling等人，2003b)。研究已证明，致病性与PRRSV在猪中的复制速率和分布(Hayne等人，1997年)、巨噬细胞的铜离子清除能力(Thanawongnuwech等人，1998年)、以及宿主动物的贫血程度(Halbur等人，2002年)有关。然而，这些方法并无法提供有效预测新的或先前未表征的PRRS病毒分离株的致病性的方法。
根据前述，本领域需要一种预测PRRS病毒分离株致病性的方法。本领域进一步需要将病毒分离株给予或暴露或至既往无PRRS的猪后，根据猪体内PRRS病毒的生长速率和/或病毒血症水平，来预测病毒分离株的致病性的方法。

发明内容
本发明克服上述问题，并且提供新的野生型PRRS病毒分离株，和该病毒分离株的减毒型，及其对应疫苗，该疫苗是含有减毒型PRRS病毒的药物组合物。具体而言，本发明的野生型病毒分离株名称为SDSU73、17198-6、MN 184，及其混合株。这些病毒分离株的减毒型，及包含减毒型分离株的完整疫苗，都能提供猪体内对抗PRRS的免疫力，而不会产生明显的PRRSV临床病征。
本发明的减毒型PRRS病毒分离株的另一特征为，它们大部分保留了野生型或未减毒病毒分离株产生病毒血症的情况。因此，减毒型病毒产生的病毒血症是野生型未减毒病毒所产生病毒血症的至少50％，优选至少约75％。以这种方式，减毒型病毒能够赋予猪较快速且完全的PRRS免疫力。
附图简述

图1是实施例1中的猪测试的图，其为平均血清病毒效价对时间的变化，所述病毒效价以log10 TCID50/ml表示；图2是实施例1中的猪测试的图，其为利用实时RT-PCR测定的平均血清PRRSV病毒浓度；图3为使用商用ELISA测定法测定的平均S/P比值相对于对时间的图；图4图示实施例1中商用ELISA化验与log10 TCID50/ml数据的重复测量分析，其中用ELISA S/P比值曲线下的组平均值对log10 TCID50/ml下的组平均面积作图；图5图示实施例1中商用ELISA化验与RT-PCR浓度数据的重复测量分析，其中用ELISA S/P比值曲线下的组平均面积对RT-PCR浓度曲线下的组平均面积作图；图6a是实施例1中吸收值对时间作图的图；图6b是用吸收值对时间作图的图，说明PRRSV分离株对nsp-4 IgG反应的影响，其中数据是十只动物的平均数值，但如动物死亡则不列入计算；图7图示了利用实施例1中的nsp-4与log10 TCID50/ml数据的重复测量分析，其中用nsp-4曲线下的组平均面积系对log10 TCID50/ml曲线下的组平均面积作图；图8是利用实施例1的临床评分与log10 TCID50/ml数据的重复测量分析的图，其中用临床评分曲线下的组平均值对log10 TCID50/ml曲线下的组平均面积作图；以及图9是本申请中每个分离株的IHC评分的图。
实施方式野生型病毒可以通过许多方法来进行减毒，例如使病毒在细胞培养中重复连续继代、基因插入、基因转换(gene switching)、基因缺失、碱基对置换与温度敏感突变等。使用在本领域中所熟知的方法，所述减毒型病毒可以用于各种免疫组合物中，包括疫苗。在某些情况下，这些减毒型病毒可以利用本领域中所熟知的方法进一步被杀死或灭活，然后掺入或包含在根据本发明的致免疫组合物中。可用于防止PRRS感染或降低PRRS感染后临床病征的严重程度的致免疫组合物的例子包括利用Abst-1或JA-142所制备而成的疫苗。
也发现本发明的疫苗可以以冷冻状态进行储存备用，而不会减损疫苗的所欲特征。这解决此技术中长久以来的问题，因为先前的PRRS疫苗并不适合冷冻储存。
本发明进一步提供预测新的或未表征的PRRS病毒分离株致病性等级的方法。该方法通常涉及对新的或先前未表征的PRRS病毒分离株进行以下几项参数中至少一项的评估病毒生长速率、病毒血症水平、抗体反应、或其组合。然后利用评估得到的结果，来预测新的或先前未表征的病毒分离株的致病性等级。该方法通常涉及给予或将未受PRRS病毒感染的猪暴露于一定量的新的或先前未表征的PRRS病毒分离株，使病毒复制达约15天的一段时间，优选从约2到12天，更优选从约3到10天，更优选从约3到7天。给予病毒的方式可以用常规方式来实现，包括口服、鼻内、肌肉内、淋巴结内、皮内、腹腔内、皮下、或其组合，但是最佳的方式则是透过鼻内投药。鼻腔投药所使用剂量优选达约5毫升，更优选约在0.5到4毫升之间，更优选约1到3毫升之间，更优选则是约2毫升。每剂的病毒浓度应达约5.0 Log10 TCID50/ml，更优选约在1.0到4.0 Log10 TCID50/ml之间，更优选约在2.5到3.5 Log10 TCID50/ml之间，最优选是约3.0 Log10TCID50/ml。在此病毒复制期间选定的时间点，从猪获取生物样品，测量所给予病毒的生长速率、病毒血症水平、抗体反应、和/或其组合。随后将从这些分析收集的数据与其它已知或已确认的病毒分离株的病毒生长速率、病毒血症水平、抗体反应、或其组合进行比较，作为预测新的或未表征的病毒分离株的致病性的标准。
利用本发明的方法，测量对其施予了八种不同PRRSV分离株中的一种的猪中的PRRS病毒生长、病毒血症水平、抗体反应、和/或其组合。这些病毒分离株中的每一种都有已知的致病性水平与临床病征。也测量对其给予了所有八种分离株的组合的猪中的上述特性。
更具体来说，将100只2到3周大的猪，根据其体重随机分成10组，每组10只。所有猪皆利用HerdChekPRRS ELISA 2XR(IDEXX LaboratoriesInc.，Westbrook，ME)测试PRRS感染。其中对八组给予八种病毒分离株中的一种，一组给予所有八种病毒株的组合，最后一组则给予Eagle’s极限必需培养基(EMEM)当作对照组。对每种病毒接种进行取样重新进行定量，以确定病毒效价。优选，设计给予的病毒效价使其与病毒的自然暴露水平相似。在整个实验进行的不同阶段，收集血液形式的生物样品。通过病毒分离，定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，HerdChekPRRS ELISA 2XR，以及PRRSV蛋白特异性ELISA分析每个样品。
病毒分离是通过连续稀释血清并将其与EMEM、遗传霉素(gentamicin)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)及两性霉B(Fungizone)(Invitrogen Corp.，Grand Island，NY)混合在CL2621(一种MA 104细胞株)细胞上进行的。随后保温稀释液，检验其致细胞病变效应(cytopathiceffect)(CPE)。利用Reed-Muench法计算病毒效价。
RT-PCR是利用QIAamp Viral RNA Mini-Kit(购自Qiagen，Inc.，Valencia，CA)进行的，而PRRSV则是利用Tetracore公司(Gaithersburg，MD)的单管分析(single-tube assay)来检测的。为了确定病毒量，首先建立标准曲线，通过将对已知浓度的3’UTR转录产物作图的循环阈值进行线性外推求得未知样品的浓度。
使用ELISA S/P比值的抗体检测是利用HerdChekPRRS ELISA 2XR根据制造商说明书而产生的。PRRSV蛋白特异性ELISA是利用在BL21(DE3)-RP细胞(购自Stratagene，La Jolla，CA)的重组病毒分离株VR2332表达的核衣壳蛋白(N)以及非结构性蛋白4(nsp4)来进行的。
在研究的开始与终点对所有猪进行体重测量。此外，在研究过程中的每一天，由兽医对每只猪的PRRS病的临床病征进行评估与评分。所有所得到的数据经统计分析，并基于群组进行比较。
十组中的九组随后再次用高致病性病毒分离株攻击，来进一步评估同源保护作用以及疫苗相对野生型异源保护作用(活病毒暴露的概念)。经过此次攻击，评估猪并验尸以使用病毒分离与免疫组织化学法而进行分析。
因此，本发明也提供包含减毒型PRRS病毒分离株的致免疫组合物。在优选的形式中，该组合物也可包括药学上相容的载体和/或佐剂。该组合物其中一个例子包括Abst-1和/或利用上述方法所预测为具致病性PRRS病毒的减毒型。
本发明也提供一种改良的方法，来挑选用来减毒并包含入致免疫组合物的PRRS病毒分离株。该方法通常包括以下步骤a)取得致病性未知的PRRS病毒分离株；b)给予一定量的该PRRS病毒分离株到未感染PRRS的猪；c)使该病毒分离株在猪中复制约3到15天的时间；d)测量该期间内病毒生长速率和/或病毒血症水平；e)将该生长速率或病毒血症水平与致病性已知的PRRS病毒分离株的生长速率和/或病毒血症水平作比较；f)根据与致病性已知的病毒分离株相比较的生长速率和/或病毒血症水平，选择病毒分离株，用以减毒并包含入致免疫组合物。尽管有时会采用预测为致病性较低(包括那些无致病性)的病毒分离株，但是优选挑选预测为具高致病性的病毒分离株用以包含入致免疫组合物。这是因为预测为具高致病性的病毒分离株有较高生长速率和/或病毒血症水平，如此通常造成较旺盛且保护作用较强的免疫反应。利用本发明的方法，简化了挑选用以包含入致免疫组合物的病毒分离株的过程，并且增加了得到有效疫苗来对抗致病型PRRS病毒分离株的可能性。
此处所用“生长速率”意指测量病毒在猪中的复制随时间的变化，实施例1提供优选实例。此处所用“病毒血症水平”意指猪血液的病毒循环浓度，实施例1也提供优选实例。
参考实施方案的简要说明以下实施例说明了根据本发明的优选病毒分离株及步骤。应理解，这些实施例仅为例示性，其不应视为对本发明范畴的限制。
实施例实施例1材料与方法一百头2到3周大的健康猪获自未受PRRS病毒感染的购得的猪群，并在兽医师的管理下，饲养在爱荷华州安姆斯兽医资源公司(VeterinaryResouces Inc.，Ames，Iowa)。猪的饮水与食物任意提供。参与本研究的所有动物照料人员及实验室人员对于各组动物的处理方式均不知情。利用HerdChehPRRS ELISA 2XR(IDEXX Laboratories Inc.，Westbrook，ME)对猪进行检测，确定猪是否受到PRRSV感染。本实施例中所有的猪经测试均呈阴性。然后根据体重将猪随机分成10组，每组有10头猪。
本实施例所用PRRSV分离株总共有八种，这些病毒分离株已被命名为VR-2332、IngelvacPRRS MLV、JA 142、IngelvacPRRS ATP、SDSU 73、Abst-1、MN 184、与17198-6。这八种病毒分离株横跨整个PRRS病的病史，表现出各种不同程度的致病性等级，并呈现相关的临床病征。所有病毒分离株均生长在ATCC细胞系CL2621细胞上(CL2621是来自NVSL，Ames，IA的私有细胞株)(一种MA-104猴肾脏细胞系)。三株原始野生型病毒分离株VR-2332、JA-142与SDSU 73，也具有其对应减毒型，分别称作IngelvacPRRS MLV(Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc.，St.Joseph，MO)、IngelvacPRRS ATP(Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc.，St.Joseph，MO)、以及Abst-1。这些减毒型病毒分离株均显示较低或不可检出的致病性，其通过在活体外传代来减毒而衍生的。PRRSV分离株ATCC VR-2332是1991年在明尼苏达州(Minnesota)分离出来，使用的是第三代细胞传代培养物。此病毒的减毒型可商业购得，商品名称为IngelvacPRRS MLV。PRRSV分离株JA142(ATCC编号为PTA-6504)由爱荷华州安姆斯国家动物疾病中心(NationalAnimal Disease Center)的William Mengeling所提供，是1997年在爱荷华州，从造成繁殖障碍的严重“流产风暴(abortion-storm)”病例中分离，使用第5代细胞传代培养物。JA 142的减毒型可商业购得，其商品名称为IngelvacPRRS ATP，且ATCC编号为VR-2638。PRRSV SDSU 73(ATCC编号为PTA-6322)是1996年在爱荷华州，从严重的繁殖疾病病例中发现，使用第一代细胞传代培养物。SDSU 73的减毒型，称为Abst-1(ATCC编号为PTA-6320)，通过52次传代获得。PRRSV分离株17198-6(ATCC编号为PTA-6321)，是1997年在俄克拉荷马(Oklahoma)从一群患有严重繁殖疾病的猪中获得的，使用第四代细胞传代培养物。PRRSV MN184(ATCC编号为PTA-6319)是在2001年在南明尼苏达从遭遇严重繁殖疾病与母猪死亡的养猪场中取得，由圣保罗明尼苏达大学(University of Minnesota，St.Paul)的KurtRossow所提供，使用病毒分离株的第一代细胞传代培养物。此外，我们也制备了包含所有病毒分离株的组合的混合株。
在第零天，将八种PRRSV分离株中的每一种及PRRSV混合株在含有4％胎牛血清(FBS)(JRH Bioscience，Lenexa，KS)的Eagle’s极限必需培养基(EMEM)(JRH Bioscience，Lenexa，KS)中稀释至大约3.0 log10 TCID50/ml，然后经鼻内投药至猪，剂量为一剂2毫升(每鼻孔1毫升)。给予未处理的对照组2毫升的培养液。在含有3日龄CL2621细胞的96孔板上滴定接种物以利用Reed-Muench法(Reed等，1938)确定效价。所观察到施用至猪的效价，以及致病性水平的描述和分离信息列在表1中。
表1分离株的致病性和接种效价

*代表减毒型RRSV病毒**含有八种病毒分离株的混合物***发表在Symposium on Emerging Diseases(罗马，2003年)中关于肺部损伤的摘要然后通过分析百分比序列同一性比较分离株以确定其基因相似度。序列同一性是将病毒样品委托明尼苏达大学诊断实验室(Diagnostic Laboratory)进行序列分析来确定的。提供ORF 5-6的结果，然后将其与PRRS病毒的共有序列进行比较。个别碱基对的差异被注明，然后比较各病毒分离株的％序列同一性。如本领域技术人员所知的，blast搜寻也能在不同的网站上进行。例如，明尼苏达大学提供一个PRRSV数据库(ccgb.umn.edu/cgi-bin/common/web_blast.cgi)，其中列出从1989到2003年病毒分离株的序列。另一个常被使用的网站是NCBI BLAST，网址为ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。
根据表2显示的百分比序列同一性与系统树图，致病性野生型病毒分离株的基因差异非常明显，且代表多个组的PRRSV分离株。相反地，亲代与疫苗PRRSV对在基因上相同。表2的成对比较(pairwise comparison)与系统树图是用序列分析工具中的Lasergene软件套件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)所产生。
表2，本研究所用的致病型与减毒型PRRSV分离株的ORF5核苷酸序列的成对比较。相似百分比显示在表格右上角，差异百分比显示在表格左下角。系统树图显示病毒分离株的遗传相关度。条带代表每一百残基有一个核苷酸改变。VR2332是Ingelvac PRRS MLV的亲代病毒分离株，JA 142是Ingelvac PRRS ATP的亲代病毒分离株，SDSU 73是Abst-1的亲代病毒分离株。
相似百分比


差异百分比在第49天，将2毫升致病型分离株PRRS MN 184经鼻内投药至第1到9组。MN 184分离株系稀释于MEM+4％FCS中，使其浓度等于log3.0+/-0.5每毫升。经稀释的攻击病毒(challenge virus)于内含用于测试的三日龄CL2621细胞的96孔板内滴定。动物被评估14天，然后进行验尸。
病毒血症的评估在第0、1、3、7、15、21、28、35、42、与49天，利用真空采血管(vacutainer)从各组的每只猪中采集血液样品。以6000RPM离心20分钟从凝集的全血中分离血清。然后将血清样品分装以用于通过病毒分离、TCID50分析、定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、HerdChekPRRS ELISA 2XR、和PRRSV蛋白特异性ELISA进行分析。本研究的血清样品在收集后立即处理，并且在取得后三小时内放置冰上降温。样品储存在4℃最久不超过24小时，之后储存在-70℃。以RT-PCR检测的血清样品在收集当天冻在-70℃，并储存直到样品数目足以在24小时内进行测试，再将样品解冻，提取，以及测试。
对于TCID50分析，将100微升来自每只猪的血清加到含有900微升EMEMm+2％FBS+50微克每毫升遗传霉素(Sigma Chemical Co.St.Louis，MO)+2.5微克每毫升两性霉素B(Invitrogen Corporation，Grand Island，NY)的稀释管中。将稀释管涡旋震荡，取100微升到另一含有900微升EMEMm+2％FBS+50微克每毫升遗传霉素+2.5微克每毫升两性霉素B的稀释管中。重复此步骤直到达到最终的稀释度10-6。将每次稀释的4种重复体铺于内含每孔100微升CL2621(MA 104细胞)的96孔盘中，置于37℃与4％CO2的条件下培养八天。接着检验每个孔的细胞病变效应(CPE)，并利用Reed-Muench计算法测定效价。对于病毒分离，将100微升血清加到含有MA 104细胞的一式两份的测试孔的每一个中。然后将板置于37℃、4％CO2下保温1小时。接下将500微升EMEM+2％FBS+50微克每毫升遗传霉素+2.5微克每毫升两性霉素B加入每个孔。将板置于37℃、4％CO2下保温八天，然后检验CPE。
为了从血清中提取病毒的RNA以用于定量RT-PCR，如试剂盒中的指示所述使用QIAamp Viral RNA Mini-kit(购自Qiagen Inc.，Valencia，CA)。对于实时PCR，商业可购得的实时单管RT-PCR试验(其用于检测美国PRRSV)系由Tetracore公司(Gaithersburg，MD)提供，并被用于检测PRRSVRNA。通过比对GenBank PRRSV分离株并基于3’UTR引物与探针区的保守区域，从3’非翻译区(UTR)PRRSV基因组区域设计小沟结合型(minorgroove binding，MGB)5’核酸酶探针与引物。使用由Tetracore U.S.PRRSVMaster Mix(18.9微升Master mix、2微升Enzyme mix 1、与0.1微升Enzymemix 2)与4微升提取的PRRSV RNA所组成的25微升反应体积，在单个管中转录PRRSV RNA。将反应管置入Smart Cycler IIblock(Cepheid，Sunnyvale，CA)中，将荧光检测的软件工具设定为用于基线的自动计算，并开启背景扣除。温度循环程序由以下组成52℃1800秒，95℃900秒，与以94℃30秒，61℃60秒和72℃60秒进行45个循环。假如循环阈值(Ct)水平在小于或等于45个循环获得，PCR反应被认为是阳性。为定量，使用已知量的连续稀释的体外转录RNA产物(1×10-1到1×108拷贝每微升)来产生标准曲线。未知样品的拷贝/ml浓度通过将对浓度已知的3’UTR转录产物作图的Ct值进行线性外推来测定。
抗体检测ELISA S/P比值通过由根据生产商的说明进行HerdChekPRRS ELISA2XR(INDEXX Laboratories，Westbrook，MA)而产生。用于HerdChek的PRRSV蛋白特异性ELISA利用重组病毒分离株VR2332的核衣壳蛋白(N)以及非结构性蛋白质4(nsp4)来进行，其在BL21(DE3)-RP细胞(购自stratagene)中自质粒pET 24b表达为含有氨基末端myc标签与羧端6x组氨酸标签(6x histidine tag)的融合蛋白。变性蛋白质在0.1M Tris HCl，pH8.0，6M胍-HCl，2mM EDTA中透析，并调整浓度到3毫克每毫升。将DTT加至300mM，以0.45微米膜过滤溶液。经还原的蛋白质被加到重折叠缓冲液(100mM Tris HCl，pH8.0，0.5ML-精胺酸，8mM氧化型谷胱甘肽，2mM EDTA，10μM pepstatin A，10μM leupeptin，1mM PMSF)中，过滤(0.22μm)并搅拌过夜。经纯化的蛋白质通过切向流式过滤(tangential flow filtration)(Pellicon XLUltracel PLC 5kd，Millpore)浓缩，再用20mM Tris HCl(pH8.0)透析。将蛋白质在具有Protein LabChip的Agilent 2100 Bioanalyzer上分析。经纯化的蛋白质溶液储存在-80℃。
蛋白特异性ELISA是通过用在pH9.6碳酸缓冲液中的100ng重组蛋白质或用单独的缓冲液包被微量滴定板来进行。该板用含有0.1％Tween20(PBST)的磷酸盐缓冲盐水中的2.5％脱脂牛奶封闭(block)。将100微升稀释度1∶2000的血清加入一式二份的孔中2小时，然后以PBST清洗盘，抗体的结合通过以下方法检测与1∶5000稀释的辣根过氧化酶偶联的山羊-抗猪IgG(重+轻链(购自KPL，Gaithersburg MD))保温1小时，接着洗涤，并用100微升TMB底物(购自KPL)呈色。反应利用1M磷酸终止，在波长450nm读板值。
体重在第0天(研究第1天)及第49天(研究最后一天)对所有猪进行称重。猪在可携式电子重量-横杠天平系统Weigh-TronixTM模式615XL(Wight-Tronix，Inc.，Fairmont，MN)上秤重。天平在每次使用前后以合格检验砝码进行校正。
临床评分在研究中每一天，每一猪由兽医师对呼吸症状、行为、以及咳嗽进行评分，每一种临床症状的评分为1到4分。正常动物给3分，最严重的临床疾病给予9分，而死亡动物得到12分。研究中死亡的所有猪的样品，被送至爱荷华州立大学兽医诊断实验室进行病理检验。
肺部免疫组织评估在验尸当天，将来自每只猪的肺部样品用福尔马林固定，以用于通过免疫组织化学及显微镜检查符合PRRSV的损伤。此检验由爱荷华州立大学兽医诊断实验室进行。
统计分析所有数据均输入SAS(版本8.02)进行数据管理与分析。对所有适合的目标变量(out come variable)产生统计摘要，包括平均值、标准差、标准误差、中位数、及频率分布。对于体重、RT-PCR、及Log10 TCID50/ml的数据，通过单向ANOVA分析处理群组间的整体差异，并通过最低显著差异t测定法(Least Significant Difference t test)对处理组间的差异进行成对检测。组间差异的所有测试设计为双向检测(two-sided test)。差异在p值小于或等于0.05时被认为是统计上显著的。
数据会进行一些变动以利于相关性分析。Log10 TCID50/ml的数值小于2.00时，会被设定为1.0。RT-PCR数值为阴性时，设定为1.0，而所有RT-PCR数值在分析前通过转换为以10为底的对数(log base 10)进行常态化(normalize)。对照组的结果不包含在相关性分析中。每只猪的结果利用梯形法则(Trapezoidal Rule)转换为曲线下近似面积。计算整个研究周期、从第一次观察到第15天与从第15天到最后一次观察的曲线下面积，但在图中只显示整个研究周期。
结果病毒分离与Log10 TCID50/ml的定量在感染当天的暴露以前，没有动物对PRRSV测试阳性。透过鼻内感染的后第1天，五组中只有13只动物的病毒测试为阳性。然而，在感染后第3天，除了感染17198-6病毒分离株的动物以外，其它感染野生型(field)病毒分离株的所有动物皆呈为病毒阳性，平均Log10 TCID50/ml值为从2.1(SDSU-73)到3.9(MN 184)。相反地，接种减毒型病毒分离株的猪的细胞培养一律呈现阴性。这些结果在图1显示。对于5株致病性病毒分离株中的4株，在第7天达到病毒血症峰值水平，其为从3.6到4.6 Log10 TCID50/ml。17198-6病毒分离株在第15天达到最高。所有致病性病毒组中的效价维持在接近或高于2 Log10 TCID50/ml 21天，但除了JA 142感染组具有低于该水平之外。
在接种了减毒型PRRSV分离株的猪中，病毒血症程度比在接种致病型野生型病毒分离株的猪中低。减毒型病毒分离株的效价的组平均最高值比最低的致病型组效价的最高值低一个log值。除了在接种后第3天外，Abst-1分离株不曾被重新分离。从第7到28天，IngelvacPRRS MLV的病毒血症在0.5到1.0 Log10 TCID50/ml之间变动，而从第7到28天，IngelvacPRRSATP的病毒血症在0.4到1.2 Log10 TCID50/ml之间变动。减毒型病毒分离株的病毒在第28天后，无法从血清中回收，而到第35天，病毒仅可从二个致病型野生型病毒分离株组(分离株混合物-感染的与MN 184感染的猪)回收(结果也表示在图1)。在第42及49天，病毒分离的结果显示，几乎所有猪均无病毒血症发生。
整体来说，观察到致病性越高的病毒分离株比减毒型病毒分离株在猪中复制速度更快，效价更高。具体地，MN 184病毒分离株感染的猪表现出非常迅速增加的病毒复制(其在第三天前开始)，在第7天达到超过4.5 Log10TCID50/ml的峰值。在达到峰值以后，MN 184病毒血症不断下降，但是在第28与35天，比起其它病毒分离株，仍然维持在显著较高的效价(t检验，p值小于或等于0.05)。在所有其它致病型组(VR2332、JA 142、SDSU 73、与分离株混合物)中，均观察到相似的趋势(见图1)。感染17198-6的猪，与MN 184感染组的趋势相同，但是并不很接近。
施予减毒型病毒分离株(IngelvacPRRS MLV，IngelvacPRRS ATP与Abst-1)的猪的组的趋势不同。在第3天后，它们开始显示出适中的病毒当量增加，在第7到15天的间达到最大值，其病毒当量比任何致病型暴露组低一个对数值，并且比MN 184感染组低数个数量级。然后，在这些减毒型暴露组所观察到的效价，在第35天或的前会下降到0(见图1)。
当比较第二次暴露后的群组平均值时，减毒型组的病毒效价有非常急剧的增加，而致病型组只显现较小的增加或甚至完全无增加。举例来说，在第二次暴露后7天，Abst-1的效价为3.76logs，而MN 184的效价为0。其它减毒型组在第二次感染后第3天其效价达到最高。在第二次感染后对任何致病型组观察到的最高效价为1.32logs，所述情况JA 142暴露后3天见到。
通过实时RT-PCR定量病毒病毒血症水平也可利用实时RT-PCR测定，因为在CL2621细胞上的生长对于所有病毒分离株可能不相同，而且因为对于病毒血症RT-PCR可比在细胞上生长更为灵敏。如图2所示，致病型暴露组在第1天显现平均浓度急剧增加，且所有组在第7到15天间的最大值达到超过8logs每毫升。致病型暴露组浓度接着在下几个星期逐渐变低，在第49天浓度低于4logs每毫升。
减毒型病毒分离株暴露组的浓度同样在大约第1天开始显示远较不明显的增加，且其平均组效价从未到达或超过7logs每毫升(图2)。对减毒型暴露组所观察到的浓度，在暴露后数星期维持在显现大范围上下波动的水平。此波动主要是由于偶尔会在单个猪中检测到高值。三种减毒型分离株暴露组都在研究的不同天数达到最大值。IngelvacPRRS MLV感染组在第28天达到最大浓度4.31logs每毫升，IngelvacPRRS ATP感染组在第3天达到最大值6.58logs每毫升，而Abst-1感染组在第35天达到最大值6.85logs每毫升，其是减毒型分离株达到的最高效价(图2)。此外，在第3及15天，观察到致病型分离株组的平均浓度明显高于减毒型分离株组平均浓度(p值小于0.05)，但是在第49天，致病型分离株组的平均浓度明显低于减毒型分离株组的平均浓度(p值小于0.05)。
HerdChekPRRS ELISA 2XR如图3所示，由HerdChekPRRS ELISA 2XR S/P比值所测得对PRRS病毒的体液性免疫反应显示，在第15天时，致病型分离株暴露组的阳性结果平均提高超过0.4截点(cut off)。相反地，减毒型分离株暴露组平均值为阴性且所有三组均维持低于0.4直到第21天之后。IngelvacPRRS MLV与IngelvacPRRS ATP组在第28天显示阳性结果，但是直到第42天，Abst-1病毒感染组未显示超过0.4的平均S/P比值。
在致病型病毒分离株或分离株混合物感染的组与接种了减毒型病毒分离株的组的体液性免疫反应的比较中，很清楚抗体反应的动力学与量级与病毒血症水平有相关性，特别是在感染后第14到35天之间。此观察进一步由HerdChekPRRS ELISA 2XR S/P比值与病毒效价或RT-PCR的成对比较所确定的病毒血症水平与体液性抗体反应间的相关性所支持。图4与图5显示体液性抗体反应在整个研究期间与病毒负荷密切相关，病毒效价的相关系数γ＝0.858，RT-PCR的相关系数γ＝0.794。此相关性是高度显著的(每种情况中p值小于0.0001)，此外，减毒型病毒分离株表现出低抗体反应与低病毒负荷，而致病型病毒分离株显示高反应。
PRRSV蛋白特异性ELISA为了获得对PRRSV接种物与体液性免疫反应的差异间的相关性的进一步了解，测定针对N(主要结构蛋白)与nsp4(重要但次要的非结构蛋白酶)的抗体效价。图6a显示核衣壳蛋白抗NIgG抗体反应的动力学对所有组几乎相同，在第28天达到最大效价，随即在的后7到14天后急速减小，之后在第42到49天间维持不变或轻微增加。
每个分离株的反应程度与HerdChekPRRS ELISA 2XR结果所得相似，并且与病毒血症水平一致。在第28天，最低的峰效价值在接种了减毒型病毒分离株的组中观测到，而最高效价值在感染了高度致病型MN 184病毒分离株的猪中观测到。到第49天，除MN 184与分离株混合物组之外，各组中抗N抗体的效价均相同，显示对MN 184的体液反应可能在性质上不同。此外，到第49天，这两组中每组只有5只猪存活，反映出第49天时，在MN 184组中的标准误差增加。
如图6b所示，对nsp4的IgG反应实质上与对N的不同。在第21天之前并没有检测到抗nsp4抗体，总体反应低得多，而且在接受IngelvacPRRS MLV与Abst-1的组中没有检测到明显反应。此外，抗nsp4反应程度与病毒血症水平没有相关性。对于VR 2332、JA 142、MN 184及分离株混合物的反应均相同，在第28天到达最高值，随后在第35天下降，然后在第42天再度上升，而在此四组中，病毒血症的量级，时程与持续时间皆有不同变化。图7表示当检查重复测定分析(repeated measures analysis)时，nsp4 ELISA的数据与Log10 TCID50/ml数据相比，可发现病毒血症水平与nsp4体液性抗体反应并无相关性。在第49天对MN 184病毒分离株的第二次暴露后，第二次反应也非常低。
体重在实验第0天时，任一组的平均体重并无明显差异(p值为0.099)。在第49天时，接种了减毒分离株Abst-1病毒的猪具有最高平均体重，除对照组外，明显高于其它所有组(表3)。此外，在第49天时，除17198-6组外，所有致病型分离株暴露组的平均体重明显低于对照组(表3)。减毒型分离株暴露组IngelvacPRRS MLV与IngelvacPRRS ATP以及对照组的平均体重在统计上相等(表3)。
表3平均体重病毒分离株第0天 第49天
VR23326.381 33.5bIngelvacPRRS MLV6.5634.6*JA 1426.4232.7bIngelvacPRRS ATP6.2435.0*SDSU-73 6.5932.9bAbst-16.6939.4aMN 1846.7323.7c17198-6 6.3634.5*混合物**6.5123.0c控制组6.4838.4*1体重以公斤为单位。第0天时的平均体重并无显著差异。
*表示第49天时，这几组的体重在统计上相同。
**混合物代表含有所有八分离株的混合物。
a除对照组外，显著高于所有组(p值小于或等于0.05)。
b代表显著低于对照组。
c代表显著低于所有组。
临床评分仅有在致病型暴露组中的四组观察到平均临床评分增加JA 142、SDSU 73、MN 184、与混合物组。在整个研究中，一直维持较高的评分，而剩下的组(包括致病型与减毒型暴露组)在研究期间基本上具有正常临床评分。在本研究中所观察到平均临床评分改变唯一主要的因素是，一或多只动物在相关的处理组中死亡(表4)。
表4感染后猪死亡率组别病毒分离株 死亡率 死亡天数1 VR 2332 0/10 无2 IngelvacPRRS MLV 0/10 无3 JA 142 1/10(10％) 174 IngelvacPRRS ATP 0/10 无5 SDSU-73 2/10(20％) 9，23
6Abst-10/10 无7MN 1845/10(50％)14，14，17，23，41817198-6 0/10 无9混合组**5/10(50％)12，16，17，21，2110 对照组2/10*41，48减毒型PRRSV0/30(0％)致病型PRRSV13/60(22％)在处理组中所有死亡均是由于PRRS病毒与第二次细菌感染所造成的中度或严重非化脓性间质性肺炎(non-suppurative interstitial pneumonia)。
*由细菌性肺炎造成死亡，与PRRS病毒无关。
**混合物是含有所有八分离株的混合物。
临床疾病的严重性与病毒负荷高度相关(病毒效价的p值小于0.001)。如图8所示，MN 184与混合物感染的组的最高临床评分。每组有百分之五十的猪死亡，病毒效价显示，感染水平实质上比所有其它组高。根据RT-PCR所测定的病毒负荷的差异较不明显(数据未显示)，而临床病征与由RT-PCR所测定的病毒负载的相关性比与病毒效价的相关性低(分别为γ＝0.556相对于γ＝0.803)。第10组(控制组)的临床评分在两只猪死于细菌性肺炎后增加。通过肺组织的免疫组织染色、阴性病毒分离与实时RT-PCR分析，显示两只猪皆呈PRRSV阴性，并且HerdChekPRRS ELISA 2XR或蛋白特异性ELISA显示完全没有血清转化(seroconversion)。之后的发现显示，在研究中意外死亡的猪，存在许多细菌性病原，因此可能由于受到第二次细菌感染而导致死亡(表5)。
表5暴露后死亡的原因猪编号 组别 死亡原因 死亡天数993 JA 142PRRS与猪链球菌(Streptococcus suis)17948 阴性对照组化脓性隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes)与败血41性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)983 阴性对照组化脓性隐秘杆菌与败血性巴氏杆菌48922 SDSU 73 PRRS与细菌性肺炎*9
918SDSU 73 PRRS与埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)23973MN 184 PRRS与猪放射杆菌(Actinobacillus suis) 14992MN 184 PRRS与猪放射杆菌 14980MN 184 PRRS与埃希氏大肠杆菌 17971MN 184 PRRS与埃希氏大肠杆菌 23958MN 184 PRRS与埃希氏大肠杆菌 41976混合物 PRRS与猪放射杆菌 12970混合物 PRRS与猪链球菌16972混合物 PRRS与猪链球菌17995混合物 PRRS与猪链球菌21969混合物 PRRS与化脓性隐秘杆菌 21*诊断报告表示无所列特定因子的“细菌性肺炎”。
肺部免疫组织学评估虽然各组的平均IHC评分与所观察到PRRSV损伤之间无明显差异，但当根据致病性来比较IHC评分时，有明显的差异存在。平均IHC评分与PRRSV损伤，如图9与表6所示。
表6根据致病性的平均IHC评分

*＝p≤0.05时显著。
讨论本实施例的一个目的在于检验致病性水平已知的不同PRRSV分离株，来测定是否与其体内复制有关系，其可用于预测PRRSV分离株的致病性，而不需进行受控制的攻击实验。此外，兴趣在于测定病毒分离株的致病性、病毒血症水平、与体液性抗体反应之间的关系。最后，兴趣在于利用本发明的方法，开发对抗被发现具有致病性的PRRSV分离株的疫苗。目标是获得对其它致病性病毒分离株提供某种程度上的保护的疫苗；然而，此种交叉效用可能不是普遍地针对所有PRRSV分离株，且需要再进一步试验。无论如何，明显地本发明提供一种有效的工具，来鉴定疫苗开发的主要候选物。
为了在相同状况下测试PRRSV分离株，所使用的经许可的疫苗(licensed vaccine)的剂量，必须低于美国农业部(USDA)所确定的最小免疫剂量，并且必须不是典型的商用剂量。此外，本研究所使用的MLV疫苗的经鼻内投药途径不是符合USDA标示，而仅是模仿较自然的暴露。经改良的活PRRS疫苗(Ingelvac PRRS MLV与Ingelvac PRRS ATP)的典型商用剂量要比本试验使用的高得多。这些经改良活PRRS疫苗在实验中所使用的低剂量，不代表此领域中所使用的实际产品剂量与型式，并且很容易解释所报告的血清效应。使用疫苗的商用剂量时，利用IDEXX测定可在第14天测得血清学效价。在使用效价约为3logs的本试验中，此血清反应会延迟且较低。这种现象本来是预期的，但进行它以确保在组间效价投与的一致性，并促进致病型与减毒型病毒分离株之间的分析与比较。虽然没有在本实施例中特别指出，但是剂量所造成的影响对于减毒型或致病性较低的病毒比其对于致病性野生型病毒分离株很可能明显得多，所述致病性野生型病毒在猪血清中可以快速生长，在暴露后3到7天内就可以收获超过4logs每毫升的病毒量。较高的推荐的商用肌肉内剂量，在接种后14天(观察本研究所用剂量的时间的二分之一)得到的HerdChekPRRS ELISA 2XR S/P比值高于0.4截点(cutoff)(Roof等人，2003年)。本研究中的例行剂量(每只猪2×103TCID50)，在接受MN 184病毒分离株的组中造成50％致死率，并在所有组别造成抗核衣壳蛋白反应。较高的剂量并未进行测试，因为在用高致病性病毒分离株攻击的组中的过多死亡会妨碍到本研究的目的。此外，先前的研究已经证明，在接种PRRSV分离株VR2332的年轻猪，在剂量为每只动物102.2，103.2与104.2TCID50时，临床病征与病毒血症并无差异。
Log10 TCID50/ml与实时RT-PCR的结果都显示，在PRRSV暴露后组间的病毒血症水平有明显变化。这代表猪中PRRSV生长速率是病毒的一种表型特征，且其与猪对于病毒感染的耐受性的可能差异无关。此外，通过适应在CL2621细胞株中生长来使PRRSV减毒，不仅降低病毒在猪中生长，并且改变病毒复制的动力学，使病毒血症峰值较晚出现。Chang等人(2002年)也有类似的观察，他们证明即使在细胞传代培养一段有限的时间，中度致病型PRRSV分离株VR 2332在猪中的病毒生长也会减慢，并且达到病毒血症峰值的时间明显延迟。然而，延迟病毒血症峰值时间，对于体外细胞传代培养或减毒并无诊断意义，因为高度致病型病毒分离株17198-6也表现出病毒血症峰值时间延迟。
总而言之，当接种同样剂量时，致病型病毒分离株与减毒型病毒分离株相比表现实质上更高的血清病毒血症水平。举例来说，在第15天对于给予IngelvacPRRS ATP的猪，任一减毒型病毒分离株暴露组中所观察到最大的病毒效价为1.22logs，然而，在第15天任何致病性组的最低效价则是SDSU 73组中的2.40logs。在致病型PRRSV分离株中，病毒血症在最大值出现在3到7天，及其所检测到的病毒水平(全部大于3.5logs每毫升)有高度一致性，虽然其中MN 184在程度及持续时间上明显较高，在第28和35天仍存在病毒效价。这支持以下概念高度致病型PRRSV分离株与减毒型或低致病型病毒分离株相比，在体内复制到较高的效价，但在野生型PRRSV中并无法建立致病性水平与体内生长速度之间的直接的量化关系(Haynes等人，1997年)。所述的组显示对MN 184分离株的二次暴露的广范的防护作用。例如，在MN 184及混合株组并没有检出病毒，两者在最初均接受MN184病毒分离株。可见到Abst-1在暴露至MN894后赋予极小的保护。这些观察进一步巩固以下概念同源暴露比异源暴露提供更多的保护作用。同源致病型暴露系较防护性，而异源致病型暴露则较低保护性，但仍比异源减毒型暴露高。
实时RT-PCR结果在统计上与Log10 TCID50/ml结果非常类似，说明两种方法都测量组与组间感染性病毒的相对水平。在第7天所测得数据中，RT-PCR与Log10 TCID50/ml值的皮尔森相关系数(Pearson correlationcoeffcient)为0.89，而平均实时RT-PCR与Log10 TCID50/ml值结果的皮尔森相关系数为0.88。实时RT-PCR所测定的浓度值比Log10 TCID50/ml值高几个量级，原因包括含有目标扩增子(amplicon)的病毒颗粒与完全感染CL2621细胞的病毒颗粒的频率的差异，以及能降低感染力的中和型抗体的存在(Dianzani等人，2002年)。然而，中和型抗体不太可能解释其差异，因为在所有时间点(包括抗PRRSV抗体反应产生的前的时间)都可观察到所述差异。
实时RT-PCR测得的拷贝每毫升值，比在细胞培养中由TCID50/ml所测得的感染效价值还高。这是因为基于病毒基因体拷贝数的标准曲线例行使用在定量RT-PCR中，其直接扩增病毒基因组序列而非已知的感染性病毒颗粒。生物分析例如细胞培养测量感染力的存在，然而其无法计数制备物中存在的所有感染性颗粒。影响感染性效价的因子(例如细胞培养条件与体内抗体(该抗体可以中和病毒)在其它研究中已经被观察到，导致低估在血清中以TCID50/ml所测得的感染性病毒的量。或者，某些非感染性或复制缺陷型病毒可能存在，其可由较高拷贝数反映。
普遍来说，ELISA观察结果支持以下想法体液性免疫反应规模与急性感染期间的病毒复制量相关。图4与图5所示的趋势说明此相关性。利用细胞培养的减毒型病毒分离株引发较慢、较低的体液性免疫反应，而致病型病毒分离株则引发较快、较强的体液性免疫反应。此外，这些观察也证明，至少有两个因子(病毒分离株种类与感染剂量)影响在HerdChekPRRS ELISA 2XR中的相对S/P比值。虽然图3所示的ELISA结果显示明显的阳性或阴性平均群组反应，但重要的是应注意个体动物间的差异。有些在减毒型病毒组中的猪在直到第21天一直呈现阳性反应，而有些致病型病毒组中的猪直到第21天仍为阴性反应。
分析对N及nsp4蛋白特异性抗体反应显示，对PRRSV的免疫反应在程度上的变化与所接种的病毒分离株无关。在接种高度致病性病毒分离株MN 184与JA 142的动物中，对于N蛋白的抗体反应，显示了与其它所有病毒分离株相似的趋势，但在程度上较高。如图1与2显示，接种MN 184与JA 142的猪也具有最高病毒效价。这表明体液性免疫反应的程度在急性感染中可能与病毒负荷(如病毒效价所测定的)有关。有趣的是，所有组的反应的时间过程(time course)相同，虽然在高度致病性病毒分离株17198-6及减毒型病毒分离株中，最高效价到达时间延迟。反之，nsp4抗体反应在所有时间点且对于所有病毒分离株(减毒型及致病型)都很低。抗nsp4反应的时间流程在所有组中均相同，尽管与抗N蛋白抗体反应的观察结果相同，每组到达最高病毒负荷的时间有所差异。图7显示所有猪的抗nsp4反应都很低。
这些观察表明，某些PRRSV蛋白引起宿主免疫系统较强的反应，并且与所暴露的病毒分离株的致病性无关。然而，观察也显示，对于致免疫性较强的蛋白，其引发免疫反应的规模，可能与所暴露的病毒分离株的致病性，或病毒分离株在体内复制能力有关。另一可能性为，抗体反应的差异可能只是由于病毒分离株的基因差异，因而导致抗原反应性的差异，所以抗其它病毒分离株的N与nsp4的抗体不与VR2332病毒分离株表达的重组蛋白(其用于包被ELISA板)反应，或反应较差。然而，许多证据显示，所观察到抗体水平上的差异，反映出免疫相关性反应。根据ORF5比较测定，MN 184与VR2322病毒分离株基因差异最大，但是却表现出最高抗N抗体反应。先前Kapuer等人(1996年)显示，PRRSV分离株间在一开放读框中的相对差异，在其它开放读框中也同样存在。此外，单一蛋白含有保守及非保守区域(例如Kapur等人，1996年)，而强烈的成免疫反应性可能针对保守性抗原决定区(Ostrowski等人，2002年)。虽然如此，根据对经纯化PRRSV蛋白的抗体反应的ELISA结果可能受到基因及抗原差异影响，而这些效应需被考虑进去。对重组蛋白进行重折叠，但在包被了未经重折叠或经重折叠的蛋白的ELISA板之间未观察到差异。
需要注意的是，大约在接种后4到5周，发生对N及nsp4的抗体反应相对上较大的降低。Foss等人(2002年)先前对GP5(主要的膜醣蛋白)也观察到相似的1到2周的抗体反应性高峰然后抗体反应性降低。总之，这些观察结果提示，对于单一病毒蛋白的反应可能无法代表猪对PRRS病毒的免疫反应的全貌，因为由HerdChekPRRS ELISA 2XR所测定的体液性免疫反应并未显现抗体反应性的相似的短暂峰值。
生长减慢和死亡是使致病性及病毒的体内生长速率相互关联的关键。在致病性病毒暴露组中观察到的较低平均重量最可能反映PRRSV分离株在猪体内复制并诱导较严重疾病的能力的差异。这些观察与先前报导数据一致(Thacker，2003年)PRRS感染可能造成食欲不振，而日增重(daily weightgain)降低25到40百分比。暴露于致病型病毒的猪的临床评分在接种后不久显现快速增加，但此时，减毒型病毒暴露组动物的临床评分实际上并无改变。临床病征的增加在接受PRRS分离株MN 184、SDSU 73、与JA 142的致病型暴露组中表现为所观察到的死亡率分别为50％、20％与10％。反之，减毒型暴露组并未造成猪死亡。当比较暴露于MN 184与Abst-1的组时，在相同病毒感暴露况下，快速的病毒生长与病毒致病性的间关系最明显。接种效价实际上相同，分别为4.10logs每毫升及4.18logs每毫升，但是如图8显示，两病毒分离株影响猪的方式存在显著差异。Abst-1病毒分离株几乎无活性，几乎不在体内复制，且不导致临床病征出现。相反地，MN 184病毒分离株在活体内复制至高效价，并造成严重临床病征，使50％暴露的动物死亡。另外需注意的是，暴露至所有病毒分离株的混合物的猪，表现出与暴露至MN 184的猪的相同的病毒学、临床及免疫学反应。这个发现表明，在混合感染中，复制最快速的病毒可能胜过它种病毒分离株，导致最终结果与感染生长潜力最高的单一病毒分离株的情况相同。
致病型与减毒型PRRSV分离株在体内引人注意的差异，使我们明白病毒的致病性与其体内生长及复制的间的相关性。当给予猪相等剂量时，致病性越高的病毒分离株显示的Log10 TCID50/ml当量值及RT-PCR浓度值与减毒型病毒分离株相比呈指数式升高。致病型病毒分离株诱发较快速、较强的体液性免疫反应。致病型病毒分离株与减毒型病毒分离株相比，负面地影响获重并且造成较高死亡率与较严重的临床病征。
总结来说，本申请案的实施例及实验表示，减毒型及致病型PRRSV分离株造成显著不同的临床病征，以及不同规模的免疫反应。这些差异的原因是病毒在体内复制能力，其为可在血清样本中定量检测，并可以建立以预测PRRSV分离株致病性的表型特征。
实施例2本实施例提供几种对PRRS病毒分离株的减毒及将其包含入致免疫组合物的方法。
材料与方法配制疫苗制备物，其中掺入了经修饰或减毒的活病毒，以用于使猪通过感染PRRS病毒而获得免疫。用于疫苗制备物的PRRSV病毒是在MA-104持续性细胞株中繁殖，优选ATCC No.CL2621。细胞系生长在含有加入10％胎牛血清的MEM的培养瓶中。培养基的pH值调整至大约7.2，并培养在大约37℃。之后通过加入大约1毫升冷冻接种物到液态培养液基而用病毒接种细胞。使病毒吸附到细胞上，保持24小时。此时，将生长培养基更换为维持培养基(由加入4％胎牛血清的MEM，pH7.6所组成)。环境优选为35到37℃。使病毒生长，直到50％MA-104细胞薄层被病毒破坏。将样本冷冻，并准备传代至另一烧瓶的MA-104细胞。持续此过程，使病毒在细胞系中传代25代。之后在31℃，而非35到37℃，用上述相同技术，让病毒继续繁殖12代。将第12代进行分装，冷冻，称为种原病毒株(Master SeedVirus)。
以下详细说明较佳的方法。
I.培养基a.Eagles极限必需培养基(MEM)，购自JRH Biosciences，货号为#200-2041。
b.胎牛血清(FCS)，购自JRH Biosciences。
c.细胞培养的生长培养基-MEM+10％胎牛血清d.维持培养基-MEM 4％胎牛血清e.胰蛋白酶-Versene IXf.5％或饱和的碳酸氢钠(Sodium Bicarbonate)。
II.组织培养所使用细胞系MA-104(非洲绿猴(African Green Monkey)肾细胞，维持在20传代数水平内(继代数约58到78代)。
III.设备75cm组织培养瓶设定在35到37℃的培养箱设定在31℃的培养箱离心机IV.用于生长在25到37℃的减毒PRRS病毒的方法。
A.制备组织培养的母液(stock)将5到7天的MA-10475cm储存瓶，依下列方式以1比4方式分装a.倒掉所有培养基(每个培养瓶50毫升)。
b.使用10毫升胰蛋白酶-Versene，在37℃保温5到10分钟，以移出细胞薄层。
c.将细胞从瓶中取出，以270xg离心5到10分钟。
d.倒掉上清液，并将细胞再悬浮在5到10毫升生长培养基(MEM10％FCS)中。
e.将所有细胞加到200毫升MEM 10％FCS中，然后分配到四个75cm培养瓶中，每瓶50毫升以1比4分装。之后将培养瓶置于35到37℃，直到实验所需(可在无二氧化碳环境下进行)。
f.已形成细胞薄层的3到4天的培养瓶可立即使用。
g.调整培养瓶中的50毫升培养液的pH值到7.2，然后加入1毫升病毒到培养基中，将培养瓶置于35到37℃(可在无二氧化碳环境下进行)。
h.24小时后，倒掉培养基，重新加入50毫升MEM 4％FCS(pH7.6)到培养瓶中，再置于35到37℃。
i.此次液体更换24小时后，CPE应出现，而当50到60％孔洞出现在细胞薄层中时，将其冷冻。
j.将上述培养瓶解冻，取1毫升其中液体并将其移到新的75cm培养瓶，如上述，以制造下个病毒继代。
进行此以上步骤总共25次，生长在35到37℃。
V.用于减毒生长在31℃的PRRS病毒的方法。使用在35到37℃继代25次的病毒来制备生长在31℃病毒的第1继代。
A.准备组织培养的母液5到7天的MA-104细胞75cm储存瓶，依下列方式以1比4方式分装a.倒掉所有培养基(每个培养瓶50毫升)。
b.使用10毫升胰蛋白酶-Versene在37℃保温5到10分钟，以移出细胞薄层。
c.将细胞从瓶中取出，以270xg离心5到10分钟。
d.倒掉上清液，并将细胞再悬浮在5到10毫升生长培养基(MEM10％FCS)中。
e.将所有细胞加到200毫升MEM 10％FCS中，然后分配到四个75cm培养瓶中，每瓶50毫升，1比4分装。之后将培养瓶置于35到37℃，直到实验所需(可在无二氧化碳环境下进行)。
f.已形成细胞薄层的3到4天的培养瓶可立即使用。
g.调整培养瓶中的50毫升培养基pH值到7.2，然后加入1毫升病毒到培养基中，将培养瓶置于31℃(可在无二氧化碳环境下进行)。
h.24小时后，倒掉培养基，重新加入50毫升MEM 4％FCS(pH7.6)到培养瓶中，置于31℃。
i.此次液体更换24小时后，CPE应出现，而当50到60％孔洞出现在细胞薄层中时，将其冷冻。
j.将上述培养瓶解冻，并取出1毫升此液体以制备下个SIRSVR-2332病毒继代。
在31℃执行以上步骤总共12次。将生长在31℃病毒的第12继代称为种原病毒株(Master Seed Virus)，用来生产疫苗。
利用基因缺失使PRRS病毒减毒熟习此技术者可以利用传统基因缺失方式使PRRSV减毒。一般来说，该方法包括使编码病毒的致病表型的相关基因缺失。该方法可以改编自如Elbers等人(U.S.Pat.App.No.20020012670)或Schall等人(U.S.Pat.No.6,740,324)的参考文献，其教示与内容系以引用方式包含入本文中。
利用温敏型突变使PRRS病毒减毒熟习此技术者也可以利用传统温敏型突变方法使PRRSV减毒。一般来说，此方法包括造成突变，其限制病毒活化的温度范围。例如，可以改编Skiadopoulos等人(”Identification of Mutations Contributing to theTemperature-Sensitive，Cold-Adapted，and Attenuation Phenotypes of the Live-减毒的Cold-Passage 45(cp45)Human Parainfluenza Virus 3 CandidateVaccine”，73 No.2 Journal of Virology 1374，(February 1999))的方法以用于PRRSV。Skiadopoulos等人的教示及内容系以引用方式包含入本文中。
利用建立感染性殖系使PRRS病毒减毒熟习此技术者也可以利用传统建立感染性殖系的方法使PRRSV减毒。一般来说，该方法包括建立含有所需病毒基因型的全长cDNA克隆，该克隆也对目标动物具有致病性。例如，可以改编Nielson等人(”Generation of anInfections Clone of VR-2332，a高ly Virulent North American-type Isolate ofProcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus”，77 Journal of Virology3702(Mar.2003))的方法以用于PRRSV的减毒型。Nielson等人的教示及内容系以引用方式包含入本文中。
利用基因插入使PRRS病毒减毒熟习此技术者也可以利用传统基因插入方法使PRRSV减毒。一般来说，该方法包括将一段基因插入到病毒中，该基因抑制病毒的致病性表型。例如，可以改编Schall等人(U.S.Pat.No.6,740,324)的方法以用于此等PRRS病毒的减毒型。Schall等人的教示及内容系以引用方式包含入本文中。
利用碱基对置换使PRRS病毒减毒熟习此技术者也可以利用传统密码子与碱基对置换方法使PRRSV减毒。一般来说，密码子或碱基对置换包含用不同的密码子或碱基对置换密码子与碱基使病毒基因编码限制病毒病原性的蛋白质。例如，可以改编McAuliffe等人(”Codon Substitution Mutations at Two Positions in the LPolymerase Protein of Human Parainfluenza Virus Type 1 Yield Viruses with aSpectrum of Attenuation In Vivo and Increased Phenotypic Stability In vitro”，78Journal of Virology 2029(February 2004))的密码子置换方法，来建立用于减毒PRRS病毒的基因置换方法。此外，Hurrelbrink与McMinn(”Attenuationof Murray Valley Encephalitis Virus By Site-Directed Mutagenesis of the Hingeand Putative Receptor-Binding Regions of the Envelope Protein”，75 Journal ofVirology 7692(Auguest 2001))以及Elbers等人(U.S.Pat.App.No.20020012670)提供碱基对置换方法，其可被改编来建立经减毒PRRS病毒分离株。McAuliffe等人、Hurrelbrink与McMinn、以及Elbers等人的教示及内容系以引用方式包含入本文中。
利用嵌合型PRRS构建体使PRRS病毒减毒熟习此技术者也可以利用传统嵌合型构建体的方法使PRRS病毒减毒。一般来说，嵌合型构建体系带有不同种的基因以在宿主细胞中诱发产生抗原性反应。例如，可以改编Harris等人(U.S.Pat.App.No.20040157307)的方法，来建立具有PRRS基因的嵌合型构建体。
将减毒型PRRS病毒分离株掺入致免疫组合物在对新的病毒分离株进行减毒后(优选以上述方法之一)，将该减毒型分离株掺入可有效提供对抗PRRS致病性分离株的免疫反应的组合物。优选方式是，对于接受有效量组合物的动物，该组合物可以提供对抗PRRS病毒感染的防护性免疫。在以后暴露或受到致病型病毒分离株感染的接种后的动物中，此种防护性免疫可以降低PRRS病毒感染的临床病征的严重度。优选，所述临床病征会通过投药有效量的致免疫组合物或疫苗而得以防止。在某些形式中，减毒型PRRS分离株会被用来制备经改良的活病毒疫苗，其中在致免疫组合物中，减毒分离株以其存活状态使用。在其它形式中，减毒分离株会在包含入致免疫组合物前被杀灭或灭活。
参考文献以下每个参考文献的教示与内容系以引用方式包含入本文中。
Albina，E.，Piriou，L.，Hutet，E.，Cariolet，R.，L’Hospitalier，R.，1998.Immune Responses in Pigs Infected with Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus(PRRSV).Vet.Immunol.Immunopathol.61，49-66.
Andreyev，V.G.，Wesley，R.D.，Mengeling，W.L.，Vorwald，A.C.，Lager，K.M.，1997.Genetic Variation and Phylogenetic Relationships of 22 PorcineReproductive and Respiratory Syndrome Virus(PRRSV)Field Strains Based onSequence Analysis of Open Reading Frame 5.Arch.Virol.142，993-1001.
Cavanagh，D.，1997.Nidoviralesa New Order Comprising Coronaviridaeand Arteriviridae.Arch.Virol.142，629-633.
Chang，C.C.，Yoon，K.J.，Zimmerman，J.J.，Harmon，K.M.，Dixon，P.M.，Dvorak C.M.T.，Murtaugh，M.P.，2002.Evolution of Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus During Sequential Passages in Pigs.J.Virology.76，4750-4763.
Grebennikova，T.V.，Clouser，D.F.，Vorwald，A.C.，Musienko，M.I.，Mengeling，W.L.，Lager，K.M.，Wesley，R.D.，Biketov，S.F.，Zaberezhny，A.D.，Aliper.T.I.，Nepoklonov，E.A.，2004.Genomic Characterization of Virulent，Attenuated，and Revertant Passages of North American Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus Strain.Virology.321，383-390.
Dianzani F.，G.Anelli，E.Riva，O.Turriziani，L.Antonelli，S.Tyring，D.Carrasco，H.Lee，D.Nguyen，J.Pan，J.Poast，M.Cloyd，S.Baron.2002.IsHuman Immunodeficiency Virus Rna Load Composed Of Neutralized ImmuneComplexes？Journal of Infectious Diseases.1851051-1054.
Foss，D.L.，Zilliox，M.J.，Meier，W.，Zuckermann，F.，Murtaugh，M.P.2002.Danger Signals Increase the Immune Response to Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus.Virus Res.15，557-566.
Halbur，P.G.，Pallares，F.J.，Rathje，J.A.，Evans，R.，Hagemoser，W.A.，Paul，P.S.，Meng，X.J.，2002.Effects of Different Us Isolates of Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrome Virus(PRRSV) on Blood and Bone MarrowParameters of Experimentally Infected Pigs.Vet Rec.21，344-348.
Halbur，P.G.，Paul，P.S.，Meng，X.J.，Lum，M.A.，Andrews，J.J.，Rathje，J.A.，1996.Comparative Pathogenicity of Nine Us Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus(PRRSV)Isolates in a Five-week-oldCesarean-derived，Colostrums-deprived Pig Model.J.Vet.Diagn.Invest.8，11-20.
Haynes，J.S.，Halbur，P.G.，Sirinarumitr，T.，Paul，P.S.，Meng，X.J.，Huffman，E.L.，1997.Temporal and Morphologic Characterization of theDistribution of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus(PRRSV)by in Situ Hybridization in Pigs Infected with Isolates of PRRSV That Differ inVirulence.Vet.Pathol.34，39-43.
Hill，H.，1990.Overview And History Of Mystery Swine Disease(SwineInfertility And Respiratory Syndrome). In Mystery Swine DiseaseCommunication Meeting.Denver，CO，pp.29-31.
Kapur，V.，Elam，M.R.，Pawlovich，，T.M.Murtaugh，M.P.1996.GeneticVariation In PRRS Virus Isolates In The Midwestern United States.J.Gen.Virol.77，1271-1276.
Key，K.F.，Haqshenas，G.，Guenette，D.K.，Swenson，S.L.，Toth，T.E.，Meng，X.J.，2001.Genetic Variation And Phylogenetic Analyses Of The Orf5Gene Of Acute Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus Isolates.Vet.Micro.83，249-263.
Labarque，G.，Van Gucht，S.，Van Reeth，K.，Nauwynck，H.，Pensaert，M.，2003.Respiratory Tract Protection Upon Challenge Of Pigs Vaccinated WithAttenuated Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus Vaccines.Vet.Micro.95，187-197.
Meng，X.J.，2000.Heterogeneity of Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome VirusImplications for Current Vaccine Efficacy and Future VaccineDevelopment.Vet.Micro.74，309-329.
Mengeling，W.L.，Lager，K.M.，Vorwald，A.C.，Clouser，D.F.，2003a.Comparative Safety and Efficacy of Attenuated Single-strain and Multi-strainVaccines for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome.Vet.Micro.93，25-38.
Mengeling，W.L.，Lager，K.M.，Vorwald，A.C.，Koehler，K.J.，2003b.Strain Specificity of the Immune Response of Pigs Following Vaccination withVarious Strains of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus.Vet.Micro.93，13-24Mengeling，W.L.，Lager，K.M.，Vorwald，A.C.，1998.Clinical Effects ofPorcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus on Pigs During the EarlyPostnatal Interval.Amer.J.Vet Res.59，52-55.
Murtaugh，M.P.，K.S.Faaberg，J.Laber，M.Elam，and V.Kapur.1998.Genetic Variation In The PRRS Virus.Adv.Exp.Med.Biol.440，787-794.
Murtaugh，M.P.，Xiao，Z.，Zuckermann，F.，2002.ImmunologicalResponses Of Swine To Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome VirusInfection.Viral Immunology.15，533-547.
Nodelijk，G.，de Jong，M.C.M.，van Leengoed，L. A.M.G.，Wensvoort，G.，Pol，J.M.A.，Steverink，P.J.G.M.，Verheijden，J.H.M.，2001.A QuantitativeAssessment Of The Effectiveness Of PRRSV Vaccination In Pigs UnderExperimental Conditions.Vaccine 19，3636-3644.
Ostrowski，M，，Galeota，J.A.，Jar，A.M.，Platt，K.B.，Osorio，F.A.，Lopez，O.J.2002.Identification Of Neutralizing And Nonneutralizing Epitopes In ThePorcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus Gp5 Ectodomain.J.Virol.76，4241-4250.
Opriessnig，T.，Halbur，P.G.，Yoon，K.J.，Pogranichniy，R.M.，Harmon，K.M.，Evans，R.，Key，K.F.，Pallares，F.J.，Thomas，P.，Meng，X.J.，2002.Comparison Of Molecular And Biological Characteristics Of A Modified LivePorcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus(PRRSV)Vaccine(Ingelvac PRRS Mlv)，The Parent Strain Of The Vaccine(Atcc Vr2332)，AtccVr2385，And Two Recent Field Isolates Of PRRSV.J.Vrol.76，11837-11844.
Pejsak，Z.，Stadejek，T.，Markowska-Daniel，I.，1997.Clinical Signs AndEconomic Losses Caused By Porcine Reproductive And Respiratory SyndromeVirus In A Large Breeding Farm.Vet.Micro.55，317-322.
Reed，L.，Muench，H.，1938.A Simple Method For Estimating Fifty PercentEndpoints.Am J Hyg.27，493-497.
Roof，M.B.，Vaughn，E.M.，Burkhart，K.M.，Faaberg，K.S.2003.EfficacyOf Modified Live Virus Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome VirusVaccines Against Heterologous Respiratory Challenge.Proc.4thInter.Symp.Emerging Re-emerging Pig Diseases.pp.117-118.
Thacker，B.，2003.Clinical Manifestations Of PRRS Virus.InZimmerman，J.，Yoon，K.J.(Eds.)，2003 PRRS Compendium Second Edition.National PorkBoard，Des Moines IA USA，pp.7-12.
Thanawongnuwech，R.，Halbur，P.G.，Ackermann，M.R.，Thacker，E.L.，Royer，R.L.，1998.Effects Of Low(Modified-live Virus Vaccine)And High(Vr-2385)-virulence Strains Of Porcine Reproductive And Respiratory SyndromeVirus On Pulmonary Clearance Of Copper Particles In Pigs.Vet.Pathol.35，398-406.
Yuan，S.，Mickelson，D.，Murtaugh，M.P.，Faaberg，K.S.，2001.Erratum To“Complete Genome Comparison Of Porcine Reproductive And RespiratorySyndrome Virus Parental And Attenuated Strains”.Virus Research.79，189-200.
权利要求
1.一种预测致病性未知的PRRS病毒分离株的致病性的方法，其步骤包括将一定量的该PRRS病毒分离株给予到未受PRRS病毒感染的猪，使病毒在所述猪中复制大约3到15天的一段期间，测量该期间内病毒生长速率和/或病毒血症水平，并比较该生长速率和/或病毒血症水平与致病性已知的PRRS病毒分离株的生长速率和/或病毒血症水平，以其作为致病性未知的PRRS分离株的致病性预测指标。
2.根据权利要求1的方法，所述期间大约在3到7天之间。
3.根据权利要求1的方法，包括在所述期间测量病毒血症水平，以及比较该水平与所述已知PRRS病毒分离株的病毒血症水平的步骤。
4.根据权利要求1的方法，该给予的病毒的量类似于动物自然暴露所接受的量。
5.根据权利要求1的方法，该PRRS病毒通过选自口服，鼻内、肌肉内、淋巴结内、皮内、腹腔内、皮下、或其组合所组成的组的方法而给予。
6.根据权利要求1的方法，该生长速率或病毒血症水平在来自所述猪的生物样品中测量。
7.根据权利要求1的方法，该病毒血症的测量通过Log10TCID50/ml、逆转录酶聚合酶链反应、PRRS特异性ELISA、PRRS蛋白-特异性ELISA、或其组合来进行。
8.根据权利要求1的方法，进一步包括在给予所述PRRS病毒分离株后观察该猪PRRS感染的临床病征的步骤。
9.根据权利要求8的方法，该临床病征包括呼吸症状、行为、咳嗽，或其组合。
10.根据权利要求1的方法，进一步包括当该PRRS分离株的生长速率或病毒血症水平与具有高致病性的病毒分离株相似时预测该PRRS病毒分离株具有高致病性的步骤。
11.根据权利要求1的方法，进一步包括当该PRRS分离株的生长速率或病毒血症水平与具有低致病性的病毒分离株相似时预测该PRRS病毒分离株具有低致病性的步骤。
12.根据权利要求1的方法，其中该PRRS病毒的给予量可达大约5毫升接种物，其病毒浓度可达5.0 Log10TCID50/ml。
13.一种致免疫组合物，其包括减毒型PRRS病毒分离株与药理学上相容的载体，该减毒型PRRS病毒分离株选自由Abst-1以及根据权利要求1的方法被预测为具致病性的PRRS病毒的减毒形式所组成的组。
14.根据权利要求13的组合物，该减毒型病毒分离株为Abst-1。
15.根据权利要求13的组合物，所述根据权利要求1的方法被预测为具致病性的PRRS病毒分离株选自由ATCC VR-2332、ATCC PTA-6504、ATCC PTA-6319、ATCC PTA-6321、与ATCC PTA-6322所组成的组。
16.一种挑选用于减毒并包含入致免疫组合物中的PRRS病毒分离株的方法，其包括以下步骤a)获得致病性未知的PRRS分离株；b)将一定量的该PRRS病毒分离株给予未受PRRS病毒感染的猪；c)使该分离株在该猪中复制从大约3到15天的一段期间；d)在该期间测量病毒生长速率和/或病毒血症水平；e)将该生长速率和/或病毒血症水平与致病性已知的PRRS病毒分离株的生长速率和/或病毒血症水平比较；以及f)根据分离株的生长速率和/或其病毒血症水平与致病性已知的分离株的比较，挑选用于减毒并包含入致免疫组合物的分离株。
17.根据权利要求16的方法，步骤(f)进一步包括挑选与高致病性分离株具有相似的生长速率和/或病毒血症水平的分离株。
18.根据权利要求16的方法，进一步包括使所选病毒减毒的步骤。
19.根据权利要求18的方法，该病毒选自通过在细胞培养物中重复连续传代、基因插入、基因转换、基因缺失、碱基对置换、与温度敏感突变所组成的组的方法来减毒。
20.根据权利要求18的方法，进一步包括将该所选病毒包含入致免疫组合物的步骤。
全文摘要
本发明提供一种预测新的或未表征的PRRS病毒分离株的致病性的方法，其中，将病毒分离株注射到猪，使其复制一段时间(大约3到15天)。在该期间，测量病毒生长速率和/或病毒血症水平，并将此数据与致病性已知的PRRS病毒分离株的生长速率和/或病毒血症水平作比较，以此当作新的或未表征的PRRS病毒分离株的致病性的标准。此外，本发明也提供一种根据所预测的致病性来挑选用以包含在致免疫组合物中的病毒分离株的方法，以及包含预测为致病型病毒的减毒型的组合物。
文档编号C12N7/04GK101090981SQ200580038053
公开日2007年12月19日 申请日期2005年9月21日 优先权日2004年9月21日
发明者迈克尔·鲁夫, 埃里克·沃恩, 韦斯利·约翰逊 申请人:贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司