确定dna中长度多态性的方法和装置的制作方法

专利名称：确定dna中长度多态性的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明的方法和装置涉及用于鉴定病状的遗传鉴定系统。更具体地说，所述方法和装置涉及检测重复单元状况的系统，例如短串联重复单元的数目，用于，例如在法医或亲子鉴定方面鉴定个体，或用于确定病状，例如用于检测克隆肿瘤。
相关申请信息本申请涉及1997年12月5日申请的，题目为“电子生物学装置的方法和设备”，序列号为No.08/986065的申请，它是1995年9月27日申请的，题目为“主动程序化矩阵设备的装置和方法”，序列号为No.08/534454的部分连续申请，它又是1994年9月9日申请的，题目为“自动分子生物学诊断系统”，序列号为No.08/304657的部分连续申请，该申请目前已被授权为美国专利，专利号为5632957(该申请随后转入1997年5月20日申请的，题目为“主动、程序化电子微生物学系统的控制系统”，序列号为No.08/859644的申请)，专利号为5632957的申请是1994年7月7日申请的，题目为“用于分子生物学分析和诊断的电子严紧控制方法”，序列号为No.08/271882的部分连续申请，目前已被接受，其又是1993年11月1日申请的，题目为“分子生物学分析和诊断用主动程序化电子设备”，序列号为No.08/146504的部分连续申请，该申请目前已被授权为美国专利，专利号为5605662(该申请已经连续地转入1996年10月4日申请的，题目为“聚合物的电子合成方法”，序列号为No.08/725976的申请)，序列号为No.08/986065的申请还是1996年9月6日申请的，题目为“电子杂交反应的优化方法和材料”，序列号为No.08/708262的部分连续申请，它们的全部内容引入本文作为参考。
背景技术：
分子生物学包括多种多样的分析核酸和蛋白质的技术。这些技术和方法中的一部分构成了临床诊断分析和试验的基础。这些技术包括核酸杂交分析、限制性酶分析、遗传序列分析、以及核酸和蛋白质的分离和纯化(参见，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，分子克隆试验室手册，第二版，Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。
这些技术中的大多数涉及对大量样品进行为数众多的操作(例如，移液、离心、电泳)。它们通常复杂且耗时，一般需要高度精确。许多技术由于缺乏灵敏度、特异性、或重现性而限制了其应用。例如，这些问题已经限制了核酸杂交分析的一些诊断应用。
很多涉及为遗传性或感染性疾病而进行的DNA杂交分析的完全程序。大体上说，完全程序可以被分成很多步骤和亚步骤。在诊断遗传性疾病的情况下，第一步涉及获得样品(血液或组织)。根据样品的类型，可以进行各种预处理。第二步涉及打碎或溶解细胞，其随后释放粗DNA材料以及其它细胞成分。通常，需要进行几个亚步骤以便除去细胞碎片以及进一步纯化粗DNA。此时对于进一步的加工和分析存在几种任选步骤。一种任选步骤涉及使纯化的样品DNA变性，然后用多种模式(斑点印迹、微珠、微平板等)中的一种直接进行杂交分析。第二种任选步骤，被称为Southern印迹杂交，涉及用限制性酶切DNA，在电泳凝胶上分离DNA片段，印到薄膜滤膜上，然后用特异性DNA探针序列与该印迹杂交。该程序有效地降低了基因组DNA样品的复杂性，因此有助于提高杂交特异性和灵敏度。遗憾的是，该程序费时费力。第三种任选步骤是进行扩增程序，例如聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增或其它方法。这些程序相对于非-目标序列扩增(增加)了目标DNA序列的数目。目标DNA的扩增有助于克服基因组DNA分析中有关的复杂性和灵敏度的问题。在这些样品制备和DNA加工步骤之后，进行真正的杂交反应。最后，将杂交反应转化成分析结果，进行检测和数据分析。
核酸的杂交分析通常涉及用过量探针DNA，在相对大量的复杂非目标核酸中检测非常少量的特异性目标核酸(DNA或RNA)。在样品制备中降低DNA复杂性的亚步骤已经用于帮助检测低拷贝数(即10000-100000)的核酸目标物。通过应用聚合酶链式反应(PCR)和其它方法扩增目标核酸序列，一定程度上克服了DNA复杂性。(参见，M.A.Innis等，PCR方案方法和应用指南，Academic Press，1990，Spargo等，1996，分子和细胞探针，关于SDA扩增)。扩增产生巨大数目的目标核酸序列，其改进了随后的直接探针杂交步骤。
真正的杂交反应代表全过程中最重要和最核心的步骤之一。杂交步骤涉及在目标DNA序列发生杂交的一系列优选条件下，将制备的DNA样品与特异性报告探针接触。可以按照大量模式中的任何一种进行杂交。例如，已经在多种滤膜和固体支持物模式上进行了多样品核酸杂交分析(参见G.A.Beltz等，酶学方法，第100卷，B部分，B.R.Wu，L.Grossman，K.Moldave，编，Academic Press，New York，第19章，266-308页，1985)。一种模式，即所谓的“斑点印迹”杂交，涉及目标DNA非共价贴附于滤膜，之后与放射性同位素标记的探针杂交。“斑点印迹”杂交具有广泛的应用，已经形成多种模式(参见M.L.M.Anderson和B.D.Young，核酸杂交——试验研究，B.D.Hames和S.J.Higgins，编，IRL Press，Washington，D.C.，第4章，73-111页，1985)。已经形成基因组突变的多重分析(D.Nanibhushan和D.Rabin，EPA 0228075，1987年7月8日)以及重叠克隆的检测和基因组图谱的构建(G.A.Evans，US专利号5219726，1993年6月15日)。
已经形成新技术，用于在微-格式化的多重设备或矩阵设备(例如，DNA芯片)上进行多样品核酸杂交分析(参见，M.Barinaga，253，科学，1489页，1991；W.Bains，10，生物/技术，757-758页，1992)。这些方法通常将特定DNA序列附着于固体支持物的非常小的特定区域，例如DNA芯片的微孔。这些杂交模式属于常规“斑点印迹”和“夹层”杂交系统的微规模形式。
微模式杂交可以用于进行“杂交测序”(SBH)(参见M.Barinaga，253，科学，1489页，1991；W.Bains，10，生物/技术，757-758页，1992)。SBH利用所有可能的n-核苷酸低聚物(n-mer)鉴定未知DNA样品中的n-mer，其随后通过算法分析排列，以制备DNA序列(R.Drmanac和R.Crkvenjakov，Yogoslav专利申请#570/87，1987；R.Drmanac等，4，基因组，114，1989；Strezoska等，88，美国国家科学院科学进展，10089，1992；和R.Drmanae和R.B.Crkvenjakov，美国专利5202231，1993年4月13日)。
进行SBH存在两种模式。第一种模式涉及在支持物上形成一种所有可能的n-mer的排列，然后使其与目标序列杂交。第二种模式涉及将目标序列附着于支持物，随后用所有可能的n-mer与其杂交。这两种模式均存在直接探针杂交的基本问题，其它困难涉及多重杂交。
Southern，英联邦专利申请GB8810400，1988；E.M.Southern等，13，基因组1008，1992，建议用第一种模式分析DNA或对其测序。Southern用PCR扩增的基因组DNA鉴定了一种已知的单点突变。Southern还描述了用于SBH的在固体支持物上合成一种低聚核苷酸排列的方法。然而，Southern没有陈述如何实现一种排列上每种低聚核苷酸的优化严紧条件。
同时，Drmanac等，260，科学1649-1652，1993，用第二种模式对几种短(116bp)DNA序列进行测序。目标DNA被附着于薄膜支持物(“斑点印迹”模式)。随后将各滤膜与272标记的10-mer和11-mer低聚核苷酸杂交。使用较宽范围的严紧条件，以便实现各n-mer的特异性杂交；清洗时间从5分钟到整夜不等，温度从0℃-16℃不等。大多数探针需要在16℃下清洗3小时。滤膜必须暴露2-18小时以便探测杂交信号。无论何种样品目标序列，无论减少低聚探针的组数，应用提供的最严紧的条件，总假阳性杂交率均为5％。
有很多检测和分析杂交反应的方法。根据用于标记DNA探针的不同报告基团(荧光团、酶、放射性同位素等)，用荧光法、比色法、或通过射线自显影法进行检测和分析。通过观察和测量发散的射线，例如荧光射线或粒子辐射，可以得到关于杂交反应的信息。甚至当检测方法具有非常高的内在灵敏度时，由于非特异性结合材料存在的背景也难于检测杂交反应。很多其它因素也降低DNA杂交分析的灵敏度和选择性。
基因分析的一种形式是确定基因序列中相对较短的重复序列的性质。短串联重复序列(STR)已经被确定为法医领域和其它领域(亲子试验、肿瘤检测、D.Sidransky、遗传病、动物育种)中的有用工具。事实上，美国联邦调查局已经宣称正在考虑将短串联重复序列用于法医目的。(Bruce Budowle博士，DNA法医学，科学、证据和未来展望(DNA Forensics，Science，Evidence and Future Prospects)，McLean，VA.1997年11月)。
对于鉴定、扩增、检测和应用多态性重复序列曾提出各种建议。例如，Tautz PCT WO90/04040-PCT/EP98/01203，在一篇题目为“DNA区中长度多态性的分析方法”(翻译自德语)的申请中，公开了在简单或隐性简单DNA序列区域中长度多态性的分析方法。Tautz公开了一种方法，其包括如下步骤将至少一对引物对加到待分析的DNA上，其中引物对分子之一基本上互补于简单或隐性简单DNA序列的5′至3′旁侧的互补链，并且其中引物对加到复制起点之间，以至于用两种引物之一进行的引物控制的聚合反应中得到的合成产物可以被利用，变性后，象加入其它引物的矩阵一样，进行引物-控制的聚合反应，然后分离，例如通过通常的凝胶电泳分离产物，然后分析聚合酶链式反应产物。
Baylor医学院的Caskey等也应用DNA成像分析在短串联重复序列中检测多态现象。在Caskey等的美国专利US5364759中，1994年11月15日公开，题目为“用短串联重复序列的多态性对DNA分类以及多态性短串联重复序列的鉴定”，公开了一种方法，包括下述步骤从待测样品中提取DNA，扩增提取到的DNA，鉴定各种不同序列的扩增延伸产物。Caskey需要将各不同序列区别标记。应用电泳进行物理分离。
C.R.Cantor等人最近公开了一种记录短串联DNA重复序列的技术。Yarr，R.等公开了一种方法“短DNA重复长度的原位检测”，基因分析生物分子工程(Genetic AnalysisBiomolecular Engineering)13(1996)113-118，和PCT申请WO96/36731，PCT/US96/06527题目为“核酸的检测方法”。它们公开了含有嵌入单一序列中的串联重复序列的寡核苷酸目标物与一系列含有已知长度串联重复序列的互补探针杂交。单链环结构形成含有错配(该处定义为不同)数目的串联重复序列的加倍体。当串联重复序列的错配(该处定义为相同)数目存在于双倍体上，则不形成环结构。用单链核酸酶消化环结构。差别波长，例如通过各种长度探针的差别比色荧光仪(fluoriflor)鉴定哪里存在错配位点。按照该方法没有表示需要使用电泳分离。
尽管知道重复单元存在多肽现象到目前已经约15年，并且已经知道它们在法医学和遗传测试中应用的希求，然而还没有实现商业可接受的实施。
发明概述提供了分析和确定遗传目标物中重复单元性质的方法和设备。在本发明的一个方法中，遗传目标物中重复单元的性质通过以下步骤确定对排列的多个试验位点进行多个杂交复合分析，其中杂交复合分析包括至少一种含有单一重复性DNA序列的核酸目标物，一种具有第一独特旁侧序列的捕获探针和互补于目标序列的n个重复单元，其中n=0，1，2…，以及含有互补于同样目标序列链的选择序列的报告探针，报告探针的选择序列包括第二独特旁侧序列和m个重复单元，其中m=0，1，2…，但捕获探针加报告探针中重复单元的总数大于0(n+m＞0)。按照该方法，捕获探针的序列在至少两个试验位点上不同。然后监测杂交复合分析，至少部分通过确定杂交稳定性来确定试验位点上杂交复合分析中的一致和不一致。最后，可以基于一致/不一致鉴定，结合定位在该位点的杂交复合物中的探针的知识确定目标序列中重复单元的性质。
作为实施该方法的例子，假定目标物含有六个重复单元。在一个仅为了方便说明而简化的系统中，多重杂交复合分析可能是排列在APEX型生物电子系统上的三个分析，其中第一个分析包括具有四个重复单元(n=4)的捕获探针，第二个分析包括具有五个重复单元(n=5)的捕获探针，第三个检测包括具有六个重复单元(n=6)的捕获探针。如果选择具有一个重复单元(m=1)的报告探针，第一个分析处重复单元的总数将为五(n+m=4+1=5)，第二个分析处，重复单元的总数将等于6(n+m=5+1=6)，第三个分析处重复单元的总数将等于7(n+m=6+1=7)。第二个试验位点将是一致(协调)试验位点，因为在这种情况下，目标物中重复单元的数目等于捕获探针加报告探针中重复单元的数目，那就是说，它就是在目标物中和在捕获探针和报告探针的组合中均具有六个重复单元的试验位点。应用有关探针定位的知识，知道第二试验位点包括具有5个重复单元(n=5)的捕获探针，并且当结合包括一个重复单元的报告探针的知识时，就可确定目标物中存在总共六个重复单元。
在本发明的优选实施方式中，在所述方法中应用电子辅助杂交或一致和不一致确定，或者二者都使用。一方面，当核酸目标物与捕获探针和/或报告探针杂交时，可能使用电子严紧条件，优选与其他影响严紧度的条件一起使用，以辅助杂交。该技术尤其有利于减少或消除重复单元中的滑动杂交，并促进更有效地杂交。另一方面，在杂交复合稳定性确定过程中可能改变电子严紧条件，以便更准确或快捷地确定一致或不一致的状况。
本发明的另一方面，提供了一种确定遗传目标物中重复单元性质的方法，通过提供一种生物电子设备，它包括阵列在一系列试验位点上的一系列探针，探针具有第一独特(单一)旁侧序列，第二独特旁侧序列，和具有可变重复单元数目的插入重复单元系列。目标物与一系列试验位点上的一系列探针在电子严紧杂交条件下杂交，然后确定试验位点的一致/不一致。在优选实施方式中，通过电子杂交稳定性确定的应用，至少部分确定一致/不一致。一致的试验位点表明该探针含有与目标物中重复单元的数目相等的重复单元数目。在一个该实施方式的变化中，仅在一致/不一致确定过程中使用电子严紧控制。
本发明的再一方面，提供了确定在样品中大小改变的目标等位基因的方法和设备。提供了鉴定目标等位基因的平台，其包括选自以下组的探针(ⅰ)具有第一独特旁侧序列的探针、插入重复区和第二独特旁侧序列，和(ⅱ)一种夹层分析法，包括具有第一独特旁侧序列和0，1，2…重复单元的捕获探针，和具有0，1，2…重复单元和连接其后的第二独特旁侧序列的报告探针。之后，目标物与探针杂交，优选在电子严紧条件下，以便以适当的标引辅助，或者换一种方式，在后续步骤中应用电子严紧条件或在杂交过程中和在后续步骤中都应用电子严紧条件，然后至少部分通过确定杂交稳定性，来确定试验位点上的一致和不一致。
在本发明的一个方面上，一致性试验位点的位置代表目标序列重复单元的性质(目标物中存在的重复单元的数目)，它本身基于定位在该试验位点的探针的知识得出。即，根据与特定物理试验位点典型相关的特定探针的序列将了解它们，尤其包括重复单元的数目，这些试验位点的物理位置形成有关目标物性质的一致性位点的认识，尤其是重复单元的数目。通常，在一致的试验位点上，目标物中重复单元的数目等于捕获探针中重复单元的数目和报告探针中重复单元数目的总和。
本发明的一个有利方面是所述方法和设备能够有效地确定目标序列中微小变异体的存在。该微小变异体可以包括一种或多种缺失、插入、转换和/或颠换。它们可能是单一碱基或者是一个以上的碱基。重复单元中的缺失或插入可以通过高度控制条件的凝胶分离方法检测到。这需要分辨单一碱基，并且靠近大多数凝胶分离技术的检测极限。对于转换或颠换突变，等位基因的大小不会改变，甚至当序列被改变时。常规凝胶筛分法非常难于检测这类突变，最近其他研究者(Sean Walsh，Dennis Roeder，DNA法医学科学、证据和未来展望，McLean，VA.Nov.1997)的结果表明转换和颠换突变会导致微细差别，从而给凝胶分析带来困难，有时造成STR分析混乱。我们的方法是一种杂交方法，它十分擅长可靠地检测上述单核苷酸多态性。因此，通过设计具体的捕获和报告寡核苷酸，可以在用于通过重复单元数目分辨STR等位基因性质的同一平台上进行这些分析。设计用于微小变异体分析的捕获寡核苷酸的一般策略与用于完整重复单元的一样，然而，报告寡核苷酸可能与此不同，它们可能含有也可能不含独特旁侧序列。保留通过最大化杂交复合稳定性有效地确定一致的条件，因为仍然使用产生碱基堆积(如上述)的寡核苷酸设计参数。
本发明的另一方面，可以应用各种附加步骤，以促进分辨一致和不一致的试验位点。一致的一种方式可以是这样的，在夹层分析模式中，在包括捕获、报告和目标序列的杂交复合中存在碱基的互补配对。在另一种非常有利的排列中，可以应用报告序列和捕获序列的并列末端核苷酸，其中它们的临近性质允许相互作用，例如碱基堆积。有利的是，可以选择并列末端核苷酸的身份，这是存在的重复单元或相关序列带来的，以便增加一致和不一致之间的能量差异。曾报道不同碱基之间的碱基堆积的稳定性在约4倍的范围内变化(Sanenger，核酸结构原理，1984，Springer-Verlag，New York，NY)。试验结果表明，在我们的系统中分析时，5’G-A3’对5’T-A3’的配对分辩率提高至少10倍，更多时候至少超过20倍。该结果通常与公开的结果，即5’G-A3’碱基堆积比5’T-A3’碱基对存在更高的稳定性，一致，用我们的分析法看到的稳定性差异的增加超过了报道值。本发明利用这种天然条件，提供了一种优越的分析便利，这是十分有利的。在另一个实施方式中，可以修饰末端核苷酸，以增加碱基堆积作用，例如添加丙炔基，甲基或胆固醇基。在另一个相关方面，可以应用连接技术，例如酶联或化学连接，以便增加一致位点和不一致位点之间的能量差异。
可以以多种方式证明不一致，例如存在缺口或重叠的夹层分析模式，或者存在环出序列的的环出法。另外，不一致可以存在于有碱基变异，例如缺失、插入、转换和/或颠换的重复区。
在区别一致和不一致试验位点中，优选部分基于杂交稳定性得出差别。杂交稳定性可以被多种因素影响，包括热调节、化学调节、以及电子严紧度调节，它们单独地或与其它列出的因素组合作用。通过应用电子严紧条件，在目标物杂交步骤和/或报告寡核苷酸严紧步骤中，可以实现该过程的迅速完成。目标物的电子严紧杂交是该方法的一个独特方面，因为它属于双链DNA，且导致目标物对捕获序列的快速准确的杂交。期望实现目标DNA的适当的指标化杂交，以便在具有准确杂交复合的试验位点上获得最大数目的分子。举例说明，应用电子严紧条件，可以在十分钟或更少时间，更优选五分钟或更少时间，最优选一分钟或更少时间内完成最初的杂交步骤。总之，分析过程可以在半个小时内完成。
至于检测杂交复合物，优选该复合物是被标记的。通常，在确定一致和不一致步骤中，需要检测试验位点或其部分上标记杂交复合物的数量。任何与本发明的目的和功能一致的检测方式或形式都可以应用，例如光学成像，电子成像，电荷偶联装置的应用或其它定量方法。可以对目标物、捕获序列或报告序列进行标记。各种标记可以是荧光标记、比色标记或化学发光标记。在另一种实施方式中，可以通过杂交复合物中分子之间的能量转移测定。再一方面，可以通过荧光微扰分析检测。再一方面，可以通过一致和不一致位点之间的传导性差异检测。
本发明的另一方面，可以方便地进行丰余分析。在一种实施方式中，可以应用系列丰余分析，例如在进行最初杂交复合物分析后，增加了严紧度条件，以影响变性，由此从第一杂交复合物分析中除去了报告序列。然后第二报告序列可以与剩余的复合目标物和捕获探针杂交，其中第二报告序列包括大量与第一报告序列中的重复单元数目和类型不同的重复单元。以这种方式，通过实施为其它应用而描述的其它步骤，将除去存在一致的物理试验位点。结果是已经就同样的装置和样品材料进行了丰余分析。
还可以进行另一种丰余分析，其中存在多重，例如两重或多重独立分析系列。第一报告序列与第一套分析物杂交，第二报告序列与第二套分析物杂交，其中第一报告序列中重复单元的数目与第二报告序列中重复单元的数目或性质不同。确定阵列的试验位点上的一致/不一致，结合定位在那些试验位点上的探针的知识，提供了两种来源于杂交分析的的复合物，用于确定目标物重复单元数目或性质。
本发明的系统和方法对于确定复合样品的性质尤其有用，例如杂合样品、和混合样品例如来源于多重来源或供体的样品。在应用中，本发明的方法和系统可以用于更广泛排列的应用。其中包括鉴定，例如亲子试验或其它的法医学应用。还有另外一种应用是疾病诊断，例如鉴定是否存在克隆肿瘤，其中肿瘤包括性质或数目不同于患者的未患病基因状态的重复单元。
因此，本发明的一个目的在于提供快速鉴定多态性系统重复单元性质和/或数目的方法和系统。
本发明的另一个目的在于提供准确检测患病状态，尤其是克隆肿瘤疾病状态、神经学紊乱和遗传疾病的易患病体质的系统和方法。
本发明的再一个目的在于提供了一种用于在，例如法医学和亲子鉴定应用中，进行鉴定的快速有效的系统和方法。
附图简述

图1A是按照本发明方法应用的活动矩阵装置的一个实施方式的断面图。
图1B是应用本发明方法的活动阵列装置的透视图。
图2是包括目标物、报告序列和捕获序列的多重分析系统的各成分示意图。
图3A、3B和3C是包括分别存在缺口、重叠和配对的目标序列、报告序列和捕获序列的多重分析系统的示意简图。
图4A、4B和4C显示相对于图3A、3B和3C的图示代表，分别表明有缺口、重叠和配对的TH01位置的多重分析列出的详细序列。
图5A-5G描述了显示具有八个重复单元的目标物、具有单一重复单元的报告序列和包括分别在图5A-5G中表示的从四到十个重复单元的捕获序列的多重分析物序列的概略图。
图6显示了夹层分析的试验位点排列的计划图，其中有代表存在杂交复合物的如阴影所示的一致试验位点。
图7A-7G显示了包括具有八个碱基重复单元的目标物、具有两个碱基重复单元的报告序列和分别如图7A-7G所示的从四到十个重复单元的一组捕获序列的多重分辨系统的概略图。
图8显示了含有代表存在杂交复合物的如阴影所示的一致试验位点的丰余分析试验位点的排列计划图。
图9A显示了一致条件下目标物和杂交的报告序列的示意图。
图9B显示了不一致条件下，也就是环条件下，目标物和报告序列。
图10A-A0G描述了环开系统中的多重分辨，其中目标物包括七个重复单元，报告序列包括分别在图10A-10G中所示的从五到十一个重复单元的报告序列。
图11是利用夹层杂交法鉴定THO1目标DNA等位基因中，捕获寡重复单元数对荧光(MFI)所作的函数图。
图12是捕获序列中重复单元数目对标准化荧光所作的函数图，其中报告序列包括一个重复单元(左手侧)，还包括表示THO1基因座的丰余报告系统的零重复单元(右手侧)。
图13是表示THO1基因座中被用于捕获序列、报告序列和目标等位基因的特定寡核苷酸的图表。
图14是G-A堆积与T-A堆积相比较，分别对分辨率所作的函数图，其中成对的左图和右图分别表示8×对7×分辨(左侧棒状图)和15×对14×分辨(右侧棒状图)，它们表示G-A堆积和T-A堆积对目标物的分辨率。
图15分别表示芯片1到芯片4四个两联棒的分辨率图，表示应用十聚体报告序列(两联棒中的左棒)和末端具有丙炔基的十聚体报告序列(两联棒中的右棒)的最大分辨率。
图16是杂合TPOX基因座中捕获寡聚物对标准化荧光密度所作的函数图。
图17是TPOX捕获寡核苷酸、报告寡核苷酸和TPOX基因座的目标等位基因的核苷酸序列表。
图18是用于CSF1PON等位基因杂交分辨的捕获重复单元数目对荧光密度(MFI/sec)所作的函数图。
图19是CSF1PO等位基因中捕获寡核苷酸、报告寡核苷酸和目标等位基因的表。
图20是THO1/TPOX多重分析中捕获序列重复单元的数目对标准化密度所作的函数图。
图21是在鉴定双链聚合物链式反应(PCR)扩增的包括目标TH01基因座的DNA中重复单元等位基因的系统中，捕获寡核苷酸中重复单元数目对相对荧光所作的函数图。
图22A、22B和22C分别表示起始信号、变性三分钟后信号、和变性十分钟后信号的含有缺口(三联棒中最左边的棒)、相配(三联棒中的中间棒)或重叠(三联棒中的右棒)的捕获寡核苷酸对荧光(MFI)所作的函数图。
图23是各种组合的相配/缺口和相配/重叠的配对区别图表。
图24是在应用环出分析进行目标DNA的等位基因认证中，用于确定重复单元性质和数目的捕获序列中重复单元的数目对荧光百分率所作的函数图。
图25A、25B和25C分别表示代表缺口、重叠和相配的多重TH01微变异分析的详细序列列表。
图26是用于检测微变异等位基因THO19.3的捕获寡核苷酸的数目或性质对荧光密度(MFI)所作的函数图。
图1A和1B说明应用本发明的活动可编程电子矩阵杂交系统的简单模型。通常，基底10支持电子可设定地址的微位置12的矩阵或排列。为了便于解释，图1A中的各微位置被标记为12A、12B、12C和12D。将渗透层14置于单独的电极12之上。渗透层允许相对较小荷电单元通过，但限制大荷电单元，例如DNA的移动，以避免实验过程中，大荷电单元与电极12轻易地直接接触。渗透层14降低了由于DNA与电极12的直接接触可能发生的电化学降解，部分可能由于极端pH导致的电解反应。进一步用于减小DNA与电极的强烈的、非特异性吸附。将附着区16置于渗透层14之上，其为目标材料提供特异性结合位点。附着区16被标记为16A、16B、16C和16D，以便分别与电极12A-D的标记相对应。
在操作中，储库18包括附着区16以上的空间，其含有需要的和不需要的用于检测、分析或应用的材料。将荷电单元20，例如荷电DNA加入储库18。在本发明的一个方面，活动的、可编程的、矩阵系统包括将荷电材料20运输到任意特定微位置12的方法。活化后，微位置12形成任何荷电功能化特定结合单元20朝向电极12的无区域电泳运输。例如，如果将电极12A设定为阳极，电极12D设定为阴极，电泳力22的路线将贯通电极12A和12D。电泳力22的路线导致具有静负电荷的荷电结合单元20向着阳极12A移动。具有静正电荷的荷电材料20在电泳力作用下向荷负电荷的电极12D移动。当已被功能化的静负电荷结合单元20接触附着层16，导致其在电泳力作用下运动时，功能化的特定结合单元20即与附着层16A共价结合。
在详细探讨本专利的发明以前，首先将论述一般术语。本发明中使用的术语“短串联重复序列”(STR)指含有单一序列模块的基因座，其在该基因座的不同等位基因串联重复不同次数。重复单元通常指在短串联重复序列中重复的个体单一序列模块。重复单元可以是，例如，含有相同重复单一序列模块的完全重复单元，或者可以是部分重复单元，例如重复单元之间存在一些不同，例如在重复单元之间存在的微小变异体。认为一致实验位点是表现杂交复合稳定性的相对或局部最大值的实验位点。作为例子，一致实验位点可以是这样一种实验位点，其中目标物中重复单元的数目等于用于多系统的捕获序列中重复单元的数目加报告探针中重复单元的数目之和，或者其中目标物中重复单元的数目等于探针中重复单元的数目。在一致实验位点的另一个例子中，如果存在部分重复单元，一致实验位点可以表现为这样一种位点，即其中目标物中重复单元基本上类似于捕获序列加探针中重复单元的性质，或单个探针的性质。另一方面，不一致位点是相对于至少一个其它位点表现相对较低水平的杂交复合稳定性的位点。通常被称为不一致实验位点的例子是那些存在缺口、重叠、点突变(例如，单个碱基突变，例如缺失、插入、转换和颠换)、点突变加重叠、点突变加缺口、单核苷酸变异或其它微变异的位点。
多重系统例如夹层分析中的杂交复合分析通常包括目标物、捕获序列和报告序列。环出应用中的杂交复合分析通常至少包括目标物和探针。本发明应用的阵列通常指多实验位点，最少两个以上实验位点。实验位点的通常数目将是基因座的每个等位基因分别一个位点。需要实验的基因座的数目将根据不同应用而异，用于遗传疾病分析通常为一个，用于肿瘤检测为一到五个，用于亲子鉴定和法医为六、八、九、十三或更多。实验位点相对于另一个位点的物理定位可以按照任何方便的形状，可为线状或成排和柱状排列。
图2是多重分析各元件的示意图。目标物30包括包括第一独特旁侧区32，第二独特旁侧区34，以及位于第一独特旁侧区32和第二独特旁侧区34之间的一个或多个重复单元36。目标物30可以是一种来自特定基因座，例如TH01的单链或双链核酸。报告序列40包括至少一种独特序列区42，并任选包括一种或多种位于独特序列区42末端的重复单元44。如果标记报告序列40，标记物46在此结合。通常，报告序列40的独特序列区42与目标物30的第二独特旁侧区34互补。捕获序列50包括一种捕获独特序列区52以及一种或多种位于捕获独特序列区52末端的重复单元54。如果捕获序列50结合到固体支持物或其它固定基质时，可以使用一种结合元件56，例如生物素。
图3A、3B和3C是是包括目标物、报告序列和捕获序列的多重分析系统的概略图，其中分别存在缺口、重叠和匹配。为了简单起见，采用图2中各相应构件的编号。在图3A中，存在缺口状况。总地来说，目标物30与报告序列40和捕获序列50杂交。具体地说，第二独特旁侧区34与报告序列40的包括独特序列区42的互补链杂交。同样，目标物30的第一独特旁侧区32与捕获序列50的互补捕获独特序列区52杂交。在该样品中，目标物30包括八个重复单元。该详细描述的结构同样适用于图3A、3B和3C。图3A描述了一种缺口区56，其来源于具有六个重复单元54的捕获序列50和具有一个重复单元44的报告序列40。因此，报告序列加捕获序列中重复单元44、54的总和是七，该值比目标物30中重复单元36的总数少一。在图3B中，显示了一种重叠状况。其中，捕获序列包括八个重复单元34，报告序列40仍然包括一个重复单元44。其中捕获序列50和报告序列40中重复单元34、44的总数是九，超过了目标物中重复单元36的数目，因此一个重复单元被重叠，此处显示的是与报告序列40结合的重复单元44。图3C显示了一种目标物30与报告序列40加捕获序列50之间相匹配的状况。其中存在七个与捕获序列50结合的重复单元34和一个与报告序列40结合的重复单元44。因此，目标物30中重复单元36的数目等于捕获序列50中重复单元34的数目加报告序列40中重复单元44数目的总和。
图4A、4B和4C显示了一种与图3A、3B和3C的例子相对应的具体核苷酸序列的实例。需要注意的是图3A、3B和3C的从左至右的取向与图4A、4B和4C从左至右的取向相反。图4A显示了一种缺口状况，其中缺口56位于报告序列40的重复单元44和临近捕获序列50的缺口56的末端重复单元(5’CATT3’)之间。在图4A、4B和4C中，目标物30的碱基重复单元36是5’AATG3’，因此，它的互补碱基序列是5’CATT3’44、54。在图4A、4B和4C中，碱基重复单元的核苷酸用大写字母表示。这样做用以将这些单元与构成目标物30的第一独特旁侧区32和第二独特旁侧区34以及报告序列40的独特区序列42和捕获序列50的捕获独特序列区52的核苷酸区别开来。就象看到的那样，杂交链中的核苷酸配对，被称为A-T对和G-C对是互补的。图4B显示了具有一个重复单元重叠的错配。具体地说，含有序列5’CATT3’的碱基重复单元44从与目标物30的第二独特旁侧区34相邻的碱基单元36杂交状况下被转移出来。如所示，报告序列40的独特序列区42的5’末端核苷酸(指定为“c”)显示从与目标序列30的第二独特旁侧区的互补“g”末端核苷酸的完全杂交条件下轻微转移出来。这种描述是任选的，它也可以包括这种状况，即独特序列区42的末端核苷酸处于与目标物30的第二独特旁侧区34的末端核苷酸杂交的条件下。图4C显示了一种匹配状况，在该实例中，重复区的性质，即重复单元部分和整体数目以及序列的互补性相匹配。在图4C的匹配状况下，报告序列40的重复单元44的5’末端核苷酸“C”邻近并与捕获序列50的碱基重复单元54的3’末端核苷酸“T”连续，其使报告序列40的重复单元44的5’“C”和捕获寡核苷酸50的碱基重复单元54的3’“T”之间的碱基堆积成为可能。这两个碱基堆叠的核苷酸在图4C中用下划线表示。在一个优选实施方式中，可以经5’末端含有合适吸附化合物，优选生物素的捕获寡聚物固定杂交复合物。在另一个优选实施方式中，可以经3’末端具有合适分子，优选发色团的报告寡聚物40标记杂交复合物。
本文中重复单元的性质被定义为包括完全(或完整)重复单元的数目和部分重复单元的数目。也被成为微变异体或隐性简单序列的部分重复单元可以包括与最常见重复单元序列的单核苷酸变异。这些变异可以由简单重复序列的插入、缺失、转换或颠换多态现象构成。因为所有分析XTR基因座的现有方法均依赖于核苷酸的大小或数目，因此缺乏有关转换频率和转换重复单元多态性的信息。然而，近来其它研究者已经认识到它们的意义，很可能那些能够有效检测它们的方法将会很有价值(Sean Walsh和Dennis Roeder，DNA法医学—科学、证据和未来展望，McLean，VA.，1997年11月)。
图25证明了本发明如何检测到常见微变异体TH01 9.3的存在。这里提供了两种新的单元含有部分重复单元71 ATG的微变异体目标序列70和互补于71和七个5’相邻核苷酸的微变异体报告寡核苷酸80。图25显示了当目标等位基因的性质为总共九个重复单元其中一个部分重复时，DNA亚序列的关系，形成一种匹配的一致。在前面图4A-4C中论述的元件保留它们的编号，新元件用新编号标记。因此目标序列70由第一独特序列34、完整重复序列36、第二独特旁侧序列32和新的部分重复序列71构成。捕获序列50与图4A中所述的相同，除了它均有三个重复单元54。微变异报告序列80类似于具有重复序列44的报告序列40，但不同之处在于没有独特旁侧序列以及包括互补于目标物70部分重复单元71的序列81。报告序列80的稳定性通过以下两个特征而增强。第一，它仅与微变异区互补，第二，它将会发生碱基堆积，因此仅在含有3ru捕获寡聚物的位点实现一致或局部最大稳定性。本领域技术人员将会认识到如何将本发明应用于不同于TH01 9.3序列的微变异序列。图26证明了该方法的有效性。
有利地进行了邻近或靠近核苷酸的选择，从而增加了一致和不一制实验位点之间的能量差异。下面将进一步描述该选择或修饰的详细论述，例如应用末端核苷酸碱基储备，或末端核苷酸用例如丙炔基、甲基或胆固醇基修饰，或通过应用结合技术例如酶连接或化学连接。
图5A-5G描绘了一种多重系统的概略示意。该系统中使用的杂交复合物有时也被成为夹层分析。同样，为了方便说明，采用的编号对应于图2、图3A、3B和3C以及图4A、4B和4C中所用的那些。在各描述中，目标物30具有一个独特旁侧区32和一个第二独特旁侧区34，以及一组插入其中的重复单元36。在该实例中，重复单元36的编号是8。报告序列40包括一个独特序列区42，其与第二独特旁侧区34互补，该实例中在报告序列末端还包括一个重复单元44。捕获序列50包括一个捕获独特序列区52，在该实例中在捕获序列50末端还包括多个重复单元54。捕获独特序列区52与第一独特旁侧区32互补。
图5A显示了一种具有4个重复单元54的捕获序列50。因为捕获序列50中重复单元54的数目加报告序列40中重复单元44的数目之和(4+1)比目标物30中重复单元36的数目(8)少，因此存在缺口56。如图5A所示，缺口基本上是3个重复单元36、44、54的长度。就术语而论，捕获序列50中重复单元54的数目有时被称为“N捕获物”，其中N等于捕获物50中碱基重复单元54的数目加报告物40中碱基重复单元44的数目。采用该术语，存在一种具有N捕获物的匹配，其中N等于目标物30中重复单元36的数目。因此，在存在匹配状况的图5D的实例中，具有7个重复单元54的捕获物50也可以被称为“8捕获物”，因为具有7个重复单元54的捕获物50当使用用它们选择的具有单一重复单元44的报告序列40时，即提供了一种匹配状况，其中重复单元44、54的总数目等于目标物中重复单元36的数目。本领域技术人员将会理解可以用各种命名或编号协定准确描述下划线的编号，这些下划线编号包括本文中的本发明，不是已采用的命名或编号协定。
图5B显示了具有5个重复单元54的捕获序列50，其中存在长度基本上为2个重复单元36、44、54的缺口56。图5C显示了具有6个重复单元54的捕获序列50，其中存在长度基本上为单一重复单元36、44、56的缺口56。图5D显示了一种匹配状况，其中具有7个重复单元54的捕获序列50和具有单一重复单元44的报告序列40等于目标物30中重复单元36的数目。
图5E、5F和5G显示了一种重叠状况。图5E显示了具有8个重复单元54的捕获序列50。如所述，报告序列40的重复单元44显示基本上处于与目标物30非杂交状况。图5F显示具有9个重复单元54的捕获序列50，其中捕获序列50的末端重复单元58和报告序列的重复单元44分别与目标物30均处于基本上非杂交状况。图5G显示了具有10个重复单元54的捕获序列50，以至捕获序列50的两个末端重复单元58和报告序列40的重复单元44与目标物30处于基本上非杂交关系。
图6显示了多重分析，例如夹层分析中应用的实验位点排列的计划图。一致实验位点被确定为含有7个重复单元的捕获序列的位点。该图描述了一种用1个重复单元的报告序列进行的分析，因此可以确定目标物必须含有8个重复单元，因为在一致位点上，捕获序列中重复单元的数目(7)加报告序列中重复单元的数目(1)等于8。该描述涉及图5，其中显示了用含有一个重复单元的报告序列对含有8个重复单元目标物的DNA样品进行的分析所得到的结果。
图7A至7G是多重系统，例如夹层分析的概略图示，其中报告序列包括两个重复单元。这与图5A-G(其中报告序列包括单一重复单元)的分析有所区别。同样，为了方便说明，前面图的编号在相似情况下将被采用。图7A显示了具有第一独特旁侧区32和第二独特旁侧区34的目标物30。报告序列40包括一个独特序列区42，该实例中还包括两个重复单元44。捕获序列50包括一个捕获独特序列区52和4个重复单元54。同样，从术语上说，捕获序列50可以被称为“5捕获物”，反映了应用的与图5A-5G的分析有关的术语，也就是使用具有单一重复单元44的报告序列40的那些术语。
图7B显示了一种多重系统，其中捕获序列50包括5个碱基单元54。图7A和7B的实例均包括缺口56。
图7C显示了一种匹配状况，其中目标物30中重复单元36的数目等于捕获序列50中重复单元54的数目加报告序列40中重复单元44的数目的总和(6+2=8)。图7C描绘了存在匹配状况的一致实验位点。需要注意的是一致实验位点的有效位置从图5D移到了图7C。这反映了报告序列40中重复单元44数目的改变。使用增加较长捕获序列50的一个序列或一段单元，具有比一个碱基单元44短或长的报告序列40将改变一致实验位点的物理位置，例如在图6中，当从具有一个重复单元44的报告序列改变成为具有两个重复单元44的报告序列40时，实验位点从26D改变成为26C。
图7B-7G显示了一种重叠状况。在图7D中，报告序列40的一个重复单元44与目标物30的重复单元36处于杂交关系。报告序列40的第二重复单元44’与复合物处于错配，即重叠状况。图7E显示了一种重叠状况，其中重复单元60与目标物30处于非杂交条件。图7F和7G也包括错配排列，其包括多重复单元60与目标物30处于非杂交条件的重叠。错配重复单元即可以是来自报告序列30，也可以来自捕获序列50，或者来自二者的组合。
图8显示了多重分析，例如夹层分析中应用的实验位点排列的计划图。一致实验位点被确定为含有6个重复单元的捕获序列的位点。该分析描述了用一种具有2个重复单元的报告序列进行的分析，因此能够确定目标物一定含有8个重复单元，因为在一致位点，捕获序列中重复单元的数目(6)加报告序列中重复单元的数目(2)等于8。该描述涉及图7A-7G，其中显示了用具有两个重复单元的报告序列对含有一种八重复单元目标物的DNA样品进行的分析中得到的结果。与图6相比，当用第二报告寡核苷酸对目标DNA进行丰余分析时，应当注意一致实验位点位置的改变和目标等位基因信息的确定。
图9A和图9B显示了本发明的环出实施方式的概略图。在该图中，捕获序列60包括第一独特旁侧序列62，第二独特旁侧序列64，以及含有一个或多个重复单元的重复单元66插入序列。报告序列70包括报告第一独特旁侧序列72，报告第二独特旁侧序列74，以及重复单元76的插入序列。报告序列70的重复单元76的插入序列中重复单元数目可以与捕获序列60的重复单元66的插入序列中重复单元的数目相同，也可以不同。可以包括报告序列的标记物78。
图10A至10G描绘了可变长度的重复单元的多重系统。图7-10的编号在可操作的程度上将采纳图9A-9B的编号。在图10A中，捕获序列60包括第一独特旁侧序列62，第二独特旁侧序列64，和具有5个重复单元的重复单元66插入序列。报告序列70包括报告第一独特旁侧序列72，报告第二独特旁侧序列74，和重复单元插入序列，具体地说，具有7个重复单元。存在错配或环出状况，其中在插入序列66、76中，给出不同的重复单元编号。同样，在图10B和10D-10G中，存在错配或环出状况。报告序列70中各组成图形包括7个碱基重复单元。描述了在捕获序列60的重复单元66插入序列中一段或序列数目不断增加的重复单元。图10B包括6个重复单元，其仍然导致图10B中的错配，即环出状况，其中在报告序列70的插入序列76中的大量重复单元是环出是。在图10D-10D的各图中，在捕获序列60中的插入序列66中，重复单元的数目超过了报告序列的插入序列76中重复单元的数目。然后出现环出或错配状况。在图10D中，重复单元64的插入序列中存在8个重复单元，其与报告插入序列的重复单元76的数目相差一个重复单元。在图10E中，捕获序列60中重复单元64的插入序列中存在9个重复单元。在图10F中，捕获序列60中重复单元64的插入序列中存在10个重复单元。在图10G中，捕获序列60中重复单元64的插入序列中存在11个重复单元。
在一种方式中，标记杂交复合物，确定一致和不一致的步骤包括检测实验位点上标记的杂交复合物的量。检测装置和方法可以包括，但不限于光成像、电子成像、用CCD照相机成像以及集成光学成像。另外，无论标记或未标记，检测是定量的，其可以包括统计分析。复合物的标记部分可以是目标物、捕获序列、报告序列或全部杂交复合物。标记可以是选自以下物质但不限于它们的荧光标记BodipyTexas Red，Bodipy Far Red，Lucifer Yellow，Bodipy 630/650-X，BodipyR6G-X和5-CR 6G。还可以通过比色标记、射干内务发光标记和/或化学发光标记进行标记。标记进一步可以包括杂交复合物分子间的能量转移混乱分析、淬火、给体分子到受体分子之间的电子传送、后者可以被双链匹配杂交复合物促进(参见，例如，Tom Meade和FaizKayyem，DNA间的电子转移(electrontransportthrough DNA))。任选地，如果杂交复合物没有标记，可以通过测定双链和非双链DNA之间的导电性差异进行检测(参见，例如，Tom Meade和Faiz Kayyem，DNA间的电子转移)。另外，可以通过基于多孔硅的光干涉测量法进行直接检测。
可以扩增标记，标记可以包括例如分支或分叉DNA。如果目标DNA是纯化的，可以不扩增也可以扩增。另外，如果扩增的是纯化，并且扩增是指数法，目标物可以是，例如，PCR扩增的DNA或SDA扩增的DNA。可以使用线性DNA扩增法，例如滚环或转录失控。如果目标DNA是未纯化的，无论是未扩增的或扩增的，扩增方法进一步由用于指数扩增的PCR和SDA，以及用于线性扩增的滚环或转录失控组成。
目标DNA可以来源于组织，包括但不限于头发、血液、皮肤、唾液粪便、精液、上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、红细胞、犯罪现场的证据。目标DNA的来源可以包括正常组织、死亡组织、肿瘤组织、植物材料、动物材料、哺乳动物、人、鸟、鱼、微生物材料、异型生物质材料、病毒材料、细菌材料、和原生动物材料。
其中目标材料来源于克隆的有机体(Ian Wilmut，Roslyn研究所，Edinborough)，以确定遗传漂变特性和水平的程度。
另外，目标材料的来源可以包括RNA。再进一步说，目标材料的来源可以包括线粒体DNA。
实施例实施例1通过夹层杂交法鉴定TH01目标DNA等位基因TH01基因座在人酪氨酸羟化酶基因(ref)的非编码区中含有五到十一个拷贝数的四核苷酸重复序列(AATG)。该基因座是一种法医领域用于DNA指纹分析的通常被使用和接受的基因座。图1描述了从设计用于确定未知目标DNA样品中存在的等位基因性质的实验，经本发明描述的方法分析后得到的数据。
通过将混合抗生物素蛋白链菌素的琼脂有机层旋转涂布到电极顶端，制备硅芯片，由此形成用于结合DNA的下部基础的渗透层(参见，例如，美国申请序列号No.08/271882，1994年7月7日申请，题目为“用于分子生物学分析和诊断的电子严紧控制法”，按照Sosnowski等，1997，美国国家科学院科学进展)。该渗透层一面与电极相邻，另一面与含有分析液的缓冲液相邻。然后将特异于各TH01等位基因的捕获DNA电子定位到旋转涂布芯片上的个体位点，以便各实验位点能够检测不同的TH01等位基因。捕获寡聚物的序列在表1中列出。捕获寡聚物在50mM组氨酸缓冲液(pH约为5.4)中以500nM的浓度电子定位。某一时刻，衬垫被加+5偏压，提供+4.0微安培(A)的电流38微秒。然后逆转该区域的极性，加-4.0A到5个衬垫，持续25微秒。在约30秒的总电子定位时间内重复该循环500次。在这样的条件下，捕获寡聚物的生物素基质与活化实验位点上的渗透层中的抗生物素蛋白链菌素反应，从而使捕获寡聚物固定到该位点上。
然后将由TH01等位基因5和9构成的互补目标DNA的混合物电子杂交到含有设定地址的捕获DNA的各位点上。电子杂交在低导电性两性离子缓冲液中，在经验确定的能够促进无滑移杂交的温度下进行。基于电子杂交的性质，具体地说是低导电性的缓冲液(Edman，等，核酸研究，1997)，在比常规非电子杂交较低的温度下能够实现高严紧度的杂交。分析TH01的实验通常在34-42％C下进行。目标DNA在50mM组氨酸缓冲液(在其中性pH～5.4)中，以5-125nM的浓度进行电子杂交。程序化电子方案包括下列步骤。某一时刻衬垫被加偏压至+5，提供+4.0微安培(A)的电流19微秒(ms)。然后逆转该区域的极性，将-4.0A的电流加到同样5个衬垫上，持续12ms。在总共约30秒的电子定位时间内重复该偏压-AC循环500次。
该实验也通过被动、非电子杂交在高严紧度条件下进行，但提供更长的保温时间(50mMNaPO4缓冲液，pH7.0，60％C，30-60分钟，结果未显示)。
由于四核苷酸重复互补排列的可塑性质，这种杂交步骤的严紧度很严格。不需要排列旁侧独特序列即可十分容易地得到稳定的杂交体，因为重复区域的长度为20-44个碱基。由于无足够严紧度形成的记录杂交体以外的杂交体将不能被任何杂交分析准确地分辩。在相对交低温度下，可以用电子杂交获得高严紧度的杂交，这是由于缓冲液的低导电性，以及形成的排斥负电荷对DNA骨架的低屏蔽。DNA的电浓缩克服了它们的排斥作用同时维持高度严紧的杂交条件。
然后将1个重复单元的报告DNA(图13，在50mM NaPO4，500mM NaCl，pH7.0中，浓度为500nM)被动杂交到通过上述步骤形成的捕获-目标复合物上。在目标物定向杂交以使捕获寡聚物和报告寡聚物的末端核苷酸并列的实验位点上报告序列的杂交最稳定。这种附加稳定性是由于末端核苷酸的碱基堆积导致。这种并列将根据捕获寡聚物上吸附化合物的位置而成为5’-3’或3’-5’。不稳定构型是捕获序列和报告序列之间存在一个四碱基(或更多)的缺口，或者存在一个捕获序列和报告序列的四碱基(或更多)重叠(参见，例如，图3A-3C，和5A-5G)。
报告序列杂交后，将携带DNA的芯片用50mM NaPO4，pH7.0在室温下冲洗几次。然后将杂交有机金属-芯片的温度升高到30℃，以一分钟的时间间隔记录各实验位点的荧光水平。通过计算机程序(IP Lab)数字化处理荧光值，作为平均像素强度。选择各衬垫上的特定区域，储存各位点的像素强度用于分析。图1中的直方图显示了变性步骤刚一完成后各实验位点上的平均像素强度。
图11显示了荧光作为重复单元数目的指标的图形。这些结果显示TH01 DNA的杂合混合物可以被分成匹配(一致)和错配(不一致)杂交体，匹配杂交体代表DNA样品中存在的等位基因的特性。所有可能的纯合和杂合TH01 STR等位基因混合物(5+6，5+7，5+8等)均经芯片模式，例如图1A和1B所示的模式分析表明等位基因间差别相似的良好水平。
实施例2用丰余报告序列进行的目标DNA的再分析通过升高温度至约50℃，不会使由捕获序列得到的目标物变性的条件下，使来自前面实施例中描述芯片的匹配位点的一重复单元报告序列变性。然后使该芯片再次与零重复单元的报告序列杂交(参见例如图5)。这使稳定夹层复合物的位置从4位和5位(参见，图12，左侧，一重复单元的报告序列)转移到5位和6位(图12，右侧，零重复单元的报告序列)。利用捕获序列中重复单元的数目加报告序列中重复单元的数目等于目标物中重复单元的数目的公式，我们发现这种情况下目标DNA存在TH01的5和6等位基因的杂合混合。再分析进一步确认具有第二寡聚物序列的目标DNA中存在的等位基因的特性。这种丰余分析增加了分析结果的重要性，因为它本质上是一种目标DNA与具有不同序列的寡聚物的新的询问。应用不同序列降低了由于寡聚物二级结构或其它与序列有关的异常导致的人为结果的可能性。
用二重复单元的报告序列重复上述方案(参见，例如，图7A-7G)，以便将稳定匹配杂交体的位置转移到第三实验位点。这种STR分析的再一次重复进一步强化了该分析的稳固性。
实施例3为了增加碱基堆积效果进行的末端核苷酸的选择和/或修饰碱基堆积依赖于单个碱基的环结构与其最接近的碱基环之间的相互作用。该相互作用的强度依赖于凭经验确定的相关环的类型。申请人不希望被任何理论所限，用于解释该现象的可能理论是参与π键相互作用的两个碱基之间存在数个电子，以及用于从螺旋内部排除水的不同碱基组合的功效，由此增加熵，虽然上述模型与目前的数据一致，堆积相互作用的可能机制不限于这些概念。
还观察到对参与碱基堆积相互作用的碱基进行修饰可以加强二者之间的π键，或堆积。作为从上述模型中得出的一个可能的预测，这些修饰提供了更多的电子用于π键和/或增加环的表面积，从而增加了堆积碱基之间的疏水面积。
图14论述了应用于本发明的那些模型的一个实施例。用CSF1PO基因座进行的实验使用了一种A和Tastheterminal核苷酸，以提供可分辩的碱基堆积。参考文献指出，A-T碱基堆积相互作用是所有核苷酸组合中最不稳定的。因此，我们改变了捕获寡聚物和报告寡聚物的设计，安排G和A末端核苷酸，因为据报道它是更稳定的构型。用实施例中描述的方法进行该实验，除了被检查的基因座是CSF1PO。为了比较不同并列放置的相邻末端核苷酸的碱基堆积贡献，设计了另外一组CSF1PO捕获序列和报告序列，以使末端核苷酸从T-A改变成为G-A。图15比较了从既含有A-T又含有G-A末端核苷酸的错配杂交体中分辩匹配杂交体。结果表示为分辩率，即一致位点的平均荧光强度(MFI)除以不一致位点的平均MFI。可以看到，当使用G-A末端核苷酸而不是T-A末端核苷酸，分辨率从约2.5增加到约25。这些数据证明本系统可以按照碱基堆积理论以及以前观察预测的方式调控，由此强调本发明的机制在于依赖相邻碱基之间的π键。
除了利用自然选择的碱基堆积相互作用之外，还可以预测增加环中电子数目或增大疏水区的碱基修饰也能增加匹配杂交体从错配杂交体中的分辩。通过合成5’末端核苷酸含有与碱基环结合的丙炔基的TH01报告寡聚物，验证上述预测。预测该修饰将通过上述任何一种增加的电子疏水性模型增加碱基堆积。图15显示在具有丙炔基修饰的末端碱基或没有丙炔基修饰的末端碱基的TH01报告序列的直接比较中，匹配/错配的结果。该实验用TH01基因座按照实施例所述的方式进行。同样数据用分辨率表示。在4个独立实验中，观察到含有丙炔基修饰报告序列的复合物中稳定性增强。分辨率的平均增加值为95％。结果再次表明，本系统可以按照可预测的方式控制。可以通过添加其它类似物例如甲基或胆固醇基进一步运用这一概念。添加这些类型的修饰的方法是已知的(例如，Gryaznov)。
可以通过将修饰分子连接到一起，使这些修饰进一步稳定报告序列与一致位点的结合。Gryazov指示了这样一个实例，两个末端核酸均应用胆固醇，然后附加胆固醇结合分子，例如低密度脂蛋白(LDL)。这将在有目标物、胆固醇修饰的捕获序列、胆固醇修饰的报告序列和LDL组成的一致位点的复合物中发生。
实施例4TPOX等位基因的杂交检测
TPOX基因座在人甲状腺过氧化酶基因的非编码区中含有六到十三拷贝数的四核苷酸重复序列(AATG)(参见，例如，Anbach等，1996，法医血液遗传学进展(Advanced in Forensic Haemogenetics)。该基因座也是法医领域用于DNA指纹分析中被普遍使用和接受的基因座之一。序列在图17中提供。
图16描述了用基本上与实施例1描述的相同的方法分析含有TPOX 8和11等位基因的目标DNA的实验所得到的数据。将含有所有可能等位基因的捕获寡聚物电子定位到芯片的个体位点上。然后使由具有8和11 STR的TPOX等位基因组成的互补目标DNA混合物电子杂交到各含有被定位的捕获DNA的衬垫上。电子杂交的条件与实施例1中描述的条件相同。然后使一重复单元的报告寡聚物被动杂交到阵列上，并用TH01实施例的方式处理。图16显示了一种在含有7和10个重复单元的捕获寡聚物的实验位点上的稳定的杂交复合物。因为报告寡聚物具有一个重复单元，可以鉴定目标DNA具有8和11个重复单元。
结果表明可以将TPOX 8和11 STR DNA的混合物从所有错配体中准确无误地分辩出来。另外，所有其它被分析的纯合和杂合TPOX组合形成同等分辨。
实施例5CSF1PO等位基因的杂交分辩含有CSF1PO等位基因7-15(图19)(包含)的捕获寡聚物被电子定位到前面描述的代表位点。然后使含有CSF1PO 11和12等位基因(图19)的目标DNA电子杂交到各位点上。然后杂交CSF1PO的一重复单元报告序列(图1)。在30℃下使报告序列变性。图18显示了分析之后各捕获位点的平均像素强度，证明了准确分辩目标物样品中存在的等位基因的分析能力。实验按照实施例1中的描述进行。实施例6THO1/TPOX多重分析将基因座-等位基因特异性捕获寡聚物个体定位到一个芯片的不同位点上。然后使含有捕获寡聚物的DNA芯片与含有杂合等位基因的THO1和TPOX目标DNA混合物杂交。然后冲洗芯片，并通过前面描述的杂交分析形式分析。上述步骤按照实施例1的描述进行。用相对荧光水平确定位点是否含有一致或不一致DNA杂交复合物。使用的两种报告序列均含有一个重复单元。
图20的结果显示，在分析条件下，THO1的7和9STR等位基因与它们的识别捕获位点杂交良好。与其它捕获等位基因的杂交没有检测到(5×、7×、9×和10×)，表明THO1 7/9杂合子被良好分辩。对于TPOX基因座，我们也得到了一种良好匹配的捕获物/目标物相互作用(位点9×和11×)。另外，用10和12STR目标物形成的不一致杂交复合物的稳定性非常低，以至复合物不能被检测到(7×c和12×c)，或者低到足以产生15倍或更高的分辨率(分别为10×c和8×c)，使TPOX10/12杂合目标物轻易分辩。实施例7双链PCR-扩增的DNA中STR等位基因的鉴定进行本实验用于确定本发明用于询问PCR扩增产生的双链DNA中的效用。图6提供了用我们的系统准确鉴定PCR产生的目标物的能力的实施例。
按照Promega STR用户手册(3)中描述的标准条件，用来自K562细胞系的基因组模版PCR扩增TPOX1基因座。K562的基因型是8和9重复等位基因的杂合子。扩增后，扩增子在95℃变性，并杂交到Nanogen APEX芯片上。如前面所述，芯片含有特异于PCR产物的捕获探针，所述PCR产物含有不同数目的重复序列长度。
本实验的技术方面与实施例1和4中描述的方法相同，除了使用双链、PCR扩增的DNA作为目标物。
图21显示了实验完成后，正(8C，9C匹配)和负(7C，10C错配)位点上出现的信号的相对量。如实施例4中能够看到的，可获得的分辩水平的范围从20倍至无穷大。用来自K562对照DNA和从不知名供体中分离出来的基因组DNA的CSF1和TH01已经得到相似的结果。这些结果表明本发明一般可应用与所有双链DNA，无论是通过PCR还是其它技术扩增的，并含有分析未扩增DNA的潜力。
实施例8微变异体检测在以前所列的实施例中，通过直接对报告序列或报告序列/目标DNA进行荧光标记实现检测。一个实施方式是荧光扰动，其中淬灭剂和报告发色团彼此相邻排列，以至于荧光被淬灭。参见，例如，(应用电控制杂交的杂交分析方法和用于分析和合成用电子扰动催化剂的电子荧光扰动法)，全部被参考插入本发明，如同在本发明中完全描述一样。
寡聚物合成和结合的方法和材料属于常规技术。简单地说，捕获探针的一个末端含有一个结合基团，例如生物素，在其远末端或伸入STR区的末端有一个发色团。DNA合成过程中，连接手臂或间隔区将会插入内部的适当位置或末端。这些连接手臂具有功能集团，以后发色团将与之结合，例如氨基连接手臂和琥珀酰亚胺酯发色团。报告探针在其伸入STR区的末端也含有以同样方式插入的不同发色团。因此，当存在目标物时，捕获探针和报告探针将会杂交，并使发色团彼此处于最接近的位置。发色团之间的距离将由间隔区的长度确定，在那里发色团经碱基、骨架、或糖连接到DNA上。
实施例9捕获物和报告物的目标物-依赖性连接本发明的另一个实施例将通过将报告物连接到预先结合的捕获物上进一步稳定报告物与一致实验位点的结合。这将在捕获物和报告物之间形成一个共价键，同时捕获物通过生物素-抗生物素蛋白链菌素相互作用力固定在位点上。该实施例的关键部分是以可选择的方式完成连接，维持匹配杂交体从错配杂交体中分辩出来的能力。这将通过电子或常规方法，仔细控制杂交严紧度实现。
可以通过酶法(Maniatis等，分子克隆，实验室指南，1982)或化学法实现连接(Gryaznov，核酸研究，1994)。可以通过具体类型的反应涉及的动力学以及使某一特定方法参与形成一种产品的总功效来选择方法。
实施例10从错配/缺口和错配/重叠中分辩匹配本系统不仅能够从错配杂交体中分辩出匹配杂交体，而且能够分辩两种类型的错配，缺口和重叠，这种能力增加了本方法的应用。图22A、22B和22C显示了缺口、匹配和重叠条件(从左至右的棒状图)的荧光密度图，初始信号(图22A)，变性三分钟后(图22B)和变性十分钟后(图22C)。本技术的这种特性提供了有关目标DNA的其它信息，即有关所有可能的三种类型杂交体的信息。这些附加信息能够以以下几种方式应用。
首先，利用该特性可能减少准确鉴定目标DNA所需的衬垫数目。图23显示了应用TH01基因座中该特性的潜力。预测可以用一组具有五个、七个和九个重复单元的捕获寡聚物与具有一个重复单元的报告TH01基因座组合实现所有TH01等位基因的准确鉴定。这使所需的分析实验位点的数目从七个减少到三个。当该特性与进行丰余报告的能力结合时，能够显著减少用于统计学显著性基因分型的一系列基因座分析所需的衬垫数目。目前该水平约为10个基因座。它的优异效果将使一个芯片上容纳更多基因座，因此形成更大的阵列，在同一个芯片上分析多个体的能力将降低分析成本。这对于高通量处理尤其有用，目前进行中的建立重罪犯的STR数据库同样需要。
即使分析STR等位基因所需的实验位点的数目没有减少，分辩缺口错配和重叠错配中得到的附加信息也将有助于准确分析。任何附加信息都可以组合到最终数据统计分析中，以提供一种尽可能高度准确的答案。
实施例11通过环出分析确定目标DNA的STR等位基因的特性在另一个通过杂交来分辩STR等位基因的实施例中，我们已经证明可以使用不同的寡核苷酸系统。这种被称为环出系统的方法在图9A和9B以及图10A-10G中描述。从图中显见，它是一种鉴定矩阵中等位基因的夹层法的替换方法。环出系统应用捕获寡聚物的阵列，其中捕获寡聚物以与夹层分析模式类似的方式分布。捕获寡聚物的结构与夹层模式中的结构不同之处在于存在重复区两个末端旁侧的基因座-特异性独特序列。目标DNA还被标记，用左报告分析。可以在扩增过程中应用荧光(或含有任何其它适当的用于检测的分子修饰)PCR引物标记目标物。
实践中，特异于基因座的不同等位基因的环出捕获寡聚物以矩阵排列，以使个体实验位点代表不同等位基因(参见，例如，图6)。实际实验结果如图24所示。然后在电子条件下使标记的目标寡聚物与完整阵列严紧杂交。含有最稳定杂交体的实验位点与目标DNA的等位基因特性一致。确定桅顶杂交体的位置(因此等位基因-特异性捕获寡聚物与它结合)鉴定目标DNA中代表的等位基因。捕获寡聚物和报告寡聚物之间形成的重复单元数目相同的杂交体是匹配的。还可以说该实验位点与目标等位基因的特性一致。不一致或捕获序列和目标物之间等位基因数目不相等的实验位点将在目标或捕获DNA中形成一种具有环的杂交(参见，例如，10A、10B和10D-10G)。捕获物比目标物重复单元少的不一致位点将产生有环的杂交体。这些杂交体本质上比匹配杂交体稳定性低。因此电子严紧控制下的变性将从低稳定性杂交体中分辩出表明一致位点的稳定杂交体，基于那些位点上存在的探针的知识，使用户能够确定目标DNA中重复单元的数目。实施例12微变异等位基因TH019.3的检测随着STR应用越来越广泛，越来越经常地发现重复区内存在偏差。这给常规尺寸分段分离法带来麻烦，因为分辩的余地从四个碱基降低到一个碱基。在插入或缺失突变情况下存在同样问题。对于转化或颠换突变，等位基因的大小没有改变，然而序列发生了改变。
对于这两种类型的突变，插入/缺失和转换/颠换，都能够用我们的技术不困难地检测。这主要由于这样的事实，即Nanogen’s研究是基于分析而不是大小分段法的杂交。因此末端核苷酸碱基堆积与单核苷酸多态性的组合提供了有利的分辩工具。
一种众所周知的STR微变异体是TH01 9.3等位基因。它十分重要因为它在大部分高加索人群中存在。9.3微变异体的分析基本上与正常STR等位基因的分析相同，但是需要设计特别的捕获和报告寡聚物。捕获寡聚物仅含三个重复单元(3ru，图13)。这是因为目标链上重复单元6和3之间存在单碱基缺失。与捕获物结合的TH01 9.3目标DNA在含有超过三个重复单元的捕获位点上稳定性降低，因为在9.3的重复区中存在一个移码。已经设计了报告寡聚物(微变异体9.3，图13)，从而它将与含有缺失的重复单元区最稳定地结合。另外，设计了捕获寡聚物，从而仅在3ru实验位点发生目标物指引的捕获DNA和报告DNA的碱基堆积。图25显示了用于检测TH01 9.3微变异体的捕获和报告寡核苷酸的详细序列排列。图中的编号与图4C中的编号一致，另外附加了互补于构成微变异体的部分重复单元的序列45。这种特殊的微变异体报告物没有第二独特旁侧序列42。这对分析TH01 9.3等位基因是必要的，但不是其它微变异体-特异性报告物的特征。从该图中显见，在与TH01 9.3等位基因一致的杂交复合物中，存在目标DNA和报告DNA之间的序列互补性，以及捕获寡聚物和报告寡聚物之间的碱基堆积。图26显示了来自TH01等位基因的个体纯合子的PCR扩增DNA的分析结果。
虽然为了清楚和便于理解，通过图解说明和实施例的方式详细描述了上述发明，然而本领域的普通技术人员按照本发明的指教可以进行某些改变和调整而不偏离本发明所附权利要求的实质和范围，这是显而易见的。
权利要求
1．一种用于确定遗传目标物中重复单元性质的方法，包括以下步骤在多个实验位点上排列多个杂交复合物分析，其中杂交复合物分析包括至少一种含有重复DNA序列的核酸目标物，一种具有第一独特旁侧序列和互补于目标序列的n个重复单元的捕获探针，其中n≥0，和一种具有互补于同一目标序列链的选择序列的报告探针，该报告探针包括选自下组的特征a)其中报告探针的选择序列包括第二独特旁侧序列，b)其中报告探针的选择序列包括互补于目标序列微变异区的序列，和c)其中报告探针的选择序列包括一种互补于目标序列微变异区的第二独特旁侧序列，其中捕获探针加报告探针中重复单元的总数大于零，捕获探针的序列在至少两个实验位点上不同，至少部分通过确定杂交稳定性，来确定实验位点上杂交复合物分析中的一致和不一致，和基于一致位点的确认，以及定位在该位点上杂交复合物中的探针的知识，确定目标序列中重复单元的性质。
2．权利要求1的方法，其中，基于定位在该实验位点的探针的知识，通过目标物中存在的重复单元的数目，一致实验位点的位置体现目标序列重复单元的性质。
3．权利要求2的方法，其中在一致实验位点上，目标物中重复单元的数目等于捕获探针中重复单元的数目和报告探针中重复单元数目的总和。
4．权利要求1的方法，其中一致实验位点的位置通过目标序列中微变异体的检测体现目标序列重复单元的性质。
5．权利要求4的方法，其中微变异体包括一种或多种选自下组的突变缺失、插入、转换和颠换。
6．权利要求5的方法，其中微变异体影响单个碱基。
7．权利要求5的方法，其中微变异体影响一个以上碱基。
8．权利要求1的方法，其中一致实验位点的位置通过重复单元的数目以及通过目标序列中微变异体的检测体现目标序列重复单元的性质。
9．权利要求8的方法，其中微变异体包括一种或多种选自下组的突变缺失、插入、转换和颠换。
10．权利要求9的方法，其中微变异体影响单个碱基。
11．权利要求9的方法，其中微变异体影响一个以上碱基。
12．权利要求1的方法，其中对于相同基因座，当出现在一个实验位点上的杂交复合物相对于其它实验位点上的杂交复合物更稳定时，认为该实验位点是一致的。
13．权利要求12的方法，其中在包括捕获物、报告物和目标物的杂交复合物中由于碱基互补配对增强了稳定性。
14．权利要求12的方法，其中通过使报告物和捕获物的并列末端核苷酸相邻，形成碱基堆积，来增强稳定性。
15．权利要求14的方法，进一步包括选择并列的末端核苷酸增加一致和不一致之间的能量差异。
16．权利要求15的方法，其中选择至少部分与碱基堆积相关。
17．权利要求16的方法，其中堆积的碱基对是5’GpC3’。
18．权利要求16的方法，其中堆积的碱基对是5’TpA3’。
19．权利要求12的方法，进一步包括促进碱基堆积的末端核苷酸修饰。
20．权利要求19的方法，其中末端核苷酸用丙炔基修饰。
21．权利要求19的方法，其中末端核苷酸用甲基修饰。
22．权利要求19的方法，其中末端核苷酸用胆固醇基修饰。
23．权利要求12的方法，其中用连接技术增强稳定性。
24．权利要求23的方法，其中连接是酶连接。
25．权利要求23的方法，其中连接是化学连接。
26．权利要求1的方法，其中不一致包括捕获物和报告物之间存在一个缺口。
27．权利要求1的方法，其中不一致包括捕获物和报告物之间存在一个重叠。
28．权利要求1的方法，其中不一致包括重复区中的碱基变异。
29．权利要求28的方法，其中碱基变异包括缺失。
30．权利要求28的方法，其中碱基变异包括插入。
31．权利要求28的方法，其中碱基变异包括转换。
32．权利要求28的方法，其中碱基变异包括颠换。
33．权利要求1的方法，其中不一致包括捕获物和报告物之间或重复区中存在一个单核苷酸变异。
34．权利要求1的方法，其中不一致包括捕获物和报告物之间或重复区中存在一个以上单核苷酸的碱基变异体。
35．权利要求1的方法，其中不一致包括碱基变异加捕获物和报告物之间或重复区中的重叠。
36．权利要求1的方法，其中不一致包括碱基变异加捕获物和报告物之间或重复区中的缺口。
37．权利要求1的方法，其中重复单元中的碱基数目为2-50。
38．权利要求37的方法，其中重复单元中的碱基数目为3-6。
39．权利要求1的方法，其中包括微变异体的重复单元的数目为5-50。
40．权利要求1的方法，其中包括微变异体的重复单元的数目为2-2500。
41．权利要求1的方法，其中某一时刻被分析的基因座的数目为一。
42．权利要求1的方法，其中某一时刻被分析的基因座的数目为二。
43．权利要求1的方法，其中某一时刻被分析的基因座的数目少于五。
44．权利要求1的方法，其中某一时刻被分析的基因座的数目少于十。
45．权利要求1的方法，其中某一时刻被分析的基因座的数目少于十三。
46．权利要求1的方法，其中某一时刻被分析的基因座的数目少于二十。
47．权利要求1的方法，其中某一时刻被分析的基因座的数目少于一百。
48．权利要求1的方法，其中杂交稳定性至少部分通过电子严紧度控制(ESC)确定。
49．权利要求1的方法，其中杂交稳定性至少部分通过热调控严紧度确定。
50．权利要求1的方法，其中杂交稳定性至少部分通过化学调控严紧度确定。
51．权利要求1的方法，其中杂交稳定性至少部分通过电子严紧度控制(ESC)和热控制确定。
52．权利要求1的方法，其中杂交稳定性至少部分通过电子严紧度控制(ESC)和化学控制确定。
53．权利要求1的方法，其中杂交稳定性至少部分通过电子严紧度(ESC)、热和化学控制确定。
54．权利要求1的方法，进一步包括捕获探针与目标核酸杂交过程中的电子严紧条件。
55．权利要求54的方法，由此独特旁侧序列以适当指数与目标物杂交。
56．权利要求54的方法，由此电子严紧条件保证了重复单元的适当指标化。
57．权利要求54的方法，由此电子严紧条件限制了重复单元的滑移。
58．权利要求54的方法，其中初始杂交步骤发生在10分钟内或更短时间内。
59．权利要求58的方法，其中初始杂交步骤发生在5分钟或更短时间内。
60．权利要求54的方法，其中初始杂交步骤发生在1分钟或更短时间内。
61．权利要求54的方法，其中电子严紧控制包括电流和缓冲液。
62．权利要求1的方法，进一步包括捕获探针与核酸目标物杂交过程中的严紧条件。
63．权利要求62的方法，其中严紧条件包括严紧度的热调控。
64．权利要求62的方法，严紧度调节包括严紧度的热和电子调控。
65．权利要求62的方法，严紧度调节包括严紧度的化学调控。
66．权利要求62的方法，其中严紧度条件包括严紧度的化学和电子调控。
67．权利要求62的方法，其中严紧度条件包括严紧度的化学、热和电子调控。
68．权利要求1的方法，进一步包括报告探针与捕获探针核酸目标物杂交复合物杂交过程中的电子严紧度条件。
69．权利要求68的方法，由此独特旁侧序列以适当索引与目标物杂交。
70．权利要求1的方法，电子严紧条件由此保证了重复单元的适当指标化。
71．权利要求1的方法，电子严紧条件由此限制重复单元的滑移。
72．权利要求68的方法，其中初始杂交步骤发生在10分钟或更短时间内。
73．权利要求68的方法，其中初始杂交步骤发生在5分钟或更短时间内。
74．权利要求68的方法，其中初始杂交步骤发生在1分钟或更短时间内。
75．权利要求68的方法，其中电子严紧条件包括电流和缓冲液。
76．权利要求1的方法，进一步包括报告探针与捕获探针核酸目标物杂交复合物杂交过程中的严紧条件。
77．权利要求76的方法，其中严紧条件包括严紧度的热调控。
78．权利要求76的方法，严紧度调节包括严紧度的热和电子调控。
79．权利要求76的方法，严紧度调节包括严紧度的化学调控。
80．权利要求76的方法，其中严紧度条件包括严紧度的化学和电子调控。
81．权利要求76的方法，其中严紧度条件包括严紧度的化学、热和电子调控。
82．权利要求1的方法，其中杂交复合物是标记的。
83．权利要求82的方法，其中确定一致和不一致的步骤包括检测试验位点上标记杂交复合物的量。
84．权利要求83的方法，其中检测是成像检测。
85．权利要求84的方法，其中成像是光学成像。
86．权利要求84的方法，其中成像是电子成像。
87．权利要求84的方法，其中成像是CCD成像。
88．权利要求84的方法，其中成像是集成光成像。
89．权利要求83的方法，其中成像检测是定量的。
90．权利要求1的方法，进一步包括统计分析步骤。
91．权利要求82的方法，其中复合物的标记部分是目标物。
92．权利要求82的方法，其中复合物的标记部分是捕获物。
93．权利要求82的方法，其中复合物的标记部分是报告物。
94．权利要求82的方法，其中标记通过荧光标记。
95．权利要求94的方法，其中荧光标记用Bodipy Texas Red进行。
96．权利要求94的方法，其中荧光标记通过Bodipy 630/650进行。
97．权利要求94的方法，其中荧光标记通过Lucifer Yellow进行。
98．权利要求82的方法，其中标记通过比色标记。
99．权利要求82的方法，其中标记通过化学发光标记。
100．权利要求1的方法，进一步包括杂交复合物分子之间的能量转移。
101．权利要求1的方法，进一步包括荧光扰动分析。
102．权利要求100的方法，其中能量转移包括淬灭。
103．权利要求100的方法，其中能量转移包括给体分子和受体分子之间的电子迁移，其通过双链匹配杂交复合物促进。
104．权利要求103的方法，其中通过电子经双链DNA迁移介导转移。
105．权利要求100的方法，其中能量转移包括双链匹配杂交复合物促进的电子迁移。
106．权利要求82的方法，其中标记物是扩增的。
107．权利要求106的方法，其中标记物进一步包括分支DNA。
108．权利要求1的方法，其中杂交复合物是未标记的。
109．权利要求108的方法，其中一致检测至少部分基于电子循杂交DNA的传导。
110．权利要求108的方法，其中一致检测至少部分基于质量检测。
111．权利要求1的方法，进一步包括丰余分析。
112．权利要求111的方法，其中丰余分析是一种连续丰余分析。
113．权利要求112的方法，其中连续丰余分析在至少确定了一致和不一致步骤之后，包括下列步骤增加变性严紧度，以除去所有位点，包括一致或不一致位点上的所述报告探针，杂交第二报告探针，其中所述第二报告探针中重复单元的数目与所述报告探针中重复单元的数目不同，其中一致试验位点的位置，基于定位在该位点上的探针的知识，指示目标物中存在的重复单元的数目，其中在一致试验位点上，目标物中重复单元的数目等于捕获探针中重复单元的数目和报告探针中重复单元数目之和，至少部分通过确定杂交稳定性，确定试验位点上的杂交复合物分析中的一致和不一致试验位点，将这些结果与最初的复合物杂交分析比较，确证目标物中重复单元的数目。
114．权利要求111的方法，进一步包括重复丰余分析的步骤，直到获得有统计意义的结果。
115．权利要求111的方法，其中丰余分析包括多种排列。
116．权利要求115的方法，进一步包括目标物与至少两组独立分析物杂交的步骤，将所述报告物与第一组杂交，第二报告物与第二组杂交，其中所述报告探针中重复单元的数目与第二报告物中重复单元的数目不同，至少部分通过确定杂交稳定性，来确定试验位点上的杂交复合物分析中的一致和不一致试验位点，其中一致实验位点的位置，基于定位在该实验位点上探针的知识，指示目标物中存在的重复单元的数目，和将这些结果与所述两个复合物杂交分析比较，确证目标物中重复单元的数目。
117．权利要求116的方法，包括不同标记的报告物的同步杂交步骤。
118．权利要求117的方法，其中核酸序列中重复单元数目不同的、区别标记的两个报告物包括之后被同时提供给本装置的报告物。
119．权利要求117的方法，其中不同标记的报告物，发色团不同。
120．权利要求119的方法，其中发色团是荧光发色团。
121．权利要求119的方法，其中发色团是发光发色团。
122．权利要求119的方法，其中发色团是电化学发光发色团。
123．权利要求119的方法，其中发色团包括荧光发色团、发光发色和电化学发光发色团的组合。
124．权利要求117的方法，其中一致实验位点的位置，基于定位在该位点的探针的知识，指示目标物中存在的重复单元的数目。
125．权利要求117的方法，其中在第一实验位点上检测到第一标记物的存在，指示了该实验位点上报告序列和捕获序列相关重复单元的已知数目，其被在第二实验位点上检测到存在第二标记物进一步确证，在第二实验位点上检测到存在第二标记物指示该实验位点上报告序列和捕获序列相关重复单元的已知数目。
126．权利要求115的方法，其中两组排列在同一个装置上。
127．权利要求115的方法，其中两组排列在不同装置上。
128．权利要求1的方法，其中目标DNA是纯化的。
129．权利要求1的方法，其中目标物是未扩增的。
130．权利要求1的方法，其中目标物是扩增的。
131．权利要求130的方法，其中扩增是目标DNA扩增的指数法。
132．权利要求131的方法，其中扩增包括PCR扩增的DNA。
133．权利要求131的方法，其中扩增包括链置换扩增法(SDA)扩增的DNA。
134．权利要求131的方法，其中扩增包括DNA扩增的线性法。
135．权利要求134的方法，其中扩增包括滚环扩增。
136．权利要求134的方法，其中扩增包括转录失控扩增。
137．权利要求1的方法，其中目标DNA是未纯化的。
138．权利要求137的方法，其中目标物是未扩增的。
139．权利要求137的方法，其中目标物是扩增的。
140．权利要求139的方法，其中扩增是目标DNA扩增的指数法。
141．权利要求140的方法，其中扩增包括PCR扩增的DNA。
142．权利要求140的方法，其中扩增包括SDA扩增的DNA。
143．权利要求139的方法，其中扩增是DNA扩增的线性法。
144．权利要求143的方法，其中扩增包括滚环扩增。
145．权利要求143的方法，其中扩增包括失控扩增。
146．权利要求1的方法，其中排列在实验位点上的多个杂交复合物分析包括基因座的每个等位基因至少一个位点。
147．权利要求146的方法，其中等位基因包括一个完整数目的重复单元。
148．权利要求146的方法，其中等位基因包括一个完整数目的重复单元加至少一个微变异体。
149．权利要求1的方法，其中各一致实验位点鉴定了目标物的重复单元数目。
150．权利要求1的方法，其中所有不一致实验位点鉴定了目标物的重复单元数目。
151．权利要求1的方法，其中对于均一样品，每一基因座阵列的一致实验位点的数目在非丰余、多重阵列丰余、或连续丰余分析中为一或二。
152．权利要求1的方法，其中对于混合样品，一致实验位点的数目大于一。
153．权利要求117的方法，其中对于不同标记报告物的同步杂交丰余分析，一致实验位点的数目大于一。
154．权利要求1的方法，其中杂交复合物的性质可以分成匹配、错配/缺口、和错配/重叠。
155．权利要求154的方法，其中分辨率通过杂交复合物分析的信号强度确定。
156．权利要求155的方法，其中分辨率通过应用选择的电子、化学和热严紧度条件的梯度确定，导致杂交复合物分析的信号强度的改变。
157．权利要求154的方法，其中分辨率通过杂交复合物分析中存在的探针的知识确定。
158．权利要求1的方法，其中实验位点的数目少于每个等位基因提供一个实验位点。
159．权利要求1的方法，其中如此提供目标物以至能够减少鉴定目标DNA中重复单元数目必须的实验位点。
160．权利要求159的方法，其中所述减少增加了结果的统计意义。
161．权利要求1的方法，其中目标材料由一个基因座的纯合等位基因组成。
162．权利要求1的方法，其中目标材料由一个基因座的杂合等位基因组成。
163．权利要求1的方法，其中对于一种混合样品，目标材料由每一基因座超过一个等位基因组成。
164．权利要求163的方法，其中混合样品进一步包括来自一个以上个体的样品。
165．权利要求164的方法，其中混合样品进一步包括与正常组织混合的肿瘤组织。
166．权利要求165的方法，其中肿瘤组织是正常组织。
167．权利要求165的方法，其中肿瘤组织是疾病组织。
168．权利要求1的方法，其中目标材料包括肿瘤组织。
169．权利要求1的方法，其中目标材料包括植物材料。
170．权利要求1的方法，其中目标材料包括动物材料。
171．权利要求170的方法，其中动物材料是哺乳动物材料。
172．权利要求170的方法，其中动物材料是人的材料。
173．权利要求170的方法，其中目标材料包括鸟的材料。
174．权利要求170的方法，其中目标材料包括鱼的材料。
175．权利要求1的方法，其中目标材料由微生物材料构成。
176．权利要求175的方法，其中微生物材料是病毒。
177．权利要求175的方法，其中微生物材料是细菌。
178．权利要求75的方法，其中微生物材料是原生动物。
179．权利要求1的方法，其中该方法应用于鉴定。
180．权利要求1的方法，其中该方法应用于亲子鉴定。
181．权利要求1的方法，其中该方法应用于法医学。
182．权利要求1的方法，其中该方法应用于疾病诊断。
183．权利要求1的方法，其中该方法应用于育种。
184．权利要求164的方法，其中混合样品进一步包括来自包括单克隆和多克隆细胞源的个体的样品。
185．权利要求106的方法，其中标记物通过酶标记扩增来扩增。
186．一种适应权利要求1方法实施的活动、可编程、电子生物诊断设备。
187．一种应用电子技术确定遗传目标物中重复单元性质的方法，包括以下步骤在多个实验位点上排列多个杂交复合物分析，其中杂交复合物分析包括至少一个含有重复DNA序列的核酸目标物，具有第一独特旁侧序列和n个重复单元的捕获探针，其中n≥0，并且互补于目标序列，和具有一个互补于同一目标序列链的选择序列的报告探针，报告物包括选自下组的属性a)其中报告物的选择序列包括一个第二独特旁侧序列和n个重复单元，其中n≥0，b)其中报告物的选择序列包括互补于目标序列微变异体区的序列，c)其中报告物的选择序列包括一个第二独特旁侧序列和n个重复单元，其中n≥0，并且序列互补于目标序列的微变异体区。其中捕获物加报告物中重复单元的总和大于零，捕获探针的序列在至少两个实验位点上不同，至少部分通过确定杂交稳定性，确定试验位点上杂交复合物分析中的一致和不一致，基于一致位点的确认，并进一步基于定位在该位点上的杂交复合物中的探针的知识，确定目标序列中重复单元的性质。
188．一种确定遗传目标物中重复单元性质的方法，包括以下步骤提供一种鉴定遗传目标物的平台，其包括一组具有第一独特旁侧序列、数目可变的插入重复单元和第二独特旁侧序列的探针，使遗传目标物与探针杂交，包括杂交过程中的电子杂交严紧度条件，通过该条件独特旁侧序列连同目标物被适当标引，和至少部分通过确定电子杂交稳定性确定实验位点上的一致和不一致，由此在不一致杂交中形成一种环出，因此提供了一种比一致杂交中能量较为不利的条件。
189．一种确定遗传目标物中重复单元性质的方法，包括以下步骤提供一种鉴定遗传目标物的平台，包括一组具有第一独特旁侧序列、数目可变的插入重复单元和第二独特旁侧序列的探针，使遗传目标物与探针杂交，包括杂交过程中的电子杂交严紧度条件，通过该条件独特旁侧序列连同目标物被适当标引，和确定该实验位点上的一致和不一致，由此在不一致杂交中形成一种环出，其提供比一致杂交中能量较为不利的条件。
190．一种确定遗传目标物中重复单元性质的方法，包括以下步骤提供一种鉴定遗传目标物的平台，包括一组具有第一独特旁侧序列、数目可变的插入重复单元和第二独特旁侧序列的探针，使遗传目标物与探针杂交，和至少部分通过确定电子杂交稳定性，确定实验位点上的一致和不一致，由此在不一致杂交中形成一种环出，其提供比一致杂交中能量较为不利的条件。
191．一种确定遗传目标物中重复单元性质的方法，包括以下步骤提供一种鉴定遗传目标物的平台，包括选自下组的探针，1)一种具有第一独特旁侧序列、插入重复区和第二独特旁侧序列的探针，和2)一种夹层分析，包括一种具有第一独特旁侧序列和n≥0个重复单元的捕获探针，和具有n≥0个重复单元以及顺序相连的第二独特旁侧序列，其中重复单元的总数＞0，使目标物在电子严紧条件下与探针杂交，以提供适当的标引，和至少部分通过确定杂交稳定性，来确定试验位点上的一致和不一致，其中杂交稳定性包括电子杂交稳定性。
192．一种确定遗传目标物中重复单元性质的方法，包括以下步骤在多个实验位点上排列多个杂交复合物分析，其中杂交复合物分析包括至少一个含有重复DNA序列的核酸目标物，具有第一独特旁侧序列和互补于目标序列的n个重复单元的捕获探针，其中n≥0，和具有一个互补于同一目标序列链的选择序列的报告探针，报告物包括第二独特旁侧序列，以及n≥0个重复单元，其中捕获物加报告物中重复单元的总和大于零，捕获探针的序列在至少两个实验位点上不同，至少部分通过确定杂交稳定性，确定试验位点上杂交复合物分析中的一致和不一致，和基于一致位点的确认，并进一步基于定位在该位点上的杂交复合物中的探针的知识，确定目标序列中重复单元的性质。
全文摘要
本发明提供了分析和检测遗传目标物中重复单元性质的方法和装置。在本发明的一个方法中,遗传目标物中重复单元的性质通过以下步骤确定:在多个实验位点上排列多个杂交复合物分析,其中杂交复合物分析包括至少一个含有简单重复性DNA序列的核酸目标物,具有第一独特旁侧序列和互补于目标序列的n个重复单元(其中n=0、1、2…,)或其片段的捕获探针,以及具有互补于同一目标序列链的选择序列的报告探针,其中报告序列的选择序列包括第二独特旁侧序列和m个重复单元(m=0、1、2…)或其片段,但是捕获探针加报告探针中重复单元的总数大于0(n+m>0)。按照本方法,捕获探针的序列至少在两个实验位点不同。然后监测杂交复合物分析,至少部分通过杂交稳定性确定实验位点上杂交复合物分析中的一致和不一致。最后,可以基于一致/不一致确认并结合定位在该位点的杂交复合物中的探针的知识,确定目标序列中重复单元的性质。本发明的一个方面,在初始杂交相中,例如帮助适当索引杂交材料,或者在一致/不一致相中,或者在这两个过程中,可以应用电子严紧控制。在本发明的另一方面,系统包括多个位点,其中每个位点包括至少一个具有第一独特旁侧序列、第二独特旁侧序列和一个具有数目可变重复单元的插入重复单元序列的探针。可以确定环出状况或准确一致状况的存在。应用包括亲子鉴定、法医学应用、和疾病诊断,例如鉴定克隆肿瘤的存在。
文档编号C12P19/34GK1297489SQ99805207
公开日2001年5月30日 申请日期1999年2月12日 优先权日1998年2月25日
发明者罗纳德·G·索斯诺夫斯基, 尤金·图 申请人:内诺金有限公司