猪microRNA-378种子序列的多态性及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪microRNA-378的种子序列，本发明鉴定出了猪microRNA-378种子序列中第五位A-G的突变。本发明还通过关联分析明确了microRNA-378种子序列A-G突变对猪背膘厚度产生影响的遗传效应。
【专利说明】猪microRNA-378种子序列的多态性及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及猪miciORNA-378种子序列的多态性及应用。
【背景技术】
[0002]miRNAs是一类长度为19_22nt的短片段非编码RNAs，参与基因的转录后调控。miRNA介导的基因转录降解及基因沉默是生物性状表观遗传调控的重要方式。miRNAs通过与mRNA的特异性位点互补配对抑制转录，从而引起靶基因的剪切，脱腺苷化和降解。miRNA的第二至八位核苷酸为miRNA识别靶基因位点的关键序列，被称为种子序列，种子序列中的任一氨基酸的改变，都会显著影响该miRNA的功能。近年来，越来越多的报道表明miRNA及其识别位点的序列图突变对农业动物经济性状有重要影响。
[0003]miciORNA-378是一个与脂肪生成、肌肉生长和性激素分泌密切相关的表观遗传调控因子，敲掉microRNA-378的小鼠会出现脂肪沉积的大幅降低。目前尚无猪成熟miRNA的遗传变异对表型性状影响的相关报道，猪microRNA-378中的遗传变异也未见报道。由于猪基因组注释程度较差，位于miRNA中的突变往往被注释基因间和内含子中的调控性突变，其突变效应及表型相关均较模糊，无法用于标记辅助选择的育种实践。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一个与猪脂肪沉积表型相关的miCToRNA种子序列多态性位点及其基因型检测方法。
`[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0006]本发明利用克隆测序的方法在12号染色体上的microRNA-378种子序列的第五位鉴定出一个A-G的突变。野生型microRNA-378成熟体的序列为ACTGGACTTGGAGTCAGAAGGC，突变型序列为ACTGGGCTTGGAGTCAGAAGGC，突变发生在种子序列的第五位，直接导致microRNA种子序列识别的改变，从而影响整个microRNA-378参与的基因调控网络。
[0007]本发明利用microRNA-378种子序列多态性与表型的相关性分析鉴定了该突变对猪背膘厚度性状的遗传效应，提供了一个可以用于种猪选育的分子标记。
[0008]本发明还提供了一套利用猪的血液、组织样品鉴定出猪microRNA-378种子序列第五位基因型检测方法。
[0009]上述基因型检测方法包括以下步骤:
[0010]I)基因组DNA的提取；
[0011]2) microRNA-378 基因的扩增；
[0012]3)纯化扩增产物，用基因序列分析仪以下游引物进行反向测序。
[0013]4)将测序峰图文件比对到基因组参考序列中，根据峰图结果判断该位置基因型，如果为G碱基单峰则基因型为GG型；如果为A/G双峰同时出现则基因型为AG型；如果为A碱基单峰则基因型为AA型。[0014]本发明提供的检测方法，能利用猪的血液、组织样品快速、准确的在猪microRNA-378种子序列的第五位鉴定出一个A-G的突变。这个突变在中国地方猪种及其杂交后代群体中以中等基因频率存在，关联分析表明这个位点的基因型与猪背膘厚性状显著相关，可以作为生长、胴体形状选育的分子标记应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是基因组DNA序列峰图及序列对比图。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例用于对本发明的进一步说明，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0017]实施例1基因组DNA的提取
[0018]用基因组DNA提取试剂从猪血液或者组织中提取猪的基因组DNA，具体操作参见说明书。
[0019]实施例2microRNA_378基因的扩增
[0020]在ensembl 猪基因组数据库(http://www.ensembl.0rg/Sus_scrofa/Info/Index)中获取位于十二号染色体38.39M处的microRNA-378_2基因序列。采用Primer3软件在线设计扩增引物(见下表)，并采用ABI3900基因合成仪合成相应寡核苷酸引物。
[0021]表1 mir-378基因PCR引物序列、产物大小及扩增区域
[0022]
mir-378-2__引物序列_|产物謂区域_
H詞物δ , - TAACCCCTAGGTGGGTCT | 345bp mir-378-2前体编码书
__GAG -3，_
"F游雜5, - TCAGATGAGCAGGACAGT
TCH
[0023]用Takara公司rTaq酶配置如下PCR反应体系配置:10 X PCR buffer (不含MgC1215mmol)2.5μ I ;MgC12 (15mmol )1.5 μ I ；4 XdNTPs (2.5mM)2.0 μ I ；Primers (IOpmol/μ I each) 0.42 μ I ；Template DNA (25ng/ μ I) 4.0 μ I ；Taq DNA polymerase (5U/ μ I)
0.25 μ I ;加水至 25 μ 1
[0024]随后用PCR仪以如下条件进行PCR反应，预变性94°C 5分钟；随后进入循环--变性94°C 30秒，退火60°C 30秒，延伸72°C 30秒，循环35次；终延伸72°C 7分钟后结束反映。PCR反应产物由1.2%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)检测。取3~4 μ I PCR反应产物，加入
2μ 16Χ IV型凝胶加样缓冲液混合均匀，用点样枪将样品点入凝胶点样孔中，同时在一点样孔中点入Takara公司Marker DL2000,80伏电泳大约30分钟(溴酹兰指示剂电泳到凝胶板的2/3)，即可取下凝胶板在紫外灯下检察。根据Marker，若相应位置附近可见一条明亮的条带，则是扩增产物。
[0025]实例3microRNA_378种子序列第五位基因型的判定
[0026]首先采用上海生工凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。随后采用ABI公司3730基因序列分析仪以下游PCR引物(5’ -TCA GAT GAG CAG GAC AGT TCA G-3’ )进行反向测序。将测序峰图文件比对到基因组参考序列中，根据峰图结果判断该位置基因型，如果为G碱基单峰则基因型为GG型；如果为A/G双峰同时出现则基因型为AG型；如果为A碱基单峰基因型为AA型，具体见图1。
[0027]实例4microRNA_378种子序列多态性与表型的相关性分析
[0028]收集基因分型群体的生长、胴体性状指标并与基因型和个体编号一一对应，建立如下的固定效应模型，采用SAS统计分析软件包的常规线形模型过程(PRO-GLM)进行重复数不等资料的方差分析和多重比较。
[0029]Yijk=U +bi+hj+gk+ei jk
[0030]Yijk:个体胴体肉质性状的观测值；
[0031]μ:胴体及肉质性状的群体均值；
[0032]b1:第i个品种(种群)效应(i的不同数值代表不同的猪种或杂交组合);
[0033]hj:第j个场效应值(j的不同数值代表不同的采样猪场);
[0034]gk:第k个基因型效应(k=l、2、3，分别对应AA、AG、GG基因型)；
[0035]eijk:随机残差效应。
[0036]对三种基因型在群体中的个体数及与背膘厚性状进行相关性分析，见表1.[0037]表2三种基因型在群体中的个体数及与背膘厚性状之间的关系
【权利要求】
1.猪microRNA-378的种子序列，其特征在于，猪microRNA-378种子序列的第5位为A或G。
2.一种检测权利要求1所述的猪microRNA-378种子序列的多态性的方法，包括以下步骤: 1)基因组DNA的提取； 2)microRNA-378基因的扩增； 3)纯化扩增产物，用基因序列分析仪以下游引物进行反向测序； 4)将测序峰图文件比对到基因组参考序列中，根据峰图结果判断该位置基因型，如果为G碱基单峰则基因型为GG型；如果为A/G双峰同时出现则基因型为AG型；如果为A碱基单峰则基因型为AA型。
3.权利要求1所述的 猪microRNA-378种子序列的多态性在种猪选育上的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103555723SQ201310499928
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】陈磊, 蓝静, 赵久刚, 张亮, 潘红梅, 王可甜, 王金勇 申请人:重庆市畜牧科学院