专利名称：人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞系及其制备方法
技术领域：
本发明属微生物动物细胞系领域，涉及一种人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞系及其制备方法，尤其涉及一种人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株MCF-7H。
背景技术：
缺氧是包括乳腺癌在内的恶性实体瘤发展过程中普遍存在的现象。缺氧会导致一部分肿瘤细胞死亡形成坏死灶，但大部分肿瘤细胞仍然可以生长。为了适应或克服缺氧环境，肿瘤组织内部会发生一系列生物化学和病理学的改变，称之为缺氧反应，主要包括无氧代谢增加、细胞凋亡抑制、新生血管形成、肿瘤局部浸润和转移能力增强等。目前认为缺氧反应是通过缺氧诱导因子HIF-I来启动和调节的，其下游基因包括碳酸酐酶CA-IX、葡萄糖转运蛋白GLUT-1、促红细胞生成素ΕΡ0、血管内皮生长因子VEGF、金
属蛋白酶MMP、转化生长因子TGF- α等，从而形成一系列由HIF-I介导的缺氧反应调控通路。有关临床研究结果显示，缺氧与乳腺癌复发转移和患者不良预后密切相关，乳腺癌复发和转移的根源则可主要归咎于耐药。耐药机制是目前肿瘤研究中的热点课题之一，而肿瘤中缺氧环境的存在则可能在诱导肿瘤产生耐药过程中发挥一定作用。已有大量基础研究数据表明，缺氧环境下的肿瘤细胞对化疗、放疗均不敏感；但是至今为止，国际上尚无稳定的乳腺癌缺氧细胞系存在，而乳腺癌缺氧相关研究的必要前提则是缺氧细胞系的建立。Kurebayashi等于2001年报道了体外急性缺氧可使人乳腺癌细胞系ER-α的表达呈时间依赖性下调，并在恢复供氧后的一至两周内逐渐恢复到原来水平，同时缺氧还可抑制ER_a下游基因PR的转录。但是，由于新生血管的形成，因血管完全阻塞所造成的急性缺氧并不常见，相反，慢性间歇性缺氧则因肿瘤内部各区域的氧供水平多处于波动状态而广泛存在。在2004年Cooper等发现慢性间歇性缺氧环境对人乳腺癌细胞系MCF-7中ER- α
表达的抑制作用与急性缺氧相比更为持久，并在人乳腺癌组织中发现ER- α下调与肿瘤坏
死灶的发生以及缺氧反应标志蛋白HIF-I α、CA-IX和GLUT-I的高表达有关。由于慢性间歇性缺氧细胞系更接近人体内实际的缺氧环境，因此若采用慢性间歇性缺氧细胞系进行研究相较急性缺氧细胞系而言更能真实反映人体内缺氧对细胞生物学行为的影响及其相关作用机制。虽然Cooper等所作的研究是以人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞系为载体，但尚存在以下缺陷
I.缺氧处理时间过短。Cooper等报道的缺氧细胞系仅经历了 3个缺氧周期，其中每个缺氧周期包括64小时的缺氧阶段和8小时的恢复供氧阶段。而在结束3个缺氧周期后，即将细胞置于正常供氧环境。Cooper等研究表明，与缺氧处理时相比，该细胞系在正常供氧I天后即恢复ER- α表达，其HIF-I α的表达却消失殆尽。这一现象可从侧面反映短短3个
周期的缺氧处理并不能建立生物学特性相对稳定的慢性间歇缺氧细胞系。2.缺乏体内实验支持。虽然Cooper等通过体外实验培养出慢性间歇性缺氧细胞系，但该细胞系是否能在裸鼠体内存活并保留原有缺氧环境下的生物学特性却并无证据支持。因此，目前，国际上尚无稳定的乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞系及其体内实验(如将慢性间歇性缺氧细胞系种植入裸鼠体内)的研究报道。鉴于此，目前慢性间歇性缺氧细胞系的培养现状远不能满足缺氧相关研究的需求。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞系及其制备方法，尤其涉及一种人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株MCF-7H。本发明慢性间歇性缺氧细胞系能够弥补现有缺氧研究载体的弊端，更能真实反映人体内实际的缺氧环境对人乳腺癌细胞生物学特性的影响，从而提高缺氧相关研究的质量水平。本发明提供了一种人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株，本发明中称为MCF-7H。本发明采用人乳腺癌细胞系MCF-7作为建系来源(称为源细胞系)，通过慢性间歇性缺氧的体外培养方式进行传代，建成稳定生长的慢性间歇性缺氧细胞系，获得人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株MCF-7H。本发明中，将所述的人乳腺癌细胞系MCF-7，采用RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清、100IU/ml青霉素及100 μ g/ml链霉素进行培养；将上述细胞依次经历64小时的缺氧阶段和8小时的正常供氧阶段，培养持续两个月以上，得到稳定生长的慢性间歇性缺氧人乳腺癌细胞株MCF-7H，已于2011年5月20日保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCCNo. 4902，分类命名人乳腺癌细胞，MCF-7H。所述的人乳腺癌MCF-7细胞株来源于69岁高加索女性的胸腔积液转移性腺癌细胞，ATCC号HTB-22，由复旦大学附属肿瘤医院自ATCC购入。本发明，缺氧阶段是指将上述培养的人乳腺癌细胞系MCF-7细胞放置在37°C密闭的缺氧培养室中，该缺氧培养室中95% N2和5% CO2的混合气体，氧含量控制在0. 02% 0. 5%的范围。本细胞株具有以下生物学特征和遗传学特征
能在体外长期生长和稳定传代，该细胞株体外培养生长良好，每3天传代一次；MCF-7H细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，胞浆丰富，贴壁生长，接触性生长抑制消失，但与源细胞在形态上无明显差异(如图I所示)；本细胞株倍增时间约为8小时，而源细胞的倍增时间约为27小时，后者与ATCC提供的数据相符。CCK-8法描记的细胞生长曲线提示，MCF-7H细胞的增殖速度较源细胞明显加快(P < 0. 05 ;如图2所示);Transwell侵袭试验的结果证实，MCF-7H较源细胞有更强的侵袭能力(P < 0.05 ;如图3所示^Western blot结果表明，MCF-7H细胞缺氧反应调控通路中的FIH-1、HIF-I α和CAIX蛋白表达水平明显上调(如图4所示)。体内试验结果显示，将本发明细胞株与源细胞分别接种至裸小鼠左侧第二乳头的脂肪垫后，虽然两组成瘤率无明显差异，但是本发明细胞株所成移植瘤的增长速度较源细胞组明显加快(P < O. 05;如图5所示)。免疫组化结果显示，本发明细胞株所成移植瘤的FIH-UHIF-I α和CAIX蛋白表达水平仍持续上调。
本发明的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞系，具有与源细胞遗传背景相同、增殖速度快、侵袭能力强的特点，能再现人体内实际的缺氧环境下所产生的人乳腺癌细胞系，能弥补现有缺氧研究载体的弊端，更能真实反映人体内实际的缺氧环境对人乳腺癌细胞生物学特性的影响，为理想可靠的研究模型，适用于在体内、体外的缺氧相关研究，从而提高缺氧相关研究的质量水平，具有重要的基础研究与临床应用价值。
图I是本发明的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞系与正常供氧人乳腺癌细胞系(源细胞系)体外增殖能力的比较图，
其中显示培养的10 -7!1细胞，400\ ;呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，胞衆丰富，贴壁生长。图2是本发明的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞MCF-7H与MCF-7源细胞体外增殖能力的比较。图3是本发明的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞MCF-7H与MCF-7源细胞体外侵袭能力的比较。图4是本发明的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞MCF-7H与MCF-7源细胞缺氧反应调控通路表达的比较。图5是本发明的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞MCF-7H与MCF-7源细胞所成移植瘤增殖能力的比较。
具体实施例方式实施例I建立MCF-7H细胞系
采用人乳腺癌细胞系MCF-7作为源细胞，采用慢性间歇性缺氧的体外培养方式进行传代，建成稳定生长的慢性间歇性缺氧细胞系，获得人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株MCF-7H，已于2011年5月20日保藏，保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No. 4902，分类命名人乳腺癌细胞，MCF-7H。本实施例中，将所述的源细胞人乳腺癌细胞系MCF-7，采用RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清、100IU/ml青霉素及100 μ g/ml链霉素进行培养；依次经历64小时的缺氧阶段和8小时的正常供氧阶段，培养持续两个月以上，得到稳定生长的保藏编号为CGMCCNo. 4902的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株MCF-7H。所述的缺氧阶段是指将上述培养的人乳腺癌细胞系MCF-7细胞放置在37°C密闭的缺氧培养室中，该缺氧培养室中95% N2和5% C02的混合气体，氧含量控制在O. 02% O. 5%的范围。
实施例2人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株MCF-7H体内、外培养、实验本发明的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株MCF-7H进行体外培养结果显示，所述细胞株具有以下生物学特性体外培养生长良好，每3天传代一次；细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，胞浆丰富，贴壁生长，接触性生长抑制消失，与源细胞在形态上无明显差异(如图I所示);细胞株倍增时间约为8小时，而源细胞的倍增时间约为27小时，CCK-8法描记的细胞生长曲线提示，MCF-7H细胞的增殖速度较源细胞明显加快(P < O. 05;如图2所示);TranSWell侵袭试验的结果证实，MCF-7H较源细胞有更强的侵袭能力(P < O. 05 ;如图3所示);Western blot结果表明，MCF-7H细胞缺氧反应调控通路中的FIH-I、HIF_1 α和CAIX蛋白表达水平明显上调(如图4所示)。
体内试验结果显示，将本发明细胞株与源细胞分别接种至裸小鼠左侧第二乳头的脂肪垫后，虽然两组成瘤率无明显差异，但是本发明细胞株所成移植瘤的增长速度较源细胞组明显加快(P < O. 05;如图5所示)；免疫组化结果显示，本发明细胞株所成移植瘤的FIH-UHIF-I α和CAIX蛋白表达水平仍持续上调。
权利要求
1.ー种人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株，其特征在于，所述的细胞株为人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株MCF-7H，保藏编号=CGMCC No. 4902，分类命名人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株，MCF-7H。
2.按权利要求I所述的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株，其特征在于，所述的细胞株具有以下生物学特征和遗传学特征能在体外长期生长和稳定传代，细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，胞浆丰富，贴壁生长，接触性生长抑制消失，与源细胞形态无差异；细胞株倍増时间为8小时，细胞的増殖速度较源细胞快，侵袭能力较源细胞强，细胞缺氧反应调控通路中的FIH-I、HIF-I α和CAIX蛋白表达水平上调。
3.按权利要求I所述的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株，其特征在于，所述的细胞株MCF-7H的源细胞为人乳腺癌MCF-7细胞，ATCC号ΗΤΒ_22。
4.按权利要求I所述的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株，其特征在于，所述的细胞株MCF-7H的成瘤能力与MCF-7源细胞无明显差异，成移植瘤的生长速度较MCF-7源细胞加快，同时其缺氧反应调控通路的表达仍持续上调，能再现人体内实际的缺氧环境下所产生的人乳腺癌细胞系。
5.权利要求I所述的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株的制备方法，其特征在于，采用慢性间歇性缺氧的体外培养方式进行传代，建成稳定生长的慢性间歇性缺氧细胞株，包括以下步骤 将所述的人乳腺癌细胞系MCF-7，采用RPMI-1640培养基添加10%胎牛血清、100IU/ml青霉素及100 μ g/ml链霉素进行培养；将上述细胞依次经历64小时的缺氧阶段和8小时的正常供氧阶段，培养持续两个月以上，得到稳定生长的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株MCF-7H ； 其中，缺氧阶段是指将上述细胞放置在37°C密闭的缺氧培养室中，其中95% N2和5%C02的混合气体，氧含量为O. 02% O. 5%。
6.权利要求I的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株细胞株在制备人体内缺氧环境下的人乳腺癌细胞系中的用途。
全文摘要
本发明属微生物动物细胞系领域，涉及人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞系。本发明以人乳腺癌细胞系MCF-7为源细胞，用慢性间歇性缺氧体外培养传代，获得稳定生长的人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株MCF-7H，保藏编号CGMCC No.4902，分类命名人乳腺癌慢性间歇性缺氧细胞株，MCF-7H。该细胞呈多极形上皮形态特征，聚集成片或团簇状，增殖速度快，侵袭能力增强，缺氧反应调控通路的表达上调；成瘤能力与源细胞系无明显差异，所成移植瘤的生长速度快，同时缺氧反应调控通路的表达仍持续上调，能再现人体内实际的缺氧环境下所产生的人乳腺癌细胞系，为较理想可靠的体内、外缺氧相关研究模型。
文档编号C12R1/91GK102827811SQ20111015831
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月14日 优先权日2011年6月14日
发明者邵志敏, 柳光宇, 殷文瑾, 雷莉, 罗建民, 欧周罗, 吴炅, 沈镇宙 申请人:复旦大学附属肿瘤医院