专利名称：人脊髓细胞系及其使用方法
技术领域：
广义上，本发明涉及人脊髓细胞系。更具体地，本发明涉及能分化成神经元的条件性无限增殖化脊髓细胞系，还涉及来自这些细胞系的分化细胞。这些细胞系和/或分化细胞可用于开发预防和治疗脊髓相关疾病、损伤以及疼痛的治疗剂。本发明还涉及这些细胞系和/或分化细胞在各种分析中和在脊髓细胞发育与分化研究中的用途。
为了开发对这类疾病的更好的治疗方法，需要进一步研究人脊髓神经元和分化过程。迄今为止，该研究一直被难以获得足够用于研究的原始人CNS组织和原代培养物寿命有限所妨碍。事实上，研究至今甚至不能解释在人胎儿脊髓中神经元限制性前身细胞(neuronal-restrictedprecursor cells)的存在。由于进行人脊髓研究存在困难，分化过程目前仍了解很少，脊髓疾病和损伤治疗方法的开发也被阻止。
因此，本领域需要易于分化的、可用于开发脊髓相关疾病疗法的稳定脊髓细胞系。本发明将满足这些需要，并进一步提供其它有关优点。
在其它方面，本发明提供能分化成神经元如运动神经元的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞。
本发明进一步提供产生神经元的方法，其包括在抑制生长促进基因表达的条件下培养上述条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞。在一些实施方案中，细胞可培养于含有四环素和/或存在一种或多种分化剂如NGF、CNTF和BDNF的培养基中。在相关方面，本发明提供按如上方法产生的神经元，如运动神经元。
本发明进一步提供将人脊髓细胞移植至哺乳动物的方法，包括给哺乳动物施用按如上所述制备的细胞，包括神经元。在相关方面，本发明提供治疗患者脊髓相关疾病的方法，包括给患者施用按如上所述制备的细胞，包括神经元。
在其它方面，提供筛选调节人脊髓细胞产生的蛋白质活性的因子的方法，包括(a)用候选因子接触按如上所述制备的细胞；和(b)随后测量候选因子调节该细胞产生的蛋白质的活性的能力。
在其它方面，本发明提供检测样品中某种蛋白质存在与否的方法，包括(a)用按如上所述制备的细胞接触样品；和(b)随后检测细胞中的反应，并由此检测样品中某种蛋白质是否存在。
本发明还提供鉴定人脊髓基因或蛋白质的方法，包括在按如上所述制备的细胞培养物中检测基因或蛋白质是否存在。
在其它方面，提供筛选影响人脊髓细胞死亡的因子的方法，包括(a)在当候选因子不存在时导致细胞死亡的条件下，用候选因子接触按如上所述制备的细胞；和(b)随后测定候选因子影响该细胞死亡的能力。
本发明还提供筛选调节人脊髓细胞死亡的蛋白质的方法，包括(a)改变按如上所述制备的细胞中某蛋白质的表达水平；和(b)随后测定这种改变对细胞死亡的影响，从而鉴定调节人脊髓神经前身细胞死亡的蛋白质。
在其它方面，本发明还提供按如上所述制备的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞。这种细胞可存在于一个克隆细胞系中。
参考下列详细描述和附图，本发明的这些和其它方面将更为明了。本文公开的所有文献均以参考文献完整地并入本文，如同每一文献单独并入。
图2是无限增殖化人脊髓克隆细胞系的代表HSP1、HSP2和HSP4的一组活体相差显微照片(phase)和显示v-myc标记的照片(v-myc)(如图所示)。克隆HSP1、HSP2和HSP4在增殖生长条件下每天施用(+Tc)或不施用(-Tc)四环素(1ug/ml)(如图所示)培养3天，之后进行v-myc免疫荧光分析。对于每一视野，(固定后)相差照片紧贴相应免疫荧光照片的上方。
图3A-3D中的图片显示FGF-2(碱性成纤维细胞生长因子)、EGF(表皮生长因子)和纤连蛋白对代表性克隆HSP1(图3A和3B)和HSP2(图3C和3D)的增殖的影响。在图3A和3C中，细胞接种至含N2补充物、纤连蛋白(5ug/ml)和鸡胚提取物(0.3％)的DMEM/F12培养基中。FGF-2或EGF按所示浓度添加。在图3B和3D中，细胞接种在预先覆盖了所示浓度纤连蛋白的24孔培养板中，其所用培养基是含N2补充物、FGF-2(50ng/ml)、EGF-2(50ng/ml)和鸡胚提取物(0.3％)的DMEM/F12培养基。HSP1以2×103细胞/孔的浓度接种，在第4天进行细胞计数。HSP1以2×104细胞/孔的浓度接种，在第3天进行细胞计数。数据以4次重复的平均值±标准差的形式显示，Student’s t-检验指示在存在和不存在生长因子的培养物之间的差异显著性(ap＜0.05；bp＜0.01)。
图4的一组照片显示在代表性无限增殖化人脊髓克隆细胞系HSP1、HSP2和HSP4中对NCAM(神经细胞粘着分子)和NF200(神经丝200kD)的免疫荧光标记(如图所示)。对于每一个细胞系，(固定后)相差照片显示在相应免疫荧光照片的左方，如图所示。
图5描述了分化4天后HSP1细胞动作电位的电生理记录。上方的迹线是注入电脉冲，而下方的迹线是细胞的膜电位。虚线指示零膜电位。
图6A-6D的照片显示分化2周后在代表性克隆HSP2中的细胞类型特异标志的免疫反应性。图6A和6B显示在相同视野中对GFAP(胶质原纤维酸性蛋白；图6A)和A2B5(6B)的标记。图6C显示在另一视野中在分化神经元中A2B5的免疫荧光。图6D显示对GFAP(FITC)和神经丝200kD(Texas红)的双标记。
图7A-7D的照片显示分化17天后在代表性克隆HSP1中tau、MAP2a&b(微管相关蛋白质)、外周蛋白和突触小泡蛋白(如图所示)的免疫反应性。
图8A-8D的照片显示在3、3、15或17天后代表性克隆HSP1中NGFR(低亲和性神经生长因子受体)、外周蛋白、NGFR/Islet-1(同源异型域转录因子)和ChAT(胆碱转乙酰酶)(如图所示)的免疫反应性，。
图9的一组照片显示分化7天后在代表性克隆HSP1中的ChAT、谷氨酸和GABA(γ-氨基丁酸)(如图所示)的免疫反应性。对于每一视野，相差照片(固定后)显示在紧靠相应免疫染色照片的右方。阳性和阴性染色细胞的例子分别用箭号和楔形符号标示。
本发明详述如上所述，广义上，本发明涉及条件性无限增殖化人脊髓细胞系、从这些细胞系产生的分化细胞和各种使用这些细胞的方法。具体地，本发明涉及能分化成神经元的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞，以及这些细胞在药物发现和开发、移植研究、治疗方法和各种分析中的用途。本发明的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系可以但不必需是克隆细胞系。本文所述细胞系提供了无穷的可再生的同型细胞来源，并促进脊髓疾病的药物开发。
一般地，条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞可从人脊髓组织(如胎儿脊髓组织)制备。优选该组织从脊柱解剖下来，除去了脑脊膜和外周神经。然后将脊髓组织分离，洗涤，接种在允许增殖的表面和生长培养基中(即该表面和培养基允许在24小时的期间内至少1％的细胞加倍)。一种优选生长培养基包含添加了N2和B27补充物(GIBCO,Baltimore,MD)、FGF-2(人重组产物，50ng/ml,Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)、EGF(人重组产物，50ng/ml,GIBCO,Baltimore,MD)、IGF-I(人重组胰岛素样生长因子，10ng/ml,R&D Systems)、PDGF(人重组血小板衍生生长因子，10ng/ml,Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)、鸡胚提取物(0.3％,GIBCO,Baltimore,MD)，超滤过的)和牛血浆纤连蛋白(5ug/ml,Sigma,St.Louis,MO)的DMEM/F-12。适合的表面包括但不限于聚氨基酸(如聚赖氨酸和/或聚鸟氨酸)、组织培养塑料和用层粘连蛋白或纤连蛋白处理过的表面之一或其组合。一般地，细胞可以103-105细胞/cm2的密度，优选约104细胞/cm2的密度接种。
通过采用任何含有生长促进基因(即，在适当条件下加速转染细胞生长的蛋白质的编码基因)(以便生长促进蛋白的产生和/或活性可被外部因子调节)的适当载体转染平板细胞(plated cell)，可将人脊髓神经前身细胞条件性无限增殖化。在一个优选实施方案中，生长促进基因是癌基因，例如但不限于v-myc。其它可用作生长促进基因的癌基因包括N-myc、c-myc、p53、SV40大T抗原、多形瘤大T抗原、Ela腺病毒和人乳头瘤病毒的E7蛋白。一般地，“生长促进基因”可以是任何在用于本文所述tet-控制表达系统时导致产生能分化成神经元和运动神经元的神经前身细胞培养物的基因。
生长促进蛋白的外部调节可通过将生长促进基因置于可外部调节的启动子(也就是说，该启动子的活性可被例如改变转染细胞的温度或与细胞接触的培养基的组成控制)的控制之下来实现。一般地，生长促进基因表达的调节应当是相对严谨的，也就是说，通常生长促进基因表达在该启动子被抑制时应不能被本文所述的免疫荧光技术检测到。例如，可采用四环素(tet)控制的基因表达系统(见Gossen等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)895547-5551,1992；Hoshimaru等，美国国家科学院院刊931518-1523,1996)。缺乏tet时，该载体中tet控制的反式激活蛋白(tTA)强烈激活从phCMV*-1(一个来源于人巨细胞病毒的与tet操纵基因序列融合的最小启动子)引发的转录。tTA是大肠杆菌的转座子-10衍生的tet抗性操纵子的阻抑蛋白(tetR)和单纯疱疹病毒VP16的酸性结构域的融合蛋白。无毒性的低浓度tet(0.01-1.0ug/ml)几乎全部消除了tTA的反式激活作用(也就是说，用本文提供的免疫荧光分析不再可检测到v-myc)。
在一个优选实施方案中，所述载体还含有编码选择标记的基因(如赋予药物抗性的蛋白)。细菌新霉素抗性基因(neoR)就是一个可用于本发明的这种标记。携带neoR的细胞可用本领域普通技术人员已知的方法筛选，例如向生长培养基中添加100-200ug/ml G418。很容易明了，还可采用其它标记，并且本领域普通技术人员可容易地进行适当筛选。
转染可采用本领域普通技术人员已知的各种方法来实现，其包括但不限于逆转录病毒感染。通常，平板细胞可通过用适当逆转录病毒(例如VSV-G假型LINXv-myc逆转录病毒，下面将进一步阐述)感染来转染。为了获得更高的病毒原液浓度、获得(离心后)在所选培养基中的原液和增加对人细胞的感染性，优选使用VSV-G假型逆转录病毒。最新开发的(非传统型)VSV-G假型逆转录病毒载体对感染人细胞可能特别有用，因为VSV-糖蛋白受体比传统兼噬性包膜蛋白受体更丰富、更少种属特异性。而且，已报道VSV-G假型病毒颗粒可抵抗超速离心，从而允许病毒浓缩和在与神经祖细胞生长相容的生长培养基中重悬(Burns等，美国科学院院刊908033-8037，1993)。
例如，通过在1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene)(4-8ug/mL)存在时与逆转录病毒孵育约12-24小时(如过夜)，按如上所述制备的人脊髓神经前身细胞培养物可在接种后两天之内获得感染。然后可用新鲜生长培养基洗涤除去逆转录病毒。携带选择标记的转染细胞通常可在允许贴壁和增殖的表面上和生长培养基中筛选。增殖可按如下所述进行评价。表面允许贴壁的能力可采用显微镜视觉检查来确定。一般地，至少应有20％的细胞附着于表面。一种优选生长培养基包含添加了N2和B27补充物(GIBCO,Baltimore,MD)、FGF-2(人重组产物，50ng/ml,Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)、EGF(人重组产物，50ng/ml,GIBCO,Baltimore,MD)、IGF-I(人重组胰岛素样生长因子，10ng/ml,R&D Systems)、PDGF(人重组血小板衍生生长因子，10ng/ml,Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)、鸡胚提取物(0.3％,GIBCO,Baltimore,MD，超滤过的)和牛血浆纤连蛋白(5ug/ml,Sigma,St.Louis,MO)的DMEM/F-12。如上所述，适合的表面包括但不限于聚氨基酸(如聚赖氨酸和/或聚鸟氨酸)、组织培养塑料和用层粘连蛋白或纤连蛋白处理过的表面之一或其组合，并且应形成附着的单层。通常大多数细胞是多角形的，有非常短的突起。
转染后，培养物可维持在含有例如添加了N2补充物、FGF-2(50ng/m1)、EGF(50ng/ml)、鸡胚提取物(0.3％)和牛血浆纤连蛋白(5ug/ml)的DMEM/F-12的简化生长培养基中。接近汇合的培养物可通过胰蛋白酶消化并按1∶5分开来进行传代。典型地，一个接近汇合的T75培养瓶可产生107细胞，培养物每3-4天传代一次。也可将细胞冷冻保存于液氮中用于长期贮藏。
从按如上所述制备的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系可分离克隆细胞系。一般地，这种克隆细胞系可采用标准技术如有限稀释或使用克隆环来分离，并进行扩大。克隆细胞系通常可按如上所述饲养和传代。可用基因组Southern杂交证实克隆性。
条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系(可以是但不必需是克隆化的)通常可通过抑制生长促进基因的表达(即抑制生长促进蛋白的产生和/或活性)来诱导分化形成神经元(和某些情况下的神经胶质)。例如，如果生长促进蛋白编码基因处于可外部调节的启动子控制之下，则可改变条件(如温度或培养基的组成)以抑制生长促进基因转录。对于上述四环素控制基因表达系统，可通过加入四环素抑制生长促进基因转录来实现分化。一般地，1-5ug/mL四环素处理48小时足以开始神经元的形态学分化，并且，在随后几天里分化神经元数量增加。例如，这种分化可通过将细胞接种在合适的基底(如层粘连蛋白或组织培养塑料)上，含有N2补充物、鸡胚提取物(0.3％)、天然鼠层粘连蛋白(5ug/ml)、FGF-2(1-10ng/ml)和四环素(1-5ug/ml)的DMEM/F12培养基中来进行。此外，可在培养基中包含增加环AMP的因子如毛喉素(10uM)和/或神经营养因子，以增强运动神经元的分化(如CNTF(10ng/ml)、NGF(100ng/ml)和BDNF(脑源神经营养因子；10ng/ml))。然后可用无FGF-2的培养基更新(如每5天一次)培养基。
祖细胞系和分化细胞系的特性分析通常可采用本领域普通技术人员熟知的技术来进行，所述技术包括细胞类型的形态学分析、免疫细胞化学和PCR(鉴定细胞类型特异性标志和受体并证实生长促进基因存在)以及电压门控和配体门控电流的电生理分析。简而言之，根据相差显微镜下明亮胞体和细长突起的存在，可从形态学鉴定神经元细胞。神经元标志包括NCAM、βⅢ-微管蛋白和神经丝(160和200kD)。神经胶质标志包括GFAP(星形胶质细胞)和少突神经胶质细胞标志01、04和GalC(半乳糖脑苷脂)。这些标志的存在与否可用标准免疫荧光技术(例如采用商业上可购买的第一抗体和荧光试剂)简便地测定，而且，编码这些标志的mRNA水平可用PCR或杂交技术测定。可采用本领域普通技术人员熟悉的电生理分析评价细胞发放动作电位和表现钠、钙和钾电流以及配体门控电流(如N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、红藻氨酸(KA)和γ-氨基-正丁酸(GABA))的能力，从而测定功能性通道和受体的水平。
在一些方面，本文所述条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系可导入哺乳动物用于移植研究或治疗患者。例如，通过移植可将细胞导入动物如大鼠、小鼠或猴子的神经系统中。当细胞移植至发育中或成年的脊髓或脑时，可对这些细胞的分化进行研究。还可检验这些细胞充当病理条件下治疗剂的能力。特别地，这些细胞本身可能具有功能性替代在神经变性疾病中死亡的或由于伤害而死亡的神经元的能力，或者可充当具有治疗价值的因子(例如营养因子)的来源。这些因子可通过内源基因或转染至细胞中的基因来产生。
对于患者的治疗，可给患者(无论预防还是现有疾病的治疗)施用条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系和/或调节因子(可抑制或增强人脊髓神经前身细胞产生的蛋白的活性，如下所述)。可用这些细胞和/或调节因子预防和/或治疗的疾病包括但不限于运动神经元疾病(例如肌萎缩侧索硬化和脊髓性肌萎缩)、髓磷脂相关疾病(如多发性硬化症)、脊髓损伤和疼痛。通常细胞可按如上所述导入患者(即移植)。调节因子可通过任何本领域普通技术人员已知的多种途径施用。这些因子可以以其活性形式作为药物前体(即在患者体内转化成活性形式的化合物)或作为编码调节因子或药物前体的核酸序列施用。用于本发明这一方面的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞可以，但不必需，进一步转染，以便它们在患者体内表达一种或多种额外的蛋白(如调节因子)。
关于给患者的施用方法，通常将一种或多种条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞(和/或调节因子)配制成药物组合物。药物组合物可是无菌的水溶液或非水溶液、悬浮液或乳液，其另外还包含生理上可接受的载体(即不妨碍活性成分的活性的无毒材料)。本发明的药物组合物可采用本领域普通技术人员已知的任何适合载体。载体的选择部分取决于所施用物质(即细胞或化学物质)的性质。代表性的载体包括生理盐溶液、明胶、水、醇、天然或合成油、糖溶液、二醇、可注射的有机酯如油酸乙酯或这些物质的组合。选择性地，药物组合物还可包含防腐剂和/或其它添加物如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和/或惰性气体、和/或其它活性成分。
给药途径和频率以及剂量，将根据患者的不同而不同，并依赖于所施用物质的性质。一般而言，药物组合物可以通过静脉内、肌内、皮下或腔内途径给药。优选每天一次给药。适合的剂量是足以改善脊髓相关疾病患者的症状或抑制这种疾病发病的量。症状改善可根据疾病相关的临床症状的改善和/或延缓来检测。一般地，药剂中存在的或药剂中存在之DNA原位产生的调节因子的量，可在1mg-200mg/kg宿主范围之内。适宜的剂量大小将随患者的体重而不同，但典型地，对于10-60kg的动物将在约0.1mL-5mL。
在本发明的一些方面，条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系可用于各种体外分析和筛选。很明显，本文所述细胞系可用于许多人们熟知的分析和筛选中，而且用于进行这些方法的特定参数和标准将依赖于所进行的分析。本领域普通技术人员可很容易地根据熟知方法和待检化合物的期望特性设计特定分析和筛选方法。
在一些方面，本文所述分化或未分化的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系可用于检测在这些细胞中目标核酸分子或蛋白存在与否。为了在这些细胞中检测特定核酸序列(即DNA和/或RNA)，可采用熟知的PCR和/或各种杂交技术等方法。采用在例如Sambrook等.分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989中所述的方法，这种分析可很容易地设计和进行。为了检测蛋白质，典型的检测试剂是抗体，其可按如下所述制备。对于使用抗体检测样品中的蛋白质，本领域普通技术人员已知各种分析形式。见，例如Harlow和Lane，抗体实验室手册(AntibodiesALaboratory Manual)，冷泉港实验室，1988。用于这种分析的抗体可是多克隆或单克隆的。可采用本领域普通技术人员已知的各种技术制备抗体，目标蛋白特异的单克隆抗体可采用例如Kohler和Milstein，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6511-519，1976的技术及其改良方法制备，此外，蛋白质可基于其活性采用本领域已知的任何适当的分析方法来检测。
这些分析通常可用于例如评价一种因子调节人脊髓神经前身细胞或神经元产生的某蛋白质活性之能力的分析中。在这些分析中，可在足够允许候选因子调节蛋白质活性的条件和时间下，用该因子接触分化或未分化细胞。接触之后，候选因子调节细胞产生的蛋白质活性的能力采用标准方法测定，所述方法例如PCR或杂交(用于评价mRNA水平)或任何适于目标蛋白的各种免疫测定或功能分析。例如，可采用钙敏感或电压敏感的染料偶联分析，cAMP测定和/或受体结合实验以评价候选调节因子的作用。一般地，这种筛选中使用的抗体或其它因子的合适的量将依赖特定蛋白质而变化，但其范围在约10ug-约100mg。
本文所用术语“调节”包括抑制或增强目标蛋白质的活性。这种调节可发生在转录或翻译水平，或可是由于改变了完整蛋白的活性。蛋白活性的调节可以是直接的(即调节因子可直接与目标蛋白质相互作用)也可是间接的(即调节因子可改变一种或多种其它蛋白的表达和/或活性，而后者反过来又调节目标蛋白的活性)。调节因子可是抗体(如单克隆抗体)、多核苷酸或其它药物。调节任何细胞蛋白活性的因子都可用这些筛选来鉴定。在一些实施方案中，可为蛋白质如神经递质受体(如AMPA亲和性受体、红藻氨酸受体、GABA受体、腺苷受体和/或5-HT受体)、生长因子受体(如FGF-2、EGF、BDNF、NGF、CNTF、NT-3和/或GDNF的受体)或离子通道(如钠通道、钙通道和/或钾通道)鉴定调节因子。优选调节因子能抑制或增强蛋白质活性至少2倍。
在本发明的另一方面，本文所述细胞系可用于研究天然细胞环境中蛋白质和/或基因表达的系统。例如可采用本领域普通技术人员熟知的方法分析受体表达和/或活性、评价各种修饰对该表达和/或活性的影响。在一个这种方法中，细胞系可永久性或瞬时转染一个或多个目标基因，例如但不限于产生或修饰膜蛋白、分泌蛋白或细胞内目标蛋白的基因。这些基因包括离子通道、神经递质受体、β-淀粉样蛋白和/或MAP激酶。转染基因还可与报告基因偶联，用于药物开发。在本文所述的这一方面和其它方面，可使用未分化的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞，或者使用分化细胞。此外，可使用不同年龄和生长于各种条件下的细胞。与现有细胞系相比，本发明的细胞系用于这类研究具有许多优点，包括提供能产生神经元的克隆细胞系的能力和条件性无限增殖化的特征，该特征允许在发育的特定阶段停滞。用于任何给定研究的特定细胞的选择将取决于该研究的目标，而且，采用本文所述技术，本领域普通技术人员能很容易地制备适当的细胞。
在其它方面，本发明的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系可用于检测样品中特定蛋白存在与否的分析中。一般地，分析可通过用样品接触这些细胞然后采用本领域普通技术人员熟悉的方法测定细胞中该蛋白质所诱导的反应来进行。例如，可用差异显示技术测定反应。
在另一方面，本文所述条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系可用于在人脊髓神经前身细胞中存在的新基因和新蛋白的鉴定。该鉴定可采用例如PCR、差异显示、杂交、表达文库筛选、免疫测定和双杂交筛选等技术。一个特别有用的技术是差异基因筛选。本文所述克隆细胞系特别适于这种研究，因为它们来自单个亲本细胞，因此，相对于非克隆细胞系，人脊髓神经前身细胞特异基因获得了扩增。还可鉴定因实验操作(如细胞凋亡诱导)而表达的新的基因和蛋白质。
本文提供的细胞系还可用于体外神经元细胞死亡模型，所述神经元细胞死亡包括但不限于停用生长因子诱导的神经元凋亡。简而言之，克隆的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系可在设计成将细胞凋亡基本水平减至最小的条件下分化。通过估计不同实验条件下生长的细胞内凋亡细胞核的百分数，可以很容易地鉴定适合的条件。凋亡细胞核百分数通常可使用本领域普通技术人员熟知的方法确定，所述方法例如DAPI染色或原位切口末端标记法。将基本凋亡水平减至最小的适宜条件包括在1ug/mL四环素、CNTF(10ng/mL)、NGF(100ng/mL)和BDNF(10ng/mL)存在时分化。细胞应维持在适宜分化状态足够长的时间以允许分化而又将基本凋亡水平减至最小(基本凋亡水平通常在分化的头10天内增加)。
然后这些分化的神经元细胞可用于几种凋亡模型的任一种。在一个这种模型中，停止施用生长因子和N2补充物一段足够长的时间，以显著增加具有浓缩细胞核的凋亡细胞百分数。优选地，这些凋亡细胞的百分数增加至少约两倍。在上述代表性条件下，停用约18小时通常足以。应导致很大百分比的这些细胞无法生存。优选地，在停用生长因子之后至少约50％的神经元不再能存活。
采用本领域普通技术人员熟知的实验技术，这些细胞可用于研究凋亡机制以及各种条件和因子对神经元细胞凋亡的影响，而不论何种特定模型。例如，这些细胞可用于筛选影响神经元细胞死亡的因子。这种筛选可通过如下方法进行用候选因子接触生长因子停用期间的细胞，然后评价候选因子影响随后的凋亡水平的能力。同样，这些细胞可用于筛选调节神经元细胞死亡的蛋白质。在这种筛选中，(采用标准技术)改变细胞内候选蛋白质(如酶)的表达或活性水平，然后测定这种改变对处理(包括但不限于停用生长因子)后凋亡水平的影响。
以下提供的实施例用于举例说明，而非限制性的。
实施例实施例1人脊髓祖细胞系的制备本实施例说明人脊髓祖细胞的条件性无限增殖化。
原代培养物的人脊髓细胞可从8-9周妊龄的人胎儿脊柱制备(从Advanced Bioscience Resources公司获得)。该组织依照州和联邦的法律和规范获得。分离之前，将脊柱置于含有青霉素(50 I.U./ml)和链霉素(50μg/ml)的Hank’s平衡盐溶液(不含钙或镁)中4℃维持约24小时。从脊柱分离脊髓，并除去脑脊膜和外周神经。然后通过在在含有0.2％胶原酶加分散酶的酶溶液中于37℃孵育30-45分钟并不时研制以游离脊髓组织。将分散的脊髓细胞在高葡萄糖Dulbecco’s改良Eagle培养基(DMEM)/F-12(1∶1)中洗涤3次。随后将细胞以约104细胞/cm2的密度接种在由添加了N2和B27补充物(GIBCO,Baltimore,MD)、FGF-2(人重组产物，50ng/ml，Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)、EGF(人重组产物，50ng/ml,GIBCO,Baltimore,MD)、IGF-I(人重组胰岛素样生长因子，10ng/ml,R&D Systems)、PDGF(人重组血小板衍生生长因子，10ng/ml,Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)、鸡胚提取物(0.3％,GIBCO,Baltimore,MD，超滤过的)和牛血浆纤连蛋白(5ug/ml,Sigma,St.Louis,MO)的DMEM/F-12组成的生长培养基中。
对于逆转录病毒感染，采用LINX v-myc载体(Hoshimaru等，美国国家科学院院刊931518-1523,1996；Sah等Nature Biotechnol。15574-580，1997)。在该系统中，当四环素不存在时，四环素控制的反式激活蛋白(tTA)强烈地激活从phCMV-1的转录，导致下游v-myc癌基因的表达。四环素(0.01-1.0ug/ml)几乎完全消除了tTA的转录激活作用，从而阻断了v-myc癌基因的转录。该载体还存在一个赋予新霉素抗性的基因。采用与Sah等，Nature Biotechnol。 15574-580，1997所述类似的方法，用逆转录病毒感染脊髓培养物，并用G418筛选。
G418筛选后，将培养物维持在由添加了N2补充物、FGF-2(50ng/ml)、EGF(50 ng/ml)、鸡胚提取物(0.3％)和牛血浆纤连蛋白(5ug/ml)的DMEM/F-12组成的简化生长培养基中。接近汇合的培养物通过胰蛋白酶消化并按1∶5分开来进行传代。典型地，一个接近汇合的T75培养瓶可产生107细胞，培养物每3-4天传代一次。
在G418筛选过程中，发生一些细胞死亡；筛选后，在培养物中v-myc+细胞变成主要细胞类型。这些G418抗性的v-myc+细胞以贴壁的单层生长。大多数细胞是多角型，具有很短的突起(
图1A)。
为了分离克隆细胞系，平均取一半细胞接种至96孔板的各孔中。在2000个孔中，有279个孔含有单个集落，按如上所述通过饲养和传代将它们扩大。
大部分的这些单个集落以贴壁的单层生长；仅有4个集落形成松散地附着底物的聚集体(aggregate)。这4个集落命名为HSP1、HSP2、HSP3和HSP4，并进一步扩大。当细胞频繁传代时，所有4个假定的克隆均以贴壁的单层生长；但传代不那么频繁时，形成细胞聚集体。在HSP1中偶尔观察到具有细小神经元突起的细胞。3个假定的克隆(HSP1、HSP2和HSP4)生长良好，用于随后鉴定。
为了进行免疫细胞化学分析，将培养物用甲醇固定，并与第一抗体在封闭缓冲液(PBS,1％正常驴血清，0.1％Triton X-100)中室温孵育2小时，用PBS洗涤，然后在封闭缓冲液中与和荧光素(FITC)或Texas红偶联的物种特异性第二抗体(Jaekson Immunoresearch Laboratories公司，West Grove,PA)于室温再孵育1小时。然后将培养物用PBS洗涤3次，并加盖玻片PVA/DABCO，之后给代表性视野评分和照相。
当细胞在无四环素存在的情况下培养时，通过免疫荧光在HSP1、HSP2和HSP4细胞的细胞核中检测到v-myc癌蛋白(图2，-Tc)。正如所期望的，加入四环素后就检测不到v-myc免疫反应性了(图2，+Tc)。这些结果表明本文所述克隆细胞系以四环素可调控方式表达v-myc。
实施例2条件性无限增殖化人脊髓祖细胞分化成有丝分裂期后神经元本实施例说明逆转录病毒感染的祖细胞分化成神经元。
大批感染的培养物以2×104细胞/em2的密度接种至分化培养基中(含有N2补充物、FGF-2(1-10ng/ml)、鸡胚提取物(0.3％)、天然鼠层粘连蛋白(5 ug/ml)、四环素(1-5ug/ml)和已知增强运动神经元分化的神经营养因子组合[CNTF(10ng/ml)和NGF(100 ng/ml)]的DMEM/F12培养基)。随后将培养基每5天用无FGF-2的分化培养基更新。在48小时内，出现少数具有神经元形态的细胞。在随后的几天内分化神经元的数量增加。这些神经元在胞体周围显示出长的突起(图1B)。这些分化细胞大部分在氟脱氧尿苷(80uM)处理10天后仍不死亡，表明它们是有丝分裂期后细胞。通常，在免疫细胞化学染色之前培养物分化7-14天，在电生理记录之前分化4-20天。
实施例3人脊髓细胞系生长要求本实施例说明生长因子对本文提供的细胞系的影响。
HSP1、HSP2和HSP4细胞系的增殖需要生长因子；FGF-2强烈刺激增殖，而EGF仅在较小程度上增加细胞增殖(图3A)。不象从大鼠脊髓来源的神经元限制性前身细胞(Mayer-Prosehel等，Neuron 19773-785，1997)，HSP1、HSP2和HSP4的生长速率不受NT-3(10ng/ml)存在的影响。FGF-2的生长促进活性的阈值是0.1ng/ml，而最大生长促进活性发生在10ng/ml(图3A和3C)。EGF对增殖的刺激最大在1ng/ml(图3A和3C)。尽管人脊髓细胞系不需要额外的贴壁因子即可贴壁、存活和增殖，但纤连蛋白通过促进细胞贴壁增强细胞增殖(图3B和3D)。纤连蛋白的生长促进作用在3ug/ml达到饱和。
实施例4人脊髓细胞系的特性分析本实施例说明HSP1、HSP2和HSP4细胞系以及由这些细胞系产生的分化细胞的特性分析。
采用免疫细胞化学分析检测神经元标志。将培养物与第一抗体在37℃孵育1小时，然后用甲醇固定。用于免疫细胞化学分析的第一抗体包括抗神经丝200kD(1∶800,Chemicon,Temecula,CA)和神经丝68kD(1∶400,Chemicon,Temecula,CA)的多克隆抗体，和抗MAP2a/b(1∶100，Chemicon,Temecula,CA)、神经丝68kD(1∶40,Sigma,St.Louis,MO)、神经丝160kD(1∶400,Sigma,St.Louis,MO)、神经丝200kD(1∶40,Sigma)、NCAM(1∶1,Manhendra Rao博士惠赠，也可从DevelopmentalStudies Hybridoma Bank获得)和βⅢ微管蛋白(1∶400,Sigma,St.Louis,MO)的单克隆抗体。所有第一抗体均用阳性和阴性对照培养物验证。将培养物与第一抗体在封闭缓冲液(PBS，1％正常驴血清，0.1％TritonX-100)中室温孵育2小时，用PBS洗涤，然后在封闭缓冲液中与和荧光素(FITC)或Texas红偶联的物种特异性第二抗体(JacksonImmunoresearch Laboratories公司，West Grove,PA)于室温再孵育1小时。然后将培养物用PBS洗涤3次，并加盖玻片PVA/DABCO，之后给代表性视野评分和照相。
在增殖状态，90％以上的HSP1、HSP2和HSP4细胞表达神经元标志如神经丝(200和68kD两种)、βⅢ微管蛋白和NCAM(图4)，但缺乏MAP2a/b免疫反应性。神经丝(160kD)免疫反应性在约30％6的HSP1、HSP2和HSP4细胞中以较小的程度存在。在用含有N2补充物、CNTF、NGF、BDNF、鸡胚提取物、层粘连蛋白和四环素(3ug/ml)的DMEM/F12培养基分化后，神经丝(200、160和68kD)和MAP2a/b(图7B)的免疫反应性在细胞质和突起中存在。分化后所有神经丝的细胞分布从细胞质移向突起。而且，分化以后HSP1细胞表达成熟神经元标志如tau、外周蛋白和突触小泡蛋白(图7A、7C和7D)。
这些结果表明在增殖生长状态本文所述神经元限制性前身细胞系表达神经元标志神经丝(160和200kD)、βⅢ微管蛋白和NCAM。已有报道在增殖的脊髓成神经细胞中存在神经丝(200kD)(Ray和Gage，神经科学杂志(J.Neurosci.)143548-3564,1994)。但是，与该文报告的观察不同，从大鼠脊髓来源的具有NCAM免疫反应性的增殖性神经元限制性神经前身细胞并不表达βⅢ微管蛋白或神经丝(160kD)(Mayer-Proschel等，神经元(Neuron)19773-785,1997)。总的来看，这些发现提示人和鼠的神经元限制性前身细胞至少在2个细胞骨架成分方面不同。
增殖后，具有神经元形态的细胞不仅对所有检查的神经元标志显示染色，而且它们还对电流注入发放动作电位(14个细胞中的13个)。采用膜片钳方法的全细胞形式记录电流钳制模式的动作电位。浴槽液是Tyrode氏液(150mM NaCl、4mM KCl、2mM MgCl2、10mM葡萄糖、10mM HEPES，用NaOH调节pH至7.4；加入2mM CaCl2和4mM BaCl2)。用Bralex玻璃(Rochester Scientific，Rochester，NY)拉制吸管(2-4MΩ阻抗)，并充灌含有130mM KCl、5mM MgCl2、10mM HEPES、10mM EGTA、pH用KOH调节至7.4的内液。用Axopatch 200A膜片钳放大器和BASIC-FASTLAB界面系统(INDEC Systems，Capitola，CA)记录动作电位。图5显示在分化4天后HSP1细胞中动作电位的一个例子；在电流钳制模式下，150毫秒、140皮安的电流脉冲引起一个峰值达+61mV的动作电位。
为确定HSP1、HSP2和HSP4是否能产生神经胶质细胞，在用含有N2补充物、CNTF、NGF、BDNF、鸡胚提取物、层粘连蛋白和四环素(3ug/ml)的DMEM/F12培养基分化后，将培养物对星形胶质细胞(GFAP)和少突神经胶质细胞(01、04和GalC)标志染色。免疫细胞化学分析按如上所述进行，只是第一抗体是抗谷氨酸的多克隆抗体(1∶15,000.Sigma,St.Louis,MO)和抗04(Manhendra Rao博士惠赠，也可从Chemicon,Temecula,CA获得)、01(1∶5，Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)和GalC(Manhendra Rao博士惠赠，也可从Chemicon,Temecula,CA,和Sigma,St.Louis,MO获得)的单克隆抗体。仅有HSP2产生了显示GFAP免疫反应性的细胞(＜0.1％的细胞，图6A)，它们不与A2B5或神经丝200 kD免疫反应性处在相同位置(图6B-D)。在这些条件下，用免疫细胞化学在任何细胞系中均没有检测到少突神经胶质细胞标志(01、04和Ga1C)。即使加入在CNS干细胞中强烈促进少突神经胶质细胞分化(Lachyankar等，Exp.Neurol.144350-360，1997)的CNTF和NT-3分化培养基，也没有导致少突神经胶质细胞标志表达。
将HSP1和HSP4在5％胎牛血清存在时分化，以确定在这些条件下这些细胞系能否诱导分化成星形胶质细胞。事实上，在用四环素加5％胎牛血清分化3天后没有细胞存活，表明该人脊髓细胞系对血清的反应方式与来源于大鼠脊髓的神经元限制性前身细胞类似。
人脊髓细胞系分化成多种类型的脊髓神经元(包括运动神经元)，并表达不同兴奋性和抑制性神经递质。为了检查从本文所述细胞系获得的神经元亚群，用免疫荧光法检查培养物的谷氨酸、GABA、胆碱转乙酰酶(ChAT)、NGFR和Islet-1。将培养物在3％蔗糖溶液中用1％戊二醛固定，用于免疫碱性磷酸酶法检测谷氨酸和GABA(Li等，内分泌(Endocrine)5205-217,1996)。ChAT用APAAP法检测；简要地说，在与抗ChAT的抗体在4℃孵育过夜后，将培养物和抗鼠IgG(Jackson ImmunoresearchLaboratories公司，West Grove,PA,1∶2000)孵育1小时，之后在37℃与APAAP(Sigma,St.Louis,MO,1∶40)孵育1小时。采用NTB/BCIP(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)或固红(Sigma,St.Louis,MO)作为碱性磷酸酶的底物。用于免疫细胞化学的第一抗体包括抗谷氨酸(1∶15,000,Sigma,St.Louis,MO)和GABA(1∶1000,Chemicon,Temecula,CA)的多克隆抗体以及抗胆碱转乙酰酶的单克隆抗体(1∶5,Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)。
乙酰胆碱合成酶ChAT(为运动神经元谱系所特有)的免疫反应性在23±9％的分化HSP1神经元中检测到(图8D和9)，这与运动神经元的表型一致。NGFR和Islet-1免疫反应性的存在(图8)进一步证实了运动神经元的表型。HSP1分化后，在所有神经元中都检测到谷氨酸免疫反应性，而与中间神经元表型一致的GABA免疫反应性在45.6％神经元中存在(图7)。这些结果表明，从人脊髓来源的神经元限制性前身细胞系对于检查指导脊髓神经元特定亚群分化的外部和内部信号是有用的。而且，这些结果证明，这些无限增殖化人脊髓细胞系能分化成运动神经元。
由以上阐述可以理解，尽管本文给出了本发明具体实施方案用于阐述目的，但也可进行各种修改而不脱离本发明的主旨和范围。
权利要求
1．产生条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞的方法，其包括(a)用编码选择标记和可外部调节性生长促进基因的DNA转染接种在允许增殖的第一表面上和第一生长培养基中的人脊髓细胞；和(b)在允许贴壁和增殖的第二表面上和第二生长培养基中筛选转染细胞，并由此产生条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞。
2．权利要求1的方法，其中第一和第二表面独立地选自含有聚氨基酸、纤连蛋白、层粘连蛋白或组织培养塑料之一或多种的基底。
3．权利要求1的方法，其中生长促进基因是癌基因。
4．权利要求3的方法，其中癌基因是v-myc。
5．权利要求1的方法，其中生长促进基因的表达被四环素抑制。
6．能分化成神经元的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞。
7．根据权利要求6的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞，其中所述细胞还能分化成运动神经元。
8．产生神经元的方法，其包括在抑制生长促进基因表达的条件下培养根据权利要求1产生的细胞。
9．根据权利要求8的方法，其中所述细胞培养在含有四环素的培养基中。
10．根据权利要求8的方法，其中所述细胞在一种或多种分化剂存在下培养。
11．根据权利要求10的方法，其中分化剂选自NGF、CNTF和BDNF。
12．根据权利要求8的方法产生的神经元。
13．根据权利要求8的方法产生的运动神经元。
14．根据权利要求1或权利要求8的方法产生的细胞，用于制备将人脊髓细胞移植至哺乳动物的药物。
15．根据权利要求1或权利要求8的方法产生的细胞，用于制备治疗患者脊髓相关疾病的药物。
16．根据权利要求15的细胞，其中所述疾病选自疼痛、脊髓损伤、运动神经元疾病和髓鞘形成相关疾病。
17．筛选调节人脊髓细胞产生的蛋白质活性的因子的方法，其包括(a)用候选因子接触根据权利要求1或权利要求8的方法产生的细胞；和(b)随后测定候选因子调节该细胞产生的蛋白质活性的能力。
18．检测样品中某种蛋白质存在与否的方法，其包括(a)用根据权利要求1或权利要求8的方法产生的细胞接触样品；和(b)随后检测细胞中的反应，并由此检测样品中该蛋白质的存在。
19．鉴定人脊髓基因或蛋白的方法，其包括在根据权利要求1或权利要求8的方法产生的细胞培养物中检测基因或蛋白的存在。
20．筛选影响人脊髓细胞死亡的因子的方法，其包括(a)在当缺乏候选因子时导致细胞死亡的条件下，用候选因子接触根据权利要求1或权利要求8的方法产生的细胞；和(b)随后测定候选因子影响该细胞死亡的能力。
21．筛选调节人脊髓细胞死亡的蛋白的方法，其包括(a)在根据权利要求1或权利要求8产生的细胞中改变某蛋白质的表达水平；和(b)随后测定这种改变对该细胞死亡的影响，由此鉴定调节人脊髓神经前身细胞死亡的蛋白。
22．根据权利要求1产生的条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞。
23．根据权利要求22的细胞，其中该细胞存在于一个克隆细胞系中。
全文摘要
本发明提供条件性无限增殖化人脊髓神经前身细胞系。这种细胞系可是克隆细胞系,可用于产生神经元包括运动神经元。该细胞系和/或分化细胞可用于开发预防和治疗各种脊髓相关疾病和损伤的治疗剂。该细胞系和/或分化细胞也可用于各种分析和脊髓细胞发育与分化的分析和一般研究。
文档编号C12N15/12GK1297477SQ99805214
公开日2001年5月30日 申请日期1999年3月2日 优先权日1998年3月2日
发明者李荣皓, D·W·Y·萨 申请人:信号药物公司