专利名称：一种可以提高植物基因表达活性的串联重复序列的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物串联重复序列领域，特别是关于一种可提高基因表达活性的锌指转录因子At5gl5840基因上的一段串联重复序列，以及该串联重复序列在植物转基因开发上的用途。
背景技术：
串联重复序列是由几个核苷酸组成的一段DNA片段，它普遍存在并随机分布于原核和真核生物基因组中，其重复次数具有高度的变异性。串联重复序列通常具有以下特征 I.在基因组中非随机分布；2.广泛存在基因组中，且串联重复序列的含量与基因组大小没有相关性；3.串联重复序列可以存在于非翻译区(UTR)、外显子、内含子或基因间隔区；
4.串联重复序列高度变异并呈现多态性，因此被广泛应用于遗传标记；5.串联重复序列在不同的分类群及同一分类群的不同地域表现不同。串联重复序列参与了许多生物学过程，在分子进化中具有重要的生物学意义。首先，串联重复序列可以影响染色体组织小麦(Triticum aestium) 4A染色体GWM601基因座位置存在(CT) 17的串联重复序列，该序列与4A染色体的组织有关(Heredity 2002,89 127-132)。果蝇Idefix和Gypsy重复元件参与染色体的高级组织及基因调节,而SINE元件可以通过Looping特异的启动子激活基因的表达(Mol Cell 2008，29 :154_156 ；Cell2008, 134 14-16);第二，串联重复序列还能改变DNA结构、影响着丝粒与端粒的功能在许多物种中，染色体的着丝粒区域通常包含大量的串联重复序列，如人类着丝粒重复(AATGG)n能够形成双链折叠的发夹DNA结构，进而影响着丝粒的组织(Genetica 1999，106 15-36)。 而端粒重复对维持端粒的长度、参与核组织等同样也发挥重要作用(Yeast 2009,26 125-138 ；PloS One 2008，3 :e3249);第三，串联重复序列影响遗传重组研究表明，许多串联重复序列是遗传重组的热点，并且不同的重复单元及重复数量均能影响遗传重组的效率；第四，串联重复序列还参与了 DNA复制与细胞循环在小鼠细胞中，包含有(GA)27的特异片段可以阻止DNA复制的发生。同样，串联重复序列也可影响控制细胞循环的酶，例如，一些调控细胞循环的基因(CHKI, hMSH3, hMSH6, BAX, IGFIIR, TGFbetaIIR, E2F4 h 和 BRCA2)中均包含短的串联重复序列，它们在细胞保真度维持及生长控制中发挥重要作用。 一旦该串联重复序列发生突变(重复单元的插入或缺失)，均能影响这些基因的表达活性， 从而使细胞循环发生紊乱，最终导致癌变等(In J Oncol 2000，16 :133-139);第五，串联重复序列还影响翻译研究表明，大肠杆菌(E.coli)和枯草杆菌(B.subtilis)的一些基因(infB, aceF/pdhC, eno, rpll，OMPa，OMF和tolA)中AGCT串联重复序列可以引起翻译移码(Electrophoresis 1998,19:515-527);最后,许多串联重复序列可以结合各种调节蛋白例如，FMRl基因上的CGG串联重复可以被一些特异性蛋白如CGGBP蛋白(J Biol Chem 1997,272:16761-16768) ;Pur 蛋白(Nucleic Acids Res2000, 28 :3197_3205)和 Egr 转录因子(Proc Natl AcadSci USA 1989,86:8737-8741)等结合，从而影响基因活性。研究发现，一些人类遗传性疾病也与串联重复序列有关。1991年，人们首次在FMRl (智力缺陷I)基因和雄性激素受体基因中分别发现(CGG)n和(CAG)n三核苷酸重复与人类遗传疾病有关(Cell 1991,67 1047-1058 ；Nature 1991,352:77-79)。这些重复性扩增可形成不同的突变体，并且突变率与重复长度有关。这些大量的重复在生物学上并不是中性的，而是参与了许多疾病的发生如CGG串联重复次数为55-200的FMRl等位基因通常导致退化性神经疾病(Ment Retard Dev Disabil Res Rev 2004，10 :25_30)和卵巢不育(Semin Reprod Med2000，18 :59_66 ;Am J Med Genet 2000，97 :189_194)。而 CGG 串联重复次数大于200次的FMRl等位基因通常与智力障碍和孤独症有关(J Dev Behav Pediatr 2006,27:63-74)。CAG在编码区串联重复可以使蛋白质产生多谷氨酰胺(polyQ) 现象，研究表明PolyQ可以使蛋白质构象发生改变，进而引起毒性，如一些线粒体功能紊乱、兴奋性中毒及细胞内运输中断等均与polyQ蛋白的表达有关(Annu Rev Neurosci2007, 30 :575-621)。当然，串联重复序列引起疾病的现象也可发生在基因的其它区域，如渐进性肌肉癫痫(EPMl)是由胱抑素B基因启动子上20个串联重复引起的(Nature 1997,386 847-851);而肌强直性营养不良(DMl)是由于DMPK基因3’ -UTR区增加的CTG串联重复引起的(Curr Opin Neurol 2007,20:572-576)。另外，人类DXZ4串联重复序列控制着X染色体的非活性化，进而引起一些肌肉萎缩症(Neuromuscul Disord 2009,19:17-20)。不仅如此，农业生产中一些重要的生物经济指标往往也与串联重复序列相关如荷兰奶牛的产奶量由甘油三酸酯合成酶基因启动子上18个碱基重复的数量决定 (Genetics 2004,167 :1873_1881)。可见，串联重复序列中重复长度的改变可以影响功能的变化，在进化过程中这可能是一种对外界环境的适应。然而，在植物方面，串联重复序列方面的研究仅处于起步阶段。当前，尽管人们在植物中也发现了一些串联重复序列，但其功能方面的研究还没有像动物中那样深入。不过，近期几篇植物方面关于串联重复序列影响基因功能的报告引起了人们广泛的关注如 2009年Sureshkumar等在Science上发表的文章报道拟南芥IILl (At4gl3430)基因内含子中TTC串联重复序列扩增可显著影响该基因的表达，进而影响植株的生长(Science 2009，323 1060-1063)。基于理论研究和生产实践的需要，本发明人鉴定了一种可提高基因表达活性的串联重复序列，它可用于植物基因工程的产业化开发和应用中。
发明内容
本发明目的在于提供拟南芥锌指转录因子At5gl5840基因上的一段串联重复序列，以及该序列在植物基因工程中用于增强目的基因表达的用途，为后续开发高效表达转
基因产品奠定基础。本发明从拟南芥中克隆了锌指转录因子At5gl5840基因启动子区(SEQ ID NO. 7) 的一段串联重复序列(TTTacac)5，并研究了该串联重复序列增强β-D-葡糖醛酸酶(CTS) 基因的表达。该串联重复序列位于At5gl5840基因翻译起始位点ATG上游-230至-195处， 当把该串联重复序列(TTTACAC)5删除时，该启动子的活性急剧降低。可见这段串联重复序列(TTTACAC)5具有增强报告基因⑶S表达活性的作用。本发明提供所述的At5gl5840基因的一段串联重复序列(TTTACAC) 5在转基因植物中提高目的基因表达的用途。所述的植物优选为拟南芥或烟草。所述的目的基因优选为⑶S基因。本发明的串联重复序列来源于拟南芥的基因，通过验证能增强外源⑶S基因的表达。已有若干串联重复序列调控基因表达的报道，如EGFR基因第一个内含子中(CA)n串联重复序列可以影响转录活性(Int J Biol Markers 2000,15:105-110);拟南芥AtHKTl 基因启动子区的串联重复序列对该基因表达起增强作用，这对维持植物的耐盐性至关重要 (Plant Cell Physiol 2011,52:149-161)。因此，本发明的串联重复序列同样也可以调控目的基因的表达。
图I为ZfP启动子片段克隆电泳图，M(分子量标准物)DL2000 ；图2为ZfPl启动子片段克隆电泳图，M(分子量标准物)DL2000 ；图3为zfP2启动子片段克隆电泳图，M(分子量标准物)DL2000 ；图4为构建的启动子表达载体(zfP: :GUS和zfPA :GUS)结构示意图。图5为含表达载体的农杆菌浸染烟草叶片瞬时表达后组织化学染色。图6为荧光光度测定法定量表达载体的相对活性。图7为zfP: AUS转基因拟南芥植株⑶S组织化学染色图。图8为ZfP Λ : AUS转基因拟南芥植株⑶S组织化学染色图。
具体实施例方式实施例I :全长启动子和缺失启动子的构建以拟南芥(Arabidopsisthaliana, Columbia ecotype)叶片为材料，用 CTAB 法 (EMBO J 1987，6 :3901-3907)提取植物总DNA。以植物总DNA为模板，通过特异引物扩增锌指转录因子At5gl5840基因的启动子片段。合成引物Zl (5’-AAGCTTGATCTTAGAAACATGTC CT-3，，SEQ ID NO. 1，引入了 HindIII 位点)、Z2(5，-GGATCCTCTTGCAGCTAGTTGA-3，，SEQ ID NO. 2，引入了 BamHI 位点)、Z3 (5，-GTCGACATCTCCTCCTATGCA-3，，SEQ ID NO. 3，引入了 Sail 位点)，Z4(5，-GTCGACATAGGCCTTCCCAAAAGCT-3，，SEQ ID NO. 4，引入了 Sail 位点)。其中引物Z1/Z2扩增出1091bp全长启动子片段(命名为zfP)，如图I ;引物Z1/Z3扩增的866bp 片段(命名为zfPl)，如图2 ;引物Z2/Z4扩增的190bp片段(命名为zfP2)，如图3。PCR产物ZfP直接与pGEM-T克隆载体连接，转化DH5a大肠杆菌感受态菌株，筛选阳性克隆(内含有全长启动子片段zfP)。PCR产物zfPl与pGEM-T克隆载体连接，筛选阳性克隆后用SalI 和BamHI双酶切，取大片段，再与经SalI和BamHI双酶切的zfP2连接，转化DH5 α大肠杆菌感受态菌株，PCR方法鉴定阳性克隆(内含有缺失启动子片段ZfP Λ )。实施例2 =GUS融合表达载体的构建用限制性酶HindIII和BanHI分别双酶切实施例I中的两种阳性克隆及双元表达载体ρΒΙ121 (可从北京天恩泽基因科技有限公司购买)，将酶切后的全长启动子及缺失启动子片段分别与ΡΒΙ121酶切片段连接，构建启动子表达载体(zfP::⑶S和ZfPA ::⑶S) (图4)，分别把它们转化到DH5ci大肠杆菌感受态菌株中，进行扩繁。实施例3 :农杆菌转化将构建好的表达载体(zfP::⑶S和ZfPA ::⑶S)转入农杆菌宿主细胞EHA105 (可从国家微生物资源库WWW. matrs. com获得，产品ID为20110114049)中。具体方法如下 构建的表达载体(zfP: :GUS和zfPA GUS)大肠杆菌菌株接种到IOml含Km (50 μ g/ml) LB 液体培养基中，37°C过夜培养后，提质粒，为后续转化农杆菌备用。EHA105农杆菌菌株接种 5ml含Sm(50 μ g/ml) YEP液体培养基中，28 °C下200rpm培养48小时。离心收集菌体，用
O.IM冰冻CaCl2重悬，冰上放置20分钟后，4°C下5000rpm离心2分钟，收集的菌体用200 μ I
0.IM冰冻CaCl2悬浮。然后加入制备好的表达载体质粒(zfP::⑶S和zfPA ::⑶S)，冰上放置20分钟，_70°C放置10分钟，37°C放置5分钟后加入800 μ I不含抗生素的YEP液体培养基，28°C培养4小时后，离心收集菌体，用玻璃涂棒涂布与含有Km(50 μ g/ml)和Sm(50 μ g/ ml)的YEP固体培养基平板上，28°C培养2天。用特异性引物对菌落进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。实施例4:瞬时表达将含表达载体(zfP::⑶S和ZfP Λ : : OTS)的农杆菌菌株(实施例3中已构建)接种于含Km(50 μ g/ml)和Sm(50 μ g/ml)的YEP培养基中，培养至对数生长期,离心收集菌体，重悬于MMA溶液(IOmM MES、100 μ M乙酰丁香酮、IOmMMgCl2)，并调整菌液浓度至OD6tltl =
1.2，28°C静置2小时。取2月龄的烟草中部未完全展开叶片，背面朝上放置于MS固体培养基上。将200 μ I农杆菌浸润液滴在烟草叶片上，25°C人工气候箱内培养。72小时后取样进行⑶S组织化学染色和荧光活性测定。实施例5 =GUS活性检测组织化学染色将实施例4中的叶片取出，用吸水纸吸干后置于含有ImMX-Gluc染色液中，37°C温育5小时，样品经75%乙醇脱水后观察照相。如图5。荧光光度测定法将实施例4中的叶片取出，用吸水纸吸干，用手术刀取叶片浸染部位，经液氮研磨，加入3倍体积的⑶S提取液(50mMNa3P04 ；IOmM^-巯基乙醇；0. I % Triton X-100 ; I % Sarcosyl),离心后取上清,加入ImM MUG (4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸)反应，荧光光度仪测定GUS活性，如图6。含有串联重复序列的全长启动子zfP具有高的表达活性，而串联重复序列突变的启动子ZfPA活性却急剧降低。实施例6 :拟南芥转化及鉴定取含表达载体(zfP: AUS和ZfPA ::⑶S)的农杆菌(实施例3中已构建)菌液 20 μ 1，加入5ml YEP，28°C恒温振摇过夜，将此5ml菌液倒入250ml含Km(50 μ g/ml)和 Sm(50 μ g/ml)的YEP液体培养基中，28°C恒温振摇过夜，农杆菌的浓度应达到0D600 = 1.8 时，4000rpm离心15分钟，弃去上清，加入浸润培养基(1/2MS+5 %蔗糖)，重悬后，加入表面活性剂Silwet-L77，使其终浓度达到O. 02%。将拟南芥植株的花序浸没在菌液中，浸润持续2min，用保鲜膜覆盖过夜后揭膜。正常生长，收取种子。种子晾干后先用70%乙醇消毒10分钟,再用10次氯酸钠消毒5分钟,最后用灭菌水冲洗5编。将灭菌好的拟南芥种子点在MS固体培养基(含30 μ g/ml Km抗生素)上，25°C人工气候箱内培养，光照16小时/黑暗8小时，2-3周后叶片发绿且根伸长的即为疑似转基因植株。对这些植株提基因组DNA，用⑶S特异引物(上游引物5’ -GATGTCACGCCGTATGT-3’，SEQ ID NO. 5和下游引物 5’-CACACTCTGTCTGGCT-3’，SEQ ID NO. 6) PCR扩增进行进一步验证。转基因植株的组织化学染色参照实施例5进行，结果见图7、图8。由此可见，含有串联重复序列的全长启动子zfP 的转基因植株表达较高的GUS活性，而串联重复序列突变的启动子ZfPA几乎检测不到表达的⑶S活性。
权利要求
1.拟南芥thaliana)锌指转录因子基因启动子上一段5个串联重复的TTTACAC序列在转基因植物中提_目的基因表达中的用途。
2.根据权利要求I所述的用途，其中所述的植物为拟南芥或烟草。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的目的基因为β-D-葡糖醛酸酶(GUS)基因。
全文摘要
本发明涉及一种可以提高植物基因表达活性的串联重复序列，即拟南芥一锌指转录因子At5g15840基因启动子上的一段5个串联重复的TTTACAC序列在转基因植物中提高目的基因表达中的用途。当把该串联重复删除时，该启动子活性急剧下降。因此，该串联重复序列具有增强基因表达的特性，应用本发明的串联重复序列进行植物的转基因开发，可以提高目标基因的表达，具有重要的经济效益和社会效益。
文档编号A01H5/00GK102604955SQ20121008773
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者曹军 申请人:江苏大学