专利名称：一个水稻锌指蛋白基因及其耐逆性基因工程应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及水稻锌指蛋白基因ZFP207及其耐逆性基因工程应用，属于基因 工程领域，具体地讲涉及植物高盐、低温、干旱胁迫应答的锌指转录因子。
背景技术：
TFIIIA型锌指蛋白广泛地存在于各种植物中，参与植物的生长发育与环境胁 迫应答(黄骥等，2007)。在矮牵牛、拟南芥、小麦、棉花等植物中己经先后克 隆了近40个TFIIIA型锌指蛋白基因，研究结果表明其主要参与了植物在生殖生 长阶段的发育过程，或参与高盐、低温、干旱等非生物胁迫反应。大豆此类锌指 蛋白SC0F-1的研究表明，在拟南芥和烟草中过量表达SC0F-7基因显著增强了 冷诱导蛋白基因的表达，从而提高了植物的耐冷性(Kimetal, 2001)。拟南芥锌 指蛋白基因在转基因植株中的过量表达则提高了耐旱和耐盐性 (Sakamoto et al.,2004)。因此植物TFIIIA型锌指蛋白对于改良植物对非生物胁迫 的抗性具有重要的应用价值。
水稻是重要的粮食作物以及单子叶植物的模式植物，关于水稻TFIIIA型锌指 蛋白基因的功能描述还非常有限(Huang etal., 2007)。本发明从水稻中鉴定了单 子叶植物第1个与高盐、低温和干旱胁迫同时相关的TFIIIA型锌指蛋白基因 ZF尸207，并研究了其与各种胁迫的关系，提出了利用Z尸尸207基因进行植物提高 综合耐逆性的基因工程改良方法。
发明内容
技术问题 本发明的目的在于公开水稻锌指蛋白基因ZFP207及其耐逆性基因 工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，提高植物的综合耐逆性，以进行植 物品种改良。 技术方案
水稻锌指蛋白基因ZFPM7，其序列为SEQIDNO. 1。
水稻锌指蛋白基因的耐逆性基因工程应用，包括
1) 总RNA的提取
选用水稻品种"韭菜青"，待水稻幼苗长至3叶期后，用150mMNaCl进行处理， 12小时后立即取叶片置于液氮中冷冻保存，取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂 解液的1.5mLEP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内，匀浆后移至1.5mLEP管 中，抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定 RNA含量；
2) 水稻锌指蛋白基因ZFPM7的克隆
根据水稻锌指蛋白基因的全长编码序列，设计两端引物
上游引物CCTAATAC AC AC AC AC AAAG 下游引物CTACAAACTTATAACCGCAG
以步骤l)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩 增，PCR程序如下94"C预变性4分钟，94。C变性30s,55。C复性lmin, 72。C延伸 2min， 33个循环后，72°C 10min，将PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后 获得具有完整编码区的水稻锌指蛋白基因ZF尸M7的cDNA序列SEQ ID NO. 1;
3) 植物表达载体的构建
根据水稻锌指蛋白基因的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引 物，并在上游引物上引入BamH I限制性内切酶位点，下游引物序列同步骤2): 上游弓I物GGATCCTTCTACTCCTAATAC AC AC 下游引物CTACAAACTTATAACCGCAG
以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将的cDNA 克隆至中间载体pMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121 。
4) 转基因植株的获得
将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入烟草，对获得的转基因植株进 行PCR, Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价，转基因植株的T2 代和对照植株进行耐逆性分析。
耐盐转基因植株的获得将转基因植株幼苗和对照植株进行400mM NaCl的持续 处理，在盐处理5天后转移到不含有NaCl的湿滤纸上继续生长，处理后表现明显优 于对照组的转基因烟草植株即为获得的耐盐转基因植株(图2);
耐冷性转基因植株的获得将转基因植株和对照植株的幼苗于4t:处理5d后，放 置于25t培养箱中恢复12h，恢复明显优于对照组的植株即为耐冷性增强的转基因植 株(图3);
耐旱性转基因植株的获得将转基因植株和对照植株于300mM甘露醇中处理30 天后生长优于对照组的植株即为耐旱性增强的转基因植株(图4)。 有益效果
1、 本发明公开了一种水稻TFIIIA型锌指蛋白基因(ZF尸207基因)及其所编码的蛋白 质。该基因来自水稻(0o;za^^'vaL.)，可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐 性、耐冷性和耐旱性，以进行植物品种改良，所编码的蛋白质具有耐逆功能。
2、 本发明人提供的ZF户207基因功能是参与植物的高盐、低温和干旱胁迫应答反应， 定量反转录聚合酶链式反应(Real-time RT-PCR)分析表明ZF尸M7基因在高盐 (150mMNaCl)、低温(4'C)和模拟干旱(20%PEG6000)诱导条件下表达增强。
3、 本发明的ZFi^07基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子， 其基因工程受体植物除了双子叶植物，如烟草、大豆、棉花等之外更加适合于水稻、 玉米、小麦等单子叶植物。
4、利用本发明ZFi^07基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动 子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表 达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细 胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如0 -葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用 无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方 法可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
图l、 ZFP207的亚细胞定位。
(a)(b) pBI-GFP(对照)在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。(c)(d) pBI-ZFP207-GFP在洋葱表皮细胞中的 瞬时表达。(a)(c)在激光共聚焦显微镜下的观察；(b)(d)在可见光下的观察。通过激光共聚焦显微 镜的观察，发现ZFP207-GFP嵌合基因产物定位于细胞核内(白色箭头处)(c)(d)，表明水稻ZFP207 为定位于细胞核内的转录因子。 图2、耐盐性增强的转基因植株。
Z^P207转基因烟草和对照烟草植株于含有400mM NaCl的滤纸上处理5天后，转移到不含NaCl 的滤纸上恢复3天。(a)(b)为处理之后的转基因烟草；(c)为处理之后的对照非转基因烟草。 图3、耐冷性增强的转基因植株。
ZF尸207转基因烟草和对照烟草植株于4'C光照培养箱中处理5天后，转移到25'C恢复12h。 (a)(b) 为处理之后的转基因烟草；(c)为处理之后的对照非转基因烟草。 图4、耐旱性(甘露醇模拟干旱胁迫)增强的转基因植株。
ZF尸207转基因烟草和对照烟草植株于300mM甘露醇模拟干旱胁迫中处理30天。(a)(b)为处理之
后的转基因烟草；(c)为处理之后的对照非转基因烟草。
具体实施例方式
实施例l
选用水稻品种"韭菜青"(太湖流域粳稻地方品种，为强耐盐品种)，待水稻幼苗 长至3叶期后，用150mM NaCl进行处理，12小时后立即取叶片置于液氮中冷冻保 存。取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移 入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents, Invitrogen, USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。 以获得的总RNA为模板，按照美国Promega公司提供的反转录试剂盒的说明书进行 反转录，合成cDNA第一链。以植物TFIIIA型锌指蛋白的保守结构为探针序列(Probe sequence)搜索位于GenBank的水稻基因组数据库，经过EST比较和序列拼接得到一 个全长605bp的水稻TFIIIA型锌指蛋白基因的序列，根据此序列分别设计两端引物 CCTAATACACACACACAAAG， CTACAAACTTATAACCGCAG，采用RT-PCR方法 进行cDNA克隆，PCR反应程序为94。C预变性4分钟，94'C变性30s, 55'C复性lmin，72。C延伸2min， 33个循环后，72°C 10min，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，测 序后获得具有完整编码区的水稻锌指蛋白基因ZF尸207的cDNA序列SEQ ID NO. 1 。 ZF尸207全长605bp，其开放阅读框位于31-597处。DNAssist软件分析表明ZFi5207 共编码188个氨基酸，其中含有1个典型的Cys2/His2型锌指结构，Cys-Xaa-Cys和 His-Xaaa-His区之间由12个主要为酸性或疏水性氨基酸组成的区段隔开，配位结构加 上Phe和Leu所形成的疏水核心，确定了锌指的基本机构和形状。ZFP207的锌指结 构包含植物特有的QALGGH保守结构。使用BioXM软件(版本2.6)估算其等电点 pl=10.28，分子量MW=20.7KDa。以ZF尸M7搜索GenBank中现有水稻基因组(包括 粳稻和籼稻)数据库，发现ZF尸M7为单拷贝基因。BLAST的结果及3D-PSSM数据 库分析结果证明从水稻中新得到的基因确为一个编码TFIIIA型锌指蛋白基因。 实施例2
用实例1中设计的ZFP207两端引物进行实时定量RT-PCR分析ZF尸2O7基因在 水稻幼苗中的表达，以水稻actin基因7 ad (McElroy et a1,1990)的表达为内参，结 果表明，的表达在150mMNaCl处理下2h显著增强，24h时表达达最高，其 表达量约为对照的6倍；在低温(4°C)胁迫下，ZFP207的表达在0.5h处理后即表 达量增加，6h时表达量达到最高，随后表达量逐渐下降，但直到处理24h时ZFP207 的表达量仍然高于对照；在模拟干旱(20%PEG6000)处理下，的表达直到 处理12h时显著增加，表达量约为对照的10倍，处理24h时表达量达到对照13倍。 本发明的水稻锌指蛋白基因ZFP207为水稻中的首次报道，同时也是单子叶植物中首 次发现的同时与高盐、低温和干旱胁迫相关的TFIIIA型锌指蛋白基因，有望应用于 植物尤其是单子叶植物的综合抗逆性遗传改良。 实施例3
根据实施例1得到的ZF尸2( 7的全长序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物， 并在下游引物引入BamH I限制性内切酶位点，上游引物 CCTAATACACACACACAAAG， 下游 引物
GATGGATCCTTAACCGCAGGCTCAAG。
以实施例1得到的扩增产物为模板， 经PCR扩增后，将ZF尸207的cDNA克隆至中间载体pMD18-T ，进一步克隆到修
改后的双元表达载体pBi121 (将其中的e-葡糖醛酸糖苷酶报告基因替换成绿色荧光
蛋白报告基因)，构建包含ZF尸207-Gi^嵌合基因的质粒载体pBI-ZFP207-GFP。将 pBI-ZFP207-GFP质粒转化农杆菌后进一步在洋葱表皮细胞中瞬时表达，通过激光共 聚焦显微镜的观察，发现ZFP207-GFP嵌合基因产物定位于细胞核内，表明水稻 ZFP207为定位于细胞核内的转录因子(图l)。 实施例4
将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入烟草，对获得的转基因植株进 行PCR, Southern杂交以及RT-PCR验证后对转基因植株的T2代和对照植株进行耐逆
性分析。
耐盐转基因植株的获得将转基因植株幼苗和对照植株进行400mMNaCl的持续 处理，在盐处理5天后转移到不含有NaCl的湿滤纸上继续生长，处理后表现明显优 于对照组的转基因烟草植株即为获得的耐盐转基因烟草(图2);
耐冷性转基因植株的获得将转基因植株和对照植株的幼苗于4t:处理5d后，放 置于25'C培养箱中恢复12h，恢复明显优于对照组的植株即为耐冷性增强的转基因植 株(图3);
耐旱性转基因植株的获得将转基因植株和对照植株于300mM甘露醇(模拟干旱) 中处理30天后生长优于对照组的植株即为耐旱性增强的转基因植株(图4)。
上述实施例表明本发明中克隆的水稻锌指蛋白基因ZF尸207,为水稻中首次克隆 的同时与高盐、低温和干旱相关的水稻TFIIIA型锌指蛋白基因。实施例2表明该基 因与植物的高盐、低温和干旱胁迫密切相关。实施例4表明该基因与过量表达后能够 提高转基因植株的耐盐、耐冷和耐旱性，具有提高植物综合耐逆性的功能。此类基因 由于来源于单子叶植物，具有单子叶植物优化的密码子，除了适合烟草等双子叶植物， 也适合于水稻、玉米、小麦等单子叶作物的抗逆性遗传改良。
本发明涉及的序列及记号分列如下 (l)SEQIDNO. 1的信息
(1) 序列特征
(A) 长度605bp
(B) 类型核苷酸
(C) 链性单链
(D) 拓扑结构线性
(ii) 分子类型核苷酸
(iii) 序列描述SEQIDNO. 1
(2) SEQ ID NO. 2的信息
(i)序列特征
(A) 长度188a.a
(B) 类型氨基酸
(C) 链性单链
(D) 拓扑结构线性 (ii)分子类型蛋白质
(iii)序列描述SEQIDN0.2
<110>南京农业大学
<120>一个水稻锌指蛋白
<130〉麵
<140>000
<141>2007-U-09
<160>2
<170〉Patentln version 3.1
<210>S即DNO. 1
<2U>605
<212>DNA
<213>水稻(Oryza sativa)
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<222>(31)..(597)
<223〉
<220>
<221>mRNA
<222>") .(605)
<223>
<400>1
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<210>SE(3 ID NO. 22 <211> 188
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<213> 水稻(Oryza sativa) <糊> 2
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35 40 45
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50 55 60
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His Lys Arg Glu Arg Cys Ala Pro Arg Lys Ser His Gly Phe Gin Gin
85 90 95
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His His Met Arg Val Asn Pro His Ala Thr lie Leu Lys Val Asn Arg
115 120 125
Gly Tyr Ser Ser Ala Asp Gly Val Val Val Ala Lys Phe His Gly Gly
130 135 140
Gin Met Ser Ser Ser Trp Val Pro Phe Ala Val Glu His Gly Arg Gly 145 150 155 160
Ser Val Trp Pro Gly Ser Phe Lys Ala Ser Ser Gin Glu Gin Lys Lys
165 170 175
Arg Thr Glu Glu Asp Leu Asp Leu Ser Leu Arg Leu 180 18权利要求
1、水稻锌指蛋白基因ZFP207，其序列为SEQ ID NO.1。
2、 权利要求1所述水稻锌指蛋白基因Z7^M7的耐逆性基因工程应用，包括1) 总RNA的提取选用水稻品种"韭菜青"，待水稻幼苗长至3叶期后，用150mMNaCI进行处理，12小时后 立即取叶片置于液氮中冷冻保存，取部分叶片，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mLEP管， 充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内，匀浆后移至1.5mLEP管中，抽提总RNA，用甲醛变性胶 电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量；2) 水稻锌指蛋白基因ZFP207的克隆 根据水稻锌指蛋白基因的全长序列，设计两端引物 上游引物CCTAATACACACACACAAAG下游引物CTACAAACTTATAACCGCAG以步骤l)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR程 序如下94。C预变性4分钟，94-C变性30s，55'C复性lmin， 72'C延伸2min, 33个循环后，72°C 10min，将PCR产物进行克隆至pMD18-T载体，测序后获得具有完整编码区的水稻锌指蛋白基 因Z尸尸207的cDNA序列SEQ ID NO. 1;3) 植物表达载体的构建根据水稻锌指蛋白基因ZF尸207的cDNA序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上 游引物上引入BamH I限制性内切酶位点，下游引物序列同步骤2): 上游弓I物GGATCCTTCTACTCCTAATACACAC 下游引物CTACAAACTTATAACCGCAG以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将ZFP207的cDNA克隆至中 间载体pMD18-T，进一步克隆到双元表达载体pBI121;4) 转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体转入农杆菌，进一步转入烟草，对获得的转基因植株进行PCR, Southern杂交以及RT-PCR验证后进行植物的耐逆性评价，转基因植株的T2代和对照植株进行耐 逆性分析。耐盐转基因植株的获得将转基因植株幼苗和对照植株进行400mM NaCl的持续处理，在盐 处理5天后转移到不含有NaCl的湿滤纸上继续生长，处理后表现明显优于对照组的转基因烟草 植株即为获得的耐盐转基因植株；耐冷性转基因植株的获得将转基因植株和对照植株的幼苗于4'C处理5d后，放置于25'C培 养箱中恢复12h，恢复明显优于对照组的植株即为耐冷性增强的转基因植株；耐旱性转基因植株的获得将转基因植株和对照植株于300mM甘露醇中处理30天后生长优 于对照组的植株即为耐旱性增强的转基因植株。
全文摘要
本发明公开了水稻锌指蛋白基因ZFP207及其耐逆性基因工程应用，属于生物技术领域。ZFP207的cDNA序列见SEQ ID NO.1。ZFP207是定位于细胞核内的转录因子，mRNA表达分析表明该基因受脱落酸、高盐、低温和干旱的显著诱导。通过总RNA的提取、水稻锌指蛋白基因ZFP207的克隆、植物表达载体的构建以及转基因烟草植株的T2代和对照植株进行耐逆性分析分别获得耐逆性转基因烟草植株。转基因实验证明该基因的超量表达提高了转基因烟草的耐盐性、耐冷性和耐旱性。ZFP207可作为目的基因导入植物，提高转基因植物的综合耐逆性。
文档编号C12N15/29GK101182520SQ20071013526
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月14日 优先权日2007年11月14日
发明者张红生, 燕 江, 王州飞, 王建飞, 鲍永美, 骥 黄 申请人:南京农业大学