专利名称：人类蛋白酶以及这类蛋白酶的药学应用和降低非人类蛋白质的过敏原性的应用的制作方法
背景技术：
A．发明领域本发明涉及具有多种用途的人类蛋白质序列。具体的，这种新的人类蛋白质序列可通过预测试验的应用而设计出能在接触这类蛋白质的人体内产生较低的过敏原性应答的蛋白质。
B．现有技术丝氨酸蛋白酶为羰基水解酶的一个亚群。它们包括一大类具有较广泛特异性和生物学功能的酶。Stroud,R.科学美国人，13174-88。尽管丝氨酸蛋白酶的功能多样，它们的催化机制已通过至少两种遗传上相区别的酶家族而得到阐释枯草蛋白酶以及与哺乳动物胰凝乳蛋白酶相关并同源的细菌丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶和S.gresius胰蛋白酶)。丝氨酸蛋白酶的这两个家族显示了十分相似的催化机制。Kraut,J.(1977)，生化年鉴，46331-358。此外，尽管这两个酶家族的一级结构不相关，但它们的三级结构均含有由丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸组成的保守的催化三联体。
枯草蛋白酶是各种芽孢杆菌属细菌以及其它微生物所大量分泌的一种丝氨酸内切蛋白酶(分子量27,500)。已有至少4种不同芽孢杆菌属细菌的枯草蛋白酶确定了蛋白质序列。Markland,F.S.等(1983)，Honne-Seyler’s Z.Physiol.Cehm.,3641537-1540。解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶的精确到2.5分辨率的三维晶体结构也已有报道。Wright,C.S.等(1969)，自然，221235-242；Drenth,J.等(1972)，欧洲生化杂志，26177-181。这些研究说明，尽管枯草蛋白酶在遗传上与哺乳动物胰凝乳蛋白酶类似的丝氨酸蛋白酶不相关，但它具有相似的活性位点结构。含有共价结合的肽抑制物(Robertus,J.D.等(1972)，生物化学，112439-2449)或产物复合体(Robertus,J.D.等(1976)，生物化学杂志，2511097-1103)的枯草蛋白酶X-射线晶体结构也提供了有关枯草蛋白酶活性位点以及推定的底物结合裂口的信息。此外还有关于枯草蛋白酶的大量动力学以及化学修饰研究的报道(Philipp,M.等(1983)，分子细胞生物化学，515-32；Svendsen,B.(1976),Carlsberg Res.Comm.,41237-291；Markland,F.S.同前)以及关于枯草蛋白酶第222位残基甲硫氨酸的侧链经过氧化氢氧化为甲硫氨酸-亚砜(Stauffer,D.C.等(1965),生物化学杂志，2445333-5338)和第221位丝氨酸的侧链经化学修饰而转化为半胱氨酸(Polgar等(1981)，生物化学与生物物理学学报，667351-354)的至少一项报道。
与细菌枯草蛋白酶具有一定相似性和/或同源性的蛋白质也已在人体中测到(参见如，Keifer等，DNA及细胞生物学，第10卷，第10期，第757-769页(1991)；Smeekens等，生物化学杂志，第265卷，第6期，第2997-3000页(1990)；Tomkinson等，生物化学，第30卷，第168-174页(1991))。
美国专利第4,760,025号(RE 34,606)公开了对相应于解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶的以下位点的氨基酸残基所进行的修饰酪氨酸-1、天冬氨酸+32、天冬酰胺+155、酪氨酸+104、甲硫氨酸+222、甘氨酸+166、组氨酸+64、甘氨酸+169、苯丙氨酸+189、丝氨酸+33、丝氨酸+221、酪氨酸+217、谷氨酸+156和丙氨酸+152。美国专利第5,182,204号公开了对解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶中+224位氨基酸以及其它枯草蛋白酶中的等价位点进行的修饰，它们可通过取代、插入或缺失的方式进行修饰，也可以结合对美国专利第4,760,025号(RE 34,606)中所鉴定残基的修饰而形成有效的枯草蛋白酶突变体或变体。美国专利第5,155,033号公开了类似的突变枯草蛋白酶，它在等价于解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶+225位的位点上进行了修饰。美国专利第5,185,258和5,204,015号公开了在+123和/或+274位得到修饰的突变枯草蛋白酶。美国专利第5,182,204号公开了对枯草蛋白酶中很多个氨基酸位点进行的修饰，这些位点具体包括+99,+101,+103,+107,+126,+128,+135,+197和+204。美国专利第4,914,031号公开了某些枯草蛋白酶类似物，包括在+76位得到修饰的枯草蛋白酶。
工业、制药业及商业应用中使用的蛋白质包括蛋白酶日益普及。结果是，由这种普及所引起的接触已导致一些安全隐患，这类隐患来自某些人群对这些肽的敏感，当他们再次接触这些肽之后将产生严重的过敏反应，可能造成伤害甚至致命。例如，已知蛋白酶可在部分人体内引起危险的超敏反应。结果是，尽管蛋白酶在工业上如在洗衣用去污剂、化妆品、织物处理等方面十分有用，而且该领域为提供改进的蛋白酶，如使之在去污条件下能更有效地除去污渍，而进行了更深入的研究，但蛋白酶在工业上的应用已因其能在部分人体内产生超敏反应性过敏应答而成为亟待解决的问题。
人们已做了很多工作来减少这些问题。在降低蛋白酶应用的免疫原性潜力的研究方案中，已改进了生产工艺，通过控制和使工作环境中携有来自空气中的蛋白酶的粉尘颗粒或气溶胶的浓度减至最小而减少可能的接触；改进了颗粒成形的工艺，减少真正由蛋白酶产物产生的粉尘或气溶胶的量；改进回收工艺，减少终产物中可能含有的过敏原性杂质的水平。但降低蛋白酶过敏原性的努力其本身也相对不太成功。另一方面，已有人尝试遮盖蛋白酶中被过敏者体内的免疫球蛋白E(IgE)识别的表位(PCT申请第WO 92/10755号)或尝试通过使聚合物或肽/蛋白质与有问题的蛋白酶结合而放大或改变抗原决定簇的特点。
当适应性免疫应答以夸张或不适当的形式出现时，该个体将发生被称为超敏反应的一种应答。超敏反应是正常时有利的免疫应答不适当地发挥作用，有时引起炎性反应以及组织损伤。这些反应可由多种抗原激发；而且超敏反应的产生原因在不同个体之间差异很大。超敏反应一般并不在首次与抗原接触时发作，但常常在随后接触时出现。超敏反应的形式之一是在IgE直接针对无害的环境抗原，如花粉、尘螨或动物皮屑而应答时发生。由IgE致敏的肥大细胞释放的药理学介质产生伴有诸如哮喘或鼻炎等症状的急性炎性反应。
尽管如此，一项包括修饰IgE位点的方案在防止最初的致敏反应发生方面一般并不成功。因此，这类方案尽管可能中和或降低随后超敏反应的严重程度，但不能减少事实上被致敏的人数。例如，当已知某人对某种抗原过敏时，应对这种状况的一般而且也是唯一安全的方法是使该过敏者尽可能彻底地与该抗原隔离。事实上，任何其它行为均可能对该过敏者的健康造成危害。因此，尽管减少特定蛋白质的危害对某个过敏者而言十分重要，但对工业应用而言，它还远不值得人们去努力使某种蛋白质不能在第一地点引起超敏反应。
T淋巴细胞(T细胞)是免疫应答的诱导和调节中的关键因素，也是发挥免疫效应的关键。已知针对传染因子和肿瘤的特异性免疫力取决于这些细胞，并认为它们有助于伤口的复原。另一方面，这些应答的失控可导致自我攻击。通常，抗原以抗原呈递细胞的形式呈递给T细胞，此时，抗原呈递细胞通过各种细胞表面机制捕获抗原，并以适于抗原被T细胞识别的方式展示抗原或部分抗原。由T细胞表面的受体(T细胞受体)识别了特异性表位后，T细胞开始一系列复杂的相互作用，包括增殖，这导致B细胞产生抗体。T细胞和B细胞均由特定蛋白质或肽上的抗原表位活化，但这些单核细胞所识别的真正表位通常并不相同。事实上，活化T细胞导致免疫多样性产生的表位常常与后来由B细胞在免疫应答的过程中识别的表位不相同。因此，就超敏反应而言，尽管T细胞与抗原之间的特异性相互作用是产生针对抗原接触的免疫应答时的关键因素，但相互作用的特异性，即所识别的表位，常常并不与随后整个过敏反应的爆发相关。
PCT申请第WO 96/40791号公开了用聚环氧烷作为起始原料生产过敏原性降低了的聚环氧烷-多肽偶联物的工艺。
PCT申请第WO 97/30148号公开了一种过敏原性降低的多肽偶联物，它包括一种多聚载体分子，两个或更多的多肽分子与其共价偶联。
PCT申请第WO 96/17929号公开了生产过敏原性降低了的多肽的工艺，包括使1-30个多聚分子与一个母体多肽偶联的步骤。
PCT申请第WO 92/10755号公开了生产激发动物体内降低的免疫原性应答的蛋白质变体的方法。在该申请中，以目的蛋白、一系列蛋白酶及其变体免疫大鼠。然后测定大鼠血清中针对目的蛋白及其变体的多克隆抗体的反应能力。可根据这些结果确定制品中的抗体针对蛋白质及其变体的反应能力是相对更强还是更弱，从而能分析该蛋白质中哪些改变较有可能中和或降低Ig的结合能力。从这些大鼠试验得出结论改变对应于枯草蛋白酶309个残基中以下位点的任一个将导致免疫潜力的改变，这些位点是127、128、129、130、131、136、151、152、153、154、161、162、163、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、186、193、194、195、196、197、247、251、261。
PCT申请第WO 94/10191号公开了包含母体单体蛋白质的寡聚体形式的低过敏原性蛋白质，其中该寡聚体实质上保留了其活性。
现有技术已提供了降低特定蛋白质的过敏原性并鉴定能在部分个体中引起过敏反应的表位的方法，用于鉴定这些表位的试验通常涉及对已接触抗原的血清中IgE和IgG抗体的测定。尽管如此，对制备低过敏原性酶的其它方法仍有持续的需求。同样，对具有药用意义的人源酶类的需求仍在不断增长。
发明简述本发明的一个目标是提供一种可作为细菌和真菌蛋白酶的替代品应用于工业的人类蛋白酶。
本发明的一个目标是提供一种通过在目前正使用并且很成功的蛋白酶以及其它蛋白质中整合来自人类蛋白酶类似物的序列而使它们更为安全的方法。
本发明的另一目标是提供一种可应用于制药工业的人类蛋白酶。
本发明提供了降低非人类蛋白质的过敏原性的方法，其中鉴定出一种表位并用人类枯草蛋白酶中的一个相似区取代它。在一个较优选实施方案中，该非人类蛋白质是一种酶，更优选为一种蛋白酶。在另一优选实施方案中，该被取代的表位是一T细胞表位。
本发明的另一实施方案中提供了生产本发明之过敏原性降低了的蛋白质的方法。优选地，该突变蛋白通过对编码前体蛋白的DNA进行修饰，以使该修饰的DNA编码本发明的突变蛋白(其中一表位已由人类枯草蛋白酶的类似区取代)而制备。
本发明的另一实施方案提供了编码该突变蛋白的DNA序列以及含有这样的DNA序列的表达载体和用这样的载体转化的宿主细胞，其中宿主细胞优选能表达这类DNA，从而在细胞内或细胞外产生本发明的突变蛋白。
本发明的突变蛋白在该蛋白质已公认有效的任何组合物或方法中十分有用。例如，当该蛋白质为蛋白酶时，这种过敏原性降低了的蛋白酶可作为清洁产品如洗衣用去污剂和粗糙表面清洁剂的成分使用、作为皮革制备中的辅助使用、在织物如羊毛和/或丝绸的处理中使用以减少毛纤维、作为化妆品或擦脸油的成分使用、以及作为动物或宠物饲料中的成分使用以提高饲料的营养价值。类似地，当该蛋白质为淀粉酶时，这种过敏原性降低了的淀粉酶可用于淀粉的液化、作为碗碟洗涤剂中的成分使用、用于织物退浆、在洗衣用去污剂或淀粉酶有效的任何其它应用中使用。类似地，当该蛋白质为药用组合物时，可通过减少过敏反应的可能性而使其应用变得更为安全。
本发明的另一实施方案中，该人类枯草蛋白酶可在药用应用中使用，其中该蛋白酶用于清创治疗。
附图简述
图1A-C图示了解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶(BPN’)的DNA序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)以及该基因的部分限制性图谱。
图2图示了解淀粉芽孢杆菌与迟缓芽孢杆菌(野生型)枯草蛋白酶之间的保守氨基酸残基(SEQ ID NO3)。
图3A和3B图示了来自解淀粉芽孢杆菌的(BPN’)、枯草芽孢杆菌的、地衣芽孢杆菌的(SEQ ID NO4)以及迟缓芽孢杆菌的枯草蛋白酶型蛋白酶其氨基酸序列的比对。符号*表示与枯草蛋白酶BPN’相比缺少的具体氨基酸残基。
图4图示了16份外周血单核细胞样本对相应于迟缓芽孢杆菌蛋白酶的肽的加和性T细胞应答。肽E05代表含有对应于解淀粉芽孢杆菌蛋白酶第170-173位残基的区段。
图5图示了10份外周血单核细胞样本对相应于人类枯草蛋白酶的肽的加和性T细胞应答。
图6图示了人类枯草蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
图7图示了对应于实施例2中所用迟缓芽孢杆菌蛋白酶序列的肽的氨基酸链。
图8A和8B图示了对应于实施例2中所用人类枯草蛋白酶序列的肽的氨基酸链。
发明详述本发明提供了降低非人类蛋白质的过敏原性的方法，其中一种表位得到鉴定并用人类枯草蛋白酶中类似的区取代。在一个优选实施方案中，该非人类蛋白质是一种酶，更优选蛋白酶。在另一优选实施方案中，该被取代的表位是T细胞表位。
在本发明的另一实施方案中，提供了产生本发明的过敏原性降低了的蛋白质的方法。优选地，通过对编码前体蛋白的DNA进行修饰，使修饰DNA编码本发明的突变蛋白(其中一个表位已由人类枯草蛋白酶的类似区取代)，从而制备出所述突变蛋白。
本发明的另一实施方案中提供了编码该突变蛋白的DNA序列、含有这类DNA序列的表达载体以及用这类载体转化的宿主细胞，其中宿主细胞优选能表达这类DNA，从而在细胞内或细胞外产生本发明的突变蛋白。
根据本发明的一个优选实施方案，非人类目的蛋白中将要被取代的表位可用鉴定T细胞表位的方法进行鉴定。在本发明的一优选实施方案中，本发明提供了鉴定表位的试验，如下将分化的树突状细胞与未接触过抗原的人类CD4+和/或CD8+T细胞以及目的肽混合。更具体地，提供了这样一种方法，其中经以下步骤鉴定出一种T细胞表位(a)从单一血源获得树突状细胞的溶液和未接触过抗原的CD4+和/或CD8+T细胞的溶液；(b)在上述树突状细胞溶液中启动分化；(c)将上述分化的树突状细胞溶液和上述未接触过抗原的CD4+和/或CD8+T细胞与目的肽混合；(d)测定上述步骤(c)中T细胞的增殖。
将要用本发明的试验进行分析的非人类目的肽来自需降低过敏原性的蛋白质或酶。在实施本发明时，对能在某个体中或个体群中引起过敏反应的表位进行精确定位是有可能的。在本发明一特别有效的实施方案中，制备了相应于该蛋白质或酶的整体或部分的一系列肽寡聚体。例如，制备了涵盖该蛋白质的相关部分或整体的一个肽文库。产生这些肽的一个具体有效的方法是，在该肽文库中导入重叠，如，产生对应于所述蛋白质1-10位氨基酸的序列的第一肽，对应于所述蛋白质4-14位氨基酸的序列的第二肽，对应于所述蛋白质7-17位氨基酸的序列的第三肽，对应于所述蛋白质10-20位氨基酸的序列的第四肽等等，直至相对于整个分子的代表性肽均已产生。通过在本文所提供的试验中分别分析每段肽，有可能精确地鉴定出T细胞所识别的表位的位置。在上述实例中，某一具体肽与其邻近肽相比反应程度更高将有助于使表位锚着区鉴定到不超过三个氨基酸。在确定了这些表位的位置后，就有可能改变每一表位内的氨基酸，直至该肽产生的T细胞应答显著性降低为止。
优选地，表位经以下方式之一进行修饰(a)如当蛋白质为枯草蛋白酶时，优选用本发明的人类枯草蛋白酶中与目的蛋白类似的序列取代该表位的氨基酸序列，可进行序列对比以找出人类枯草蛋白酶分子中将要取代上述枯草蛋白酶的相应表位的相似区；(b)可用本发明中本质上与该表位的主要三级结构特征相似、但在T细胞表位识别时比目的蛋白产生较少的过敏原性应答的人类枯草蛋白酶的一个序列取代该表位的氨基酸序列；或(c)用在T细胞表位识别时比目的蛋白产生较少的过敏原性应答的人类枯草蛋白酶的任意序列取代该表位的氨基酸序列。
“抗原呈递细胞”在本文中指免疫系统的一种细胞，它们将抗原呈递于它们的表面，从而可由T细胞对这些抗原进行识别。抗原呈递细胞的实例有树突状细胞、交错突细胞、活化的B细胞以及巨噬细胞。
“T细胞增殖”在本文中指将T细胞与抗原呈递细胞在有或没有抗原的情况下一起温育期间产生的T细胞数。
“基线T细胞增殖”在本文中指个体在缺乏肽或蛋白质抗原时接触抗原呈递细胞所发生的应答中常见的T细胞增殖。为了本文的目的，基线T细胞增殖水平依据每人的每份样本中缺乏抗原的情况下T细胞对抗原呈递细胞进行应答时的增殖测定。
“T细胞表位”指对包含该抗原的某种肽或蛋白质产生免疫应答时T细胞受体所识别的该肽或蛋白质的特征。一般认为T细胞对T细胞表位的识别机制是通过T细胞识别与表达在抗原呈递细胞表面的Ⅰ类或Ⅱ类主要组织相容性(MHC)分子结合的抗原肽片段(参见如Moeller,G.编，MHC限制性应答活化的抗原需求，免疫学综述，98卷，187页(Copenhagen；Munksgaard)(1987))。
按本文所提供的试验确定的表位然后经修饰以降低目的蛋白的过敏原性潜力。在一优选实施方案中，待修饰的表位在样本中产生比基线T细胞增殖水平高三倍的T细胞增殖。修饰后，该表位在样本中产生的增殖基线增殖三倍的增殖，优选不到基线增殖的两倍，最优选比基线增殖还小或本质上相等。
“样本”在本文中包括未接触过抗原的，即未被目的抗原致敏的单核细胞。
“同系物”在本文中指具有与目的蛋白相似的催化作用、结构和/或用途的蛋白质或酶。最好能找出一种同系物，它与目的蛋白有相似的三级和/或一级结构，因而当用该同系物的类似片段取代目的蛋白中的表位时将降低这种改变的破坏性。因此，具有显著同源性的酶类是用本发明的人类枯草蛋白酶序列进行表位取代的最佳目标。
一段“类似的”序列可通过确保取代氨基酸显示与目的蛋白中表位上或表位附近的氨基酸有类似的功能、三级结构和/或保守残基而确定。因此，当该表位区包含，如，一α螺旋或一β折叠结构时，该取代氨基酸应保留这种特定结构。
尽管本发明包括所有想使其过敏原性降低的蛋白质，为了简化，下文将描述本发明的一特别优选实施方案，即对蛋白酶的修饰。蛋白酶是通常裂解蛋白质或肽的肽键的羰基水解酶。如本文所用，“蛋白酶”指天然蛋白酶或重组蛋白酶。天然蛋白酶包括α氨酰肽水解酶、肽酰氨基酸水解酶、酰氨水解酶、丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶、硫醇蛋白酶、羧基蛋白酶和金属蛋白酶。丝氨酸、金属、硫醇和酸性蛋白酶均包括在内，另外还包括内切和外切蛋白酶。
枯草蛋白酶是通常裂解蛋白质或肽的肽键的细菌或真菌蛋白酶。如本文所用，“枯草蛋白酶”指天然枯草蛋白酶或重组枯草蛋白酶。已知一系列天然枯草蛋白酶可由各种微生物物种产生并经常分泌出来。该系列中成员的氨基酸序列不完全同源。但该系列的枯草蛋白酶表现相同或相似的蛋白裂解活性。这类丝氨酸蛋白酶具有组成催化三联体的共有氨基酸序列，使它们区别于丝氨酸蛋白酶中的胰凝乳蛋白酶相关类别。枯草蛋白酶及与胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶均含有包括天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体。与枯草蛋白酶相关的蛋白酶中这些氨基酸从氨基到羧基末端的相对顺序是天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸。而在与胰凝乳蛋白酶相关的蛋白酶中，相对顺序是组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。因此，本文的枯草蛋白酶指具有与枯草蛋白酶相关之蛋白酶的催化三联体的丝氨酸蛋白酶。实例包括但不限于本文图3中鉴定的枯草蛋白酶。通常地，而且是为了本发明的目的，蛋白酶中氨基酸的编号与图1所示解淀粉芽孢杆菌的成熟枯草蛋白酶中分配的数字相对应。
“重组枯草蛋白酶”或“重组蛋白酶”指一种枯草蛋白酶或蛋白酶，其编码DNA序列已得到修饰，从而产生一种变异的(或突变的)DNA序列，该序列编码天然氨基酸序列中一或多个氨基酸的取代、缺失或插入。产生这类修饰的适当方法，以及可与本文所公开的方法组合的方法，包括美国专利第4,760,025号(RE 34,606)、美国专利第5,204,015号以及美国专利第5,185,258号所公开的方法。
“非人类枯草蛋白酶”及其编码DNA可从多种原核和真核生物中获得。原核生物的适宜实例包括革兰氏阴性生物如大肠杆菌或假单胞菌以及革兰氏阳性细菌如微球菌或芽孢杆菌。可从中获得枯草蛋白酶及它们的基因的真核生物实例包括酵母如酿酒酵母、真菌如曲霉菌属的种类。
“人类枯草蛋白酶”指图6中序列所代表的蛋白质、它们的衍生物或保留了水解肽键的基本功能的修饰产物。
“蛋白酶变体”具有衍生自“前体蛋白酶”氨基酸序列的序列。前体蛋白酶包括天然蛋白酶和重组蛋白酶。蛋白酶变体的氨基酸序列“衍生”自前体蛋白酶的氨基酸序列，是通过前体氨基酸序列中一或多个氨基酸的取代、缺失或插入而产生的。这类修饰是对编码前体蛋白酶氨基酸序列的“前体DNA序列”进行修饰，而不是对前体蛋白酶本身进行操作。对前体DNA序列进行这类修饰的适当方法包括本文公开的方法，以及本领域技术人员已知的方法(如参见EP 0 328299,WO89/06279和已在本文中参考过的美国专利和申请)。
本文用到的这些氨基酸位置编号指图1所示解淀粉芽孢杆菌的成熟枯草蛋白酶所分配的编号。但本发明不限于这一具体枯草蛋白酶的突变，还包括含有在“等价于”解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶中特定残基处的氨基酸的前体蛋白酶。在本发明的一优选实施方案中，该前体蛋白酶是迟缓芽孢杆菌的枯草蛋白酶，而在迟缓芽孢杆菌中相当于上述位点的等价氨基酸残基处发生取代、缺失或插入。
前体蛋白酶的残基(氨基酸)如果与解淀粉芽孢杆菌的枯草蛋白酶中特定残基或残基之一部分同源(即一级或三级结构中的位置均相对应)或类似(即具有相同或相似的进行化学地组合、反应、或相互作用的能力)，则与解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶的残基等价。
为确立一级结构上的同源性，直接将前体蛋白酶的氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶的一级结构进行比较，特别与已知在序列已明确的枯草蛋白酶中不发生变异的一组残基进行比较。例如，本文图2显示了解淀粉芽孢杆菌的枯草蛋白酶与迟缓芽孢杆菌的枯草蛋白酶之间的保守残基。允许必要的插入和缺失以维持比对(即避免因随机缺失和插入而使保守残基消失)的情况下对保守残基进行比对之后，确定了与解淀粉芽孢杆菌枯草蛋白酶的一级结构中特定氨基酸等价的残基。保守残基的排列优选地应保留100％的这类残基。但保守残基的排列超过75％或少到50％也足以确定等价残基。催化三联体Asp32/His64/Ser221的保守性应保持。
例如，在图6中对来自解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(carlsbergensis)和迟缓芽孢杆菌的枯草蛋白酶氨基酸序列进行了排列，显示出氨基酸序列之间的最大同源性。对这些序列的对比显示每一序列中包含多个保守残基。这些保守残基(如BPN’和迟缓芽孢杆菌之间的那些)均已鉴定，如图2。
因此，这些保守的残基可用于限定其它枯草蛋白酶如迟缓芽孢杆菌枯草蛋白酶(于1989年7月13日公开的PCT
发明者D·埃斯特尔 申请人:金克克国际有限公司