专利名称：稳定性和滤过性有包膜病毒制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗性活病毒和活病毒疫苗的制剂。
背景技术：
针对-20℃液体冷冻成活病毒疫苗的稳定化，只报道过极有限的例子。而它们之中大部分都没有使用经纯化的成活有包膜病毒(1、2、3、4、5)。使有包膜病毒在冷冻点以下的温度稳定的主要挑战之一是防止结构性和功能性成分(即蛋白质、脂双层和病毒基因组)在冷冻期间和保存阶段的物理性破坏。已报道，蛋白质易受到变性的影响(6)，而脂双层在冷冻期间则易遭破坏(7)。已报道了几种使脂双层和蛋白质的结构在冷冻期间和冻结状态下稳定的赋形剂(6、7)。这些赋形剂包括多羟基化合物、糖类、缓冲剂、氨基酸和聚合物。
使有包膜病毒在冷冻点以下温度稳定的主要任务是防止病毒的结构性和功能性成分在冷冻期间和保存阶段的物理性破坏。所述有包膜病毒成分包括1)脂双层包被膜；2)病毒基因组编码的蛋白；以及3)单链或双链DNA或RNA基因组。
为确保保存期间的稳定性，感染性病毒的保存物由于其复杂性而通常在超低温(例如≤-60℃)保存。Gould，E.A.(“Methods for long-term VirusPreservation”，Molecular Biotechnology Vol.13，pp.57-66，1999)教导脂质有包膜病毒在-60℃以下的超低温很好地存活，但是“只有在病毒感染性的保持不是必需的情况下”，才能使用-20℃进行保存。D.R.Harper描述了各种非有包膜病毒和有包膜病毒的保存条件(“Virology，编辑，D.R.Harper，BIOS Scientific Publishers Limited，Oxford，UK，1993)。在所有情况中，为保持感染力，病毒不是必须以液体形式保存在-70℃就是作为冻干物(lyophile)保存在4℃。新城疫病毒液体制剂的保存条件被特别提及为-70℃。
Yannarell等(“Stabilizing cold-adapted influenza virus vaccine undervarious storage conditions”，J.Virol.Meth.Vol.102，PP.15-25，2002)描述了用SPG在-20℃保存冷适应性流感病毒疫苗的条件，SPG是蔗糖、磷酸盐和谷氨酸盐的混合物(0.218M蔗糖、0.0038M磷酸二氢钾、0.0072M磷酸氢二钾、0.0049M谷氨酸钾)。制备于尿囊液中的鼻内施用流感病毒用10倍SPG溶液稀释。该混合液中蔗糖的终浓度为7.5％。磷酸盐的存在并不能帮助稳定NDV，而谷氨酸盐阻碍除菌过滤，因此这两种化合物不利于NDV制备和在-20℃保存。
胃肠外施用增加了额外的配制问题。为安全起见，胃肠外用产品必须经过0.2μm过滤器过滤除菌，这是因为对于活病毒制备物来说，最后除菌(terminal sterilization)是不可能的。新城疫病毒体为直径大约0.1nm～0.5nm的多型但大致球形的粒子。经0.2μm除菌过滤器过滤的NDV回收率具有制剂依赖性，并且是研发-20℃液体NDV制剂时需考虑的重要因素。
影响NDV通过0.2μm除菌过滤器的能力的因素包括病毒的直径、过滤器孔径以及NDV经过滤器的吸附。NDV的表观直径受到下述因素影响1)制剂的张性；和2)NDV的表面电荷，它们可以影响不同缓冲剂存在下的蛋白或核酸在NDV表面的分子构象和吸收。
NDV在滤器膜上的吸附也会对病毒经受除菌过滤器的能力产生重要影响。有些因素可以对NDV的表面性质产生影响，因而影响NDV在过滤器上的吸附。这些因素包括1)pH，2)离子强度，3)表面相互作用，包括疏水性或范德华相互作用和离子相互作用，和4)诸如表面活性剂等表面活性物质的存在。
发明内容
本发明提供一种使有包膜病毒在中度低温保存下稳定的方法，该方法包括制备包含浓度为106PFU/mL～1012PFU/mL的有包膜病毒以及非还原性糖类的水溶液。当所述非还原性糖类是二糖时，其在溶液中的存在浓度为5％(w/v)～50％(w/v)；当所述非还原性糖类是单糖时，其在溶液中的存在浓度为2.5％(w/v)～25％(w/v)。根据本发明，所用溶液具有大约250mOs或更高的渗透压，并具有5～10的pH。
本发明基于以下意想不到的发现在含有非还原性糖类的水溶液中制备有包膜病毒是达到在中度低温下除菌过滤和长期稳定性的有效方式。
图1不同缓冲液中的NDV的滤过性。
具体实施例方式
本发明使用的过渡性术语“包含”是开放式的。使用该术语的权利要求可以含有除了在该权利要求中叙述的成分以外的其它成分，因此，例如，在权利要求中记载的治疗策略还包括其他并未在这里特别记载的治疗剂或治疗性病毒剂量(只要该记载的要素或其等价物是存在的)。
本文使用的“NDV”是新城疫病毒的缩略语。根据本发明，当病毒是新城疫病毒时，它可以是低毒力(缓发型)、中等毒力(中发型)或强毒力(速发型)。毒力水平根据胚平均死亡时间(MDT)测试确定(Alexander，“Chapter 27Newcastle Disease”；Laboratory Manual for the Isolation andIdentification of Avian Pathogens，第三版，Purchase等编辑(Kendall/Hunt，Iowa)，第117页)。根据MDT测试，将病毒分为弱毒力(MDT＞90小时)；中等毒力(MDT为60～90小时)；和强毒力(MDT＜60小时)。
如本文所使用的，给定成分或杂质的“基本上不包含”量意味着该化合物以百万分之十份或更少的浓度存在于溶液中。
考虑到噬斑形成单位测试的固有变化性，如果根据PFU/mL量的变化所测定的早期时间点和晚期时间点之间的感染性丢失少于50％，则认为病毒在给定时间范围是“稳定的”。就本发明来说，仅仅保持了个别病毒蛋白的酶活性而没有同时保持其感染性并不认为是保持了“稳定性”。
本发明使用水溶液，这是因为水在维持液体制剂中的有包膜病毒的三维结构和稳定性中是必需的。
并不希望其中病毒被过度稀释的溶液，这是因为有包膜病毒不够稳定，而在保存期间高病毒浓度看起来不会破坏稳定性。在冷冻过程中，有包膜病毒将被浓缩至间质区，在该间质区状态下，认为有包膜病毒处于高度浓缩状态。根据本发明，有包膜病毒的浓度为106PFU/mL～1012PFU/mL，优选为1×1010PFU/mL～7×1010PFU/mL。
利用根据本发明的水溶液能够配制任何有包膜病毒。例如，可以使用副粘病毒，例如新城疫病毒。新城疫病毒的中等毒力株是目前优选的。
为在中度低温(例如-20℃)保护有包膜病毒免遭失活，要考虑两个重要因素在液体状态下的等渗性和防止在冷冻期间蛋白变性以及脂质膜破坏。如果渗透压远远低于等渗点，则它可能引起病毒膜爆裂。高渗压看起来并不会影响有包膜病毒在保存期间的稳定性。根据本发明，大约250mOs或更高的渗透压是适宜的。优选渗透压为大约300mOs。当溶液中糖类浓度大大低于10％(w/v)，有必要加入其他赋形剂以获得所希望的渗透压。
其他可以影响稳定性的重要因素是在冷冻和保存过程中结构和功能性成分的破坏。非还原性糖类，特别是二糖，在保护有包膜病毒免遭冷冻过程中的失活方面最有效。无意于受到机制的限制，据信，通过防止蛋白三维结构变性和脂质双层结构破坏而实现保护。非还原性糖类也可以用于调整最终制剂中的渗透压。相反，还原性糖类(乳糖)并不显示同样的稳定作用。任何非还原性糖类都能够用于本发明的溶液中。当糖类是二糖时，它以5％(w/v)～50％(w/v)的浓度存在于溶液中。在一个具体的实施方式中，二糖以7.5％(w/v)～15％(w/v)的浓度存在。在一个优选的实施方式中，二糖以10％(w/v)～20％(w/v)的浓度存在，更具体的浓度是大约10％(w/v)。合适的二糖的例子包括蔗糖或海藻糖。当糖类是单糖时，它以2.5％(w/v)～25％(w/v)，优选为4％(w/v)～7％(w/v)，更优选为大约5％(w/v)的浓度存在于溶液中。
根据本发明，所述溶液可以进一步选择性包含浓度为0.1％(w/v)～5％(w/v)的赖氨酸(L-赖氨酸和D-赖氨酸是合适的)或精氨酸，或联合浓度为0.1％(w/v)～5％(w/v)的赖氨酸和精氨酸。赖氨酸和/或精氨酸的浓度优选为大约1％(w/v)。
病毒的稳定性受到pH的影响。根据本发明，所述溶液的pH可为5～10，优选6.5～9，更优选为7～9，更具体为大约7.5。
许多化合物对稳定性、滤过性或两者具有负面影响，应该使它们在溶液中的存在最小化。为得到最佳稳定性，根据本发明的溶液应该基本上不包含还原剂(例如还原性糖类、半胱氨酸)或抗氧化剂(例如EDTA、抗坏血酸)。一些其他化合物有害性较小，因此，没有必要完全排除。例如，根据本发明使用的溶液包含最高达0.1％(w/v)氯化钠；1％(w/v)葡聚糖；0.5％(w/v)甘露醇；0.1％(w/v)山梨醇；0.01％(w/v)吐温；0.01％(w/v)谷氨酸盐；0.5％(w/v)聚乙二醇；0.1mM氯化钙；0.5％(w/v)磷脂酰胆碱；0.05％(w/v)甘氨酸；以及0.01％(w/v)磷酸盐是可以接受的。而优选所述溶液基本上不包含氯化钠、葡聚糖、甘露醇、吐温、谷氨酸盐、聚乙二醇、氯化钙、磷脂酰胆碱、甘氨酸和磷酸盐。甘氨酸以及诸如谷氨酸盐或磷酸盐缓冲剂等带负电荷缓冲剂不利于除菌过滤和回收。
当所述溶液经胃肠外施用时，其应该是无菌的。对局部或口服施用来说无菌状态并不是关键的。可以并且优选在低温保存前用药物级除菌过滤器进行除菌处理。除菌的优选方法是用其规格大于有包膜病毒有效尺寸但小于细菌的过滤器进行大小过滤。优选0.2微米的除菌过滤器。通常溶液的粘性随浓度而增加，这使得过滤NDV较困难。为在除菌过滤期间获得优异的病毒回收率，压力优选应该保持在10～15psi(帕斯卡)。使用高粘性和低压环境，过滤有包膜病毒非常困难。高粘性的问题能够在病毒的除菌过滤之后通过使用无菌混合而得到克服。为了避免高粘性，优选不使用高浓度赋形剂。例如，葡聚糖、基于葡萄糖的聚合物会在最后的过滤期间影响病毒的过滤和回收。
尽管以前相信有包膜病毒的液体制剂只有在像-60℃或-70℃这样的超低温才是稳定的，然而令人惊奇的发现，根据本发明配制的有包膜病毒在-20℃是长期稳定的。例如，根据本发明配制的有包膜病毒在-4℃～-30℃，优选为-10℃～-30℃，更优选为-15℃～-25℃，进一步更优选为-20℃是稳定的。在-20℃左右保存是很方便的。在-20℃维持稳定性的能力将使得治疗性产物在医院和药房保存成为可能，这些地方通常具有-20℃的冷冻装置，但通常不具备-70℃的冷冻装置。而且，由于传统的容器密封在-20℃比在-70℃维持更好的弹性，因此，通过-20℃的保存确保了无菌性的保持以及随之的病人安全性。使用本发明的方法，有包膜病毒稳定6个月、12个月、24个月或更长。
通过参考下面的实施例，会更好地理解本发明，所述实施例举例说明而不是限制本文所述的发明。在下面的实施例中，NDV是三重噬斑纯化的MK107株，其是新城疫病毒的减毒(中等毒力)型，更充分的描述见国际专利公开WO 00/62735，
公开日为2000年10月26日(Pro-Virus，Inc.)。本文特此以参考的方式引用WO 00/62735的全部内容。
实施例将ML定义为pH8.0时5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)赖氨酸。
实施例1NDV在5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)赖氨酸溶液中的稳定性NDV来源于经三重噬斑纯化的中等毒力新城疫病毒株Mass-MK107，并通过在10天大的鸡胚(embronated chicken egg)尿囊液腔中接种病毒而制备。在36℃孵育2天后，冷冻该胚，并收获尿囊液。所收获的尿囊液经5％(w/v)D-甘露醇和1％(w/v)L-赖氨酸、pH8.0缓冲液(ML)透析过滤，以及经切向流过滤和尺寸排阻色谱法澄清和纯化，至浓度为4E+10PFU/mL，将试样等分并保存在-20℃。通过噬斑分析测定NDV滴度，用每毫升感染性NDV噬斑形成单位(PFU)量表示。为进行该测定，将人HT1080纤维肉瘤细胞接种到组织培养板中，生长至汇合成片。移走生长培养基，用培养基洗涤单层细胞并加入0.5mL NDV样品。在5％CO2、37℃条件下摇动平板孵育90min。如所述方法洗涤单层细胞，并将3mL半固体琼脂培养基覆盖到各孔上。将培养物在5％CO2、37℃条件下孵育48小时。用中性红染色单层细胞，对噬斑进行计数，并测定病毒滴度，PFU/mL。结果(表I)显示保存在-20℃的5％甘露醇/1％赖氨酸中的NDV并不稳定，平均丧失了超过80％的活性。
稳定性用相对于计时起点滴度的剩余滴度百分数表示。
表I在-20℃、5％D-甘露醇(w/v)和1％赖氨酸(w/v)中配制的NDV的稳定性
*NT未检测实施例2NDV在10％(w/v)蔗糖溶液中的稳定性通过实施例1描述的方法制备NDV，经切向流过滤和尺寸排阻色谱法将缓冲液交换为10％(w/v)蔗糖溶液，将试样等分并保存在-20℃。通过实施例1中所描述的噬斑分析法测定稳定性。结果(表II)显示保存在-20℃的10％蔗糖(w/v)中的NDV稳定性最长达24个月。
表IINDV在-20℃、10％(w/v)蔗糖制剂中的稳定性
*NT未检测实施例3NDV在含有其他赋形剂的10％(w/v)蔗糖溶液中的稳定性如实施例1所描述的方法制备NDV，缓冲液经切向流过滤和尺寸排阻色谱法交换为10％(w/v)蔗糖溶液。通过加入L-赖氨酸、L-甘氨酸、或L-谷氨酸至终浓度为1％(w/v)而制备含有氨基酸的10％(w/v)蔗糖中的NDV的单独制剂。将所述制剂等分并保存在-20℃。通过实施例1中所描述的噬斑分析法测定稳定性。结果(表III)显示保存在-20℃的含有1％赖氨酸、1％甘氨酸或1％谷氨酸的10％(w/v)蔗糖中的NDV稳定性最长达14个月。
表IIINDV在-20℃、含有氨基酸的10％(w/v)蔗糖中的稳定性
实施例4NDV在其他缓冲溶液中的稳定性如实施例1所描述的方法制备NDV。将各份NDV样品用缓冲液交换成包含以下的不同制剂5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)L-赖氨酸/2％(w/v)明胶水解物、10％(w/v)海藻糖/1％(w/v)L-赖氨酸、5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)赖氨酸中的200mM乙酸钠和5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)赖氨酸中的2％人血清白蛋白(HSA)，将试样等分并保存在-20℃。通过实施例1中所描述的噬斑分析法测定稳定性。将2％(w/v)明胶水解物加入到于5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)L-赖氨酸中制备的NDV中，比于甘露醇/L-赖氨酸制剂(参见实施例1)中制备的NDV具有明显改进的稳定性。而加入2％HAS具有更适中的保护水平。
表IVNDA制剂在-20℃，于含有明胶水解物、HAS、乙酸钠和海藻糖的缓冲液中的稳定性
实施例5NDV在-20℃、葡聚糖缓冲液中的稳定性如实施例1所描述的方法制备NDV。将各份NDV样品用缓冲液交换成包含以下的不同制剂0.9％(w/v)NaCl/5％(w/v)葡聚糖和10％(w/v)海藻糖/20％(w/v)葡聚糖。当将NDV保存在-20℃时，发现葡聚糖给NDV提供了适中水平的保护(表V)。
表VNDV在-20℃、葡聚糖缓冲液中的稳定性
实施例6NDV在其他缓冲溶液中的稳定性通过实施例1描述的方法纯化NDV，将缓冲液交换为不同缓冲液(参见实施例4和5)，将试样等分并保存在-20℃。通过实施例1中所描述的噬斑分析法测定稳定性。结果(表VI)显示当保存在-20℃时，在如表VI中描述的这些缓冲液中制备的NDV是不稳定的。
将该页其余部分故意留为空白表VI以下缓冲液中的NDV在-20℃显示较差的稳定性
*NT未检测实施例7对在甘露醇中制备的NDV的除菌过滤如实施例1所述制备在5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)赖氨酸中的NDV。一部分经透析过滤(如何)至5％(w/v)甘露醇中。将葡聚糖加入到NDV ML的另一部分以制备在含有10％(w/v)葡聚糖的ML中的NDV样品。在15psi，将大约30mL各样品依次通过0.45μm SartobranTM预过滤器和0.22μm SartobranTM过滤器以测试这些样品经受除菌过滤的能力。先用ML缓冲液预润湿过滤器。收集各样品的滤出液并如实施例1所描述通过噬斑测定法对其进行分析以测定所回收的病毒噬斑活性(PFU)总量。在ML缓冲液或在5％(w/v)甘露醇中制备的NDV可以被容易地滤过，而在含有10％(w/v)葡聚糖的ML缓冲液中制备的NDV略微有点不能通过过滤器(表VII)。
表VII针对含有甘露醇/赖氨酸/葡聚糖的NDV的过滤研究小结
实施例8含有赖氨酸/磷酸盐/NaCl的NDV甘露醇缓冲液的除菌过滤如实施例1所述制备NDV，将其交换成如图1所述的缓冲液，并如实施例7所述对其经受除菌过滤的能力进行测试。用在制剂中使用的缓冲液预润湿过滤器。针对每一制剂，收集经过过滤器的NDV缓冲液的体积并计算累计体积。在5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)赖氨酸中制备的NDV很好地滤过。在324mOs NaCl中制备的NDV稍微滤过，而当在含有1％(w/v)L-赖氨酸、20mm磷酸盐的5％(w/v)甘露醇或在含有0.9％NaCl或20mM磷酸盐的5％(w/v)甘露醇/1％(w/v)赖氨酸中制备NDV时，NDV不能很好地除菌滤过。
实施例9在含有10％(w/v)蔗糖或10％(w/v)海藻糖的缓冲液中制备的NDV的除菌过滤如实施例1所述制备NDV样品并将其透析过滤到10％(w/v)蔗糖或10％(w/v)海藻糖中。由这些溶液，通过添加各自成分而制备含有10％(w/v)蔗糖/1％L-赖氨酸、10％(w/v)蔗糖/1％L-赖氨酸/10％(w/v)葡聚糖以及10％(w/v)海藻糖/1％L-赖氨酸的NDV额外样品。如实施例6所述对样品就它们经受除菌过滤的能力进行测试。在10％(w/v)蔗糖、10％(w/v)蔗糖/1％(w/v)L-赖氨酸或10％(w/v)海藻糖中制备的NDV以非常好的回收率除菌滤过。在10％(w/v)海藻糖/1％(w/v)L-赖氨酸中制备的NDV以合理的回收率除菌滤过，而在10％(w/v)蔗糖/1％(w/v)L-赖氨酸/10％(w/v)葡聚糖中制备的NDV除菌滤过效果差(表VIII)。
表VIII针对含有蔗糖/海藻糖/赖氨酸/葡聚糖的NDV的过滤研究小结
实施例10在含有1％L-赖氨酸、1％L-谷氨酸盐或1％L-甘氨酸的10％蔗糖中制备的NDV的除菌过滤如实施例1所述制备NDV样品，并将其透析过滤到10％(w/v)蔗糖中。该物质被分为四份。将L-赖氨酸、L-谷氨酸盐或L-甘氨酸加入到其中三份中的每一份以制备含有10％(w/v)蔗糖和1％(w/v)L-赖氨酸、L-谷氨酸盐或L-甘氨酸的样品。如实施例6所述对这些样品就它们经受除菌过滤的能力进行测试。在10％(w/v)蔗糖或在含有1％L-赖氨酸的10％(w/v)蔗糖中制备的NDV很容易地滤过，而在含有1％(w/v)L-谷氨酸盐或甘氨酸的10％(w/v)蔗糖中制备的NDV有微量滤过(表IX)。
表IX含有蔗糖/赖氨酸/谷氨酸/甘氨酸的NDV的过滤研究小结
实施例1110％蔗糖/赖氨酸中的NDV在不同pH下的稳定性如实施例1所述的方法制备NDV，并且将缓冲液交换成10％(w/v)蔗糖。通过加入调节了pH的蔗糖/赖氨酸缓冲液(不同pH)来制备处于不同pH的NDV/10％蔗糖溶液的测试样品并将其保存在-20℃。通过如实施例1描述的噬斑分析法测试样品稳定性。结果显示NDV/10％蔗糖溶液在pH7.3到pH8.8范围内比较低pH更加稳定。
表X在10％蔗糖(w/v)/1％赖氨酸(w/v)中配制的NDV在-20℃和不同pH下的稳定性
TNTC数目太多以至不能计数实施例12NDV在不同蔗糖浓度下的稳定性如实施例1所述的方法制备NDV，并且将缓冲液交换成10％(w/v)蔗糖。通过加入不同浓度的蔗糖或加入注射用水而制备在蔗糖溶液不同浓度下的NDV的测试样品或并将其保存在-20℃。将各制剂的终滴度调整为大约2E10。通过如实施例1描述的噬斑分析法测试样品稳定性。结果显示在10％～20％(w/v)蔗糖中制备的病毒比在较低浓度的蔗糖中制备的病毒更稳定。
表XI蔗糖浓度对-20℃时NDV稳定性的影响
背景技术：
的引用文献目录1.Protocol“Methods for Long Term Virus Preservation”，E.A.Gould，Molecular Biotechnology，Vol 13，1999，pp 57-66；2.T.Barrett等，“Growth，Purification and Titration of Influenza Viruses”in VirologyA practical Approach，编辑B.W.J.Mahy；Raven PressBooks，1985，Ch.6，pp.119-146；
3.Virology Lab Fax编辑D.R.Harper；Bios Scientific PublishersLimited，1993；4.Lowrence D.Gelb，“Varicella-Zoster Virus”，Virology；编辑B.N.Fields；Raven Press，1985，Ch.28，pp.591-626；5.Stabilizing cold-adapted influenza virus vaccine under various storageconditionsD.A.Yannarell等；Journal of Virological Methods；10215-25，2002；6.Separation of Freezing-and Drying-induced denaturation ofLyophilized Proteins using Stress-Specific Stabilization，Prestrelski等，Archives of Biochemistry and Biophysics，Vol.303，No.2，1993年6月，pp.465-473；7.Trehalose expression confers desiccation tolerance on human cells，N.Guo等，Nature Biotechnology，Vol.18，2000年2月，pp.168-171。
权利要求
1.一种使有包膜病毒在中度低温保存中稳定的方法，该方法包括制备基本上由以下物质组成的水溶液浓度为106PFU/mL～1012PFU/mL的有包膜病毒；和非还原性糖类，其中所述糖类是二糖并以5％(w/v)～50％(w/v)的浓度存在于所述溶液中或是单糖并以2.5％(w/v)～25％(w/v)的浓度存在于所述溶液中；其中所述溶液具有大约250mOs或更高的渗透压；和具有5～10的pH。
2.一种使有包膜病毒在中度低温保存中稳定的方法，该方法包括制备基本上由以下物质组成的水溶液浓度为106PFU/mL～1012PFU/mL的有包膜病毒；非还原性糖类，其中所述糖类是二糖并以5％(w/v)～50％(w/v)的浓度存在于所述溶液中或是单糖并以2.5％(w/v)～25％(w/v)的浓度存在于所述溶液中；和氨基酸，该氨基酸选自浓度为0.1％(w/v)～5％(w/v)的赖氨酸或精氨酸或选自联合浓度为0.1％(w/v)～5％(w/v)的赖氨酸和精氨酸；其中所述溶液具有大约250mOs或更高的渗透压；和具有5～10的pH。
3.一种使有包膜病毒在中度低温保存中稳定的方法，该方法包括制备包含以下物质的水溶液浓度为106PFU/mL～1012PFU/mL的有包膜病毒；和非还原性糖类，其中所述糖类是二糖并以5％(w/v)～50％(w/v)的浓度存在于所述溶液中或是单糖并以2.5％(w/v)～25％(w/v)的浓度存在于所述溶液中；其中所述溶液具有大约250mOs或更高的渗透压；具有5～10的pH；和基本上不包含还原剂或抗氧化剂，和包含少于0.1％(w/v)氯化钠；1％(w/v)葡聚糖；0.5％(w/v)甘露醇；0.1％(w/v)山梨醇；0.01％(w/v)吐温；0.01％(w/v)谷氨酸盐；0.5％(w/v)聚乙二醇；0.1mM氯化钙；0.5％(w/v)磷脂酰胆碱；0.05％(w/v)甘氨酸；和0.01％(w/v)磷酸盐。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述溶液基本上不包含氯化钠、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、吐温、谷氨酸盐、聚乙二醇、氯化钙、磷脂酰胆碱、甘氨酸和磷酸盐。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述溶液进一步包含氨基酸，该氨基酸选自浓度为0.1％(w/v)～5％(w/v)的赖氨酸或精氨酸或选自联合浓度为0.1％(w/v)～5％(w/v)的赖氨酸和精氨酸。
6.如权利要求2或5所述的方法，其中所述赖氨酸和/或精氨酸的浓度为大约1％(w/v)。
7.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述保存温度为-30℃～-10℃。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述保存温度为大约-20℃。
9.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述病毒是副粘病毒。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述病毒是新城疫病毒。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述病毒是新城疫病毒的中等毒力株。
12.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述病毒浓度为1×1010PFU/mL～7×1010PFU/mL。
13.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述二糖浓度为7.5％(w/v)～15％(w/v)。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述二糖浓度为大约10％(w/v)～大约20％(w/v)。
15.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述糖类是蔗糖。
16.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述糖类是海藻糖。
17.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述单糖浓度为4％(w/v)～7％(w/v)。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述单糖浓度为大约5％(w/v)。
19.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述渗透压为大约300mOs。
20.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述pH为7～9。
21.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中所述溶液是无菌的。
22.一种保持有包膜病毒稳定性的方法，该方法包括将权利要求1～3任一项所述的溶液维持在中度低温。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述温度为-30℃～-10℃。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述温度为大约-20℃。
25.如权利要求1或3所述的方法，其中所述有包膜病毒是新城疫病毒，并且所述糖类是浓度为大约10％(w/v)～大约20％(w/v)的蔗糖。
26.如权利要求2或5所述的方法，其中所述有包膜病毒是新城疫病毒，并且所述糖类是浓度为大约10％(w/v)～大约20％(w/v)的蔗糖，且所述氨基酸是浓度为大约1％(w/v)的赖氨酸。
27.一种保持有包膜病毒稳定性的方法，该方法包括将权利要求1～3任一项权利要求所述的溶液保存在中度低温。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述温度为-30℃～-10℃。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述温度为大约-20℃。
30.如权利要求27所述的方法，其中所述溶液在所述温度维持6个月以上。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述溶液在所述温度维持12个月以上。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述溶液在所述温度维持24个月以上。
全文摘要
本发明涉及稳定性和滤过性有包膜病毒制剂，更具体地说，配制了用于在中度低温(例如－20℃)保存的有包膜病毒(例如新城疫病毒(NDV))。该制剂是包含以下物质的水溶液浓度为10
文档编号C12N7/02GK101052714SQ200580037889
公开日2007年10月10日 申请日期2005年11月4日 优先权日2004年11月5日
发明者陈哲芬, 张仲文, 杰弗里·A·米勒 申请人:威尔斯达特生物制剂公司