一种乳腺癌体外三维细胞模型的建立及其在药物耐药机制、逆转剂筛选研究中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种乳腺癌体外三维细胞模型的建立及其在药物耐药机制、逆转剂筛选研究中的应用。运用“3D no base and embedded”方法将一定量的人乳腺癌MCF-7细胞种植在Millicell细胞培养小室上，通过培养形成厚度约为40μm，层数达到10～12层的人乳腺癌MCF-7细胞的三维多层细胞模型。在MCF-7多层细胞模型上单用及联用P-GP抑制剂LY335979对化疗药物阿霉素的转运动力学及摄取行为考察证明其在培养过程中发生耐药现象；并将其应用于阿霉素耐药逆转剂人参皂苷20(S)-Rh2的筛选。
【专利说明】一种乳腺癌体外三维细胞模型的建立及其在药物耐药机制、逆转剂筛选研究中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及肿瘤体外模型【技术领域】，具体涉及一种乳腺癌体外三维细胞模型的建立及其在药物耐药机制、逆转剂筛选研究中的应用。
【背景技术】
[0002]单层细胞模型作为现今主流的体外研究模型，却存在着与在体实体瘤很大的差异，直接导致了药物筛选与预测的失败。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，可用于研究细胞与细胞之间、细胞与细胞基质之间的相互作用及肿瘤微环境对于细胞分化、增殖、凋亡及基因表达的影响。它与传统的二维平面细胞培养相比，能够更真实的模拟实体瘤的结构，弥补了体外细胞培养与在体研究的差异。
[0003]现有的三维细胞模型包括多层细胞模型(multicellular layers, MCL)及多球体细胞模型(multicellular spheroid, MCS)。常用的培养方法包括自发性细胞聚集、基质涂布培养、转瓶法、支架辅助培养法、旋转细胞生物反应器等。多层细胞模型与球体细胞模型相比，能够直接定量的测定药物的转运动力学行为而不受药物需要荧光标记的限制等优点。运用三维多层细胞模型来研究药物的转运、分布特征，为新药筛选、抗肿瘤药物的新机制研究提供指导作用。
[0004]多药耐药(MDR)往往是导致临床化疗治疗失败的主要原因之一。MDR有两种不同的表型，一种是对第一次化疗就产生耐药，称天然性耐药(Natural resistance)或称内源性耐药(Intrinsic resistance);另一种是在化疗过程中产生耐药,故称获得性耐药(Aquired resistance)。与单层细胞相比,肿瘤细胞培养形成多细胞三维模型时,往往表现的更为耐药，此现象又被称为“多细胞耐药(Mult1-cellular resistance)”。这一现象发生的机制是多方面的，包括药物转运外排泵的高表达而导致细胞动力学改变；细胞周期的改变；抗凋亡作用；一些生长因子及蛋白的高表达；缺氧或PH值低等肿瘤微环境的改变。
[0005]近年来国内外对天然药物逆转肿瘤耐药的研究取得了一定的进展，一些植物多酚、黄酮、萜类等成分都具有逆转肿瘤耐药的功效。中药逆转肿瘤耐药具有毒副作用小，作用靶点多，在逆转肿瘤耐药的同时，往往还具有直接抗肿瘤、调节免疫功能等多种活性，更能从多角度综合治疗肿瘤，提高化疗的整体治疗水平。因此，从传统中药中筛选出活性成分开发成肿瘤化疗增敏剂，具有很好的临床开发前景。人参皂苷20 (S)-Rh2是由日本学者Kitagawa在1983年首次从红参中分离得到并确定分子式的，含量极低，提取率仅为
0.001%。20 (S)-Rh2具有达玛烷结构，属于原人参二醇型皂苷。前期实验研究结果表明人参皂苷20(S)-Rh2为外排转运体P-GP的非竞争性抑制剂。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是建立一种人乳腺癌三维细胞模型，证明其在培养过程中发生耐药，基于该模型对抗肿瘤药物的转运动力学进行研究，并将其应用于耐药逆转剂的筛选。运用“3D no base and embedded”方法将一定量的人乳腺癌MCF-7细胞种植在Millicell细胞培养小室上，通过培养形成厚度约为40 μ m，层数达到10?12层的人乳腺癌MCF-7细胞的三维多层细胞模型。在MCF-7单层细胞上，单用阿霉素组及联用P-GP特异性抑制剂LY335979组的转运动力学曲线及阿霉素的药物摄取量并没有差异。而在MCF-7多层细胞上，联用P-GP特异性抑制剂LY335979组转运曲线明显低于单用阿霉素组，并且多层细胞对于阿霉素的摄取量显著性减少并被LY335979有效逆转。上述结果证明多层细胞培养过程中发生耐药。进一步，将构建的MCF-7多层细胞运用于阿霉素耐药逆转剂人参皂苷20(S)-Rh2的筛选，联用20(S)-Rh2组与单用阿霉素组相比，转运曲线明显降低且对阿霉素的摄取量显著性增加。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1 ;人参皂苷20(S)_Rh2的结构式。
[0008]图2 ；A, MCF-7单层细胞HE染色形态图。B，MCF-7多层细胞HE染色形态图。
[0009]图3 ;A，阿霉素联用LY335979在MCF-7单层细胞转运动力学曲线。B，阿霉素联用LY335979在MCF-7多层细胞转运动力学曲线。C，阿霉素联用LY335979在MCF-7单层细胞及多层细胞上的摄取。
[0010]图4 ;A，阿霉素联用人参皂苷Rh2在MCF-7多层细胞转运动力学曲线。B，阿霉素联用人参皂苷20 (S)-Rh2在MCF-7多层细胞上的摄取。
【具体实施方式】
[0011]实施例1:构建乳腺癌MCF-7三维多层细胞转运模型
[0012]实验材料:
[0013]人乳腺癌细胞MCF-7细胞由天津血液病研究所提供，于37°C，5% CO2条件下常规培养，培养基为含10%小牛血清(PAA)的RPMI1640 (Gibeo)。胎牛血清(Fetal bovineserum)购于 Hyclone (Logan, Utah, USA);膜蛋白酶(Trypsin)购于 Amersco (Solon,Oh1, USA);青霉素、链霉素购于南京生兴生物工程公司(江苏)；Matrigel购于BDB1sciences (USA), Millicell 细胞培养小室购于 Millipore (Merck Millipore, USA).盐酸阿霉素粉末(纯度> 99% )购于南京盛林化工(江苏)；LY335979购于SelleckChemicals(USA);人参皂苷20 (S)-Rh2 (纯度> 98% )购自吉林大学药学院有机化学教研室(吉林，中国)。
[0014]实验方法:
[0015]MCF-7细胞消化、计数，用含6% Matrigel的预冷无血清RPMI1640培养基重悬细胞。以2*105 cells/孔的密度接种于24孔Millicell细胞培养小室中。冰上静置30min后放入37°C ,5% CO2的孵箱中培养4h。待胶液凝固后，内外室分别补加400ul及600ul 10%含血清的RPMI1640培养基继续培养十天，并隔天换液。
[0016]实施例2:构建乳腺癌MCF-7单层细胞转运模型
[0017]实验材料:同实施例一
[0018]实验方法:
[0019]MCF-7细胞消化、计数，用10 %含血清的RPMI1640培养基重悬细胞。以2*105cells/孔的密度、400ul的体积接种于24孔Millicell细胞培养小室内室中。外室补加600ull0%含血清的RPMI1640培养基继续培养至细胞形成致密单层，并隔天换液。
[0020]实施例3:转运动力学及摄取实验[0021 ] 实验材料:同实施例一
[0022]实验方法:
[0023]1.MCF-7多层细胞转运模型及单层细胞转运模型构建方法同实施例1及实施例2中的实验方法
[0024]2.转运动力学实验
[0025]Millicell细胞培养小室辅助培养的MCF-7多层细胞及单层细胞培养成熟后，细胞培养小室用PBS液清洗两次。上、下室分别加入400ul、600ul Hank’s平衡盐溶液(HBSS) 37 °C平衡lOmin。分为三组进行预给药:0.1 % DMSO组；LY335979 (I μ M)组及20(S)-Rh2(10yM)，37°C温孵lh。撤去上室的预给液后，上室分三组进行给药=ADR(1yM)单用组，ADR(1yM)与 LY335979 (I μ M)联用组及 ADR (10 μ Μ)与 20 (S)-Rh2 (10 μ Μ)联用组给药体积均为400111。371:摇床温孵不同时间(15，30，45，60，9011^11)，取下室耶55液100111，并及时补齐下室体积，保持转运过程中下室体积不改变。采用直接沉淀蛋白法提取样品，用LC-MS/MS(AB Science, USA)进行浓度测定。
[0026]3.摄取实验
[0027]转运终点(90min)时，取出Millicell细胞培养小室的中层插片，用Iml超纯水刮取细胞，反复冻融三次，定量取出lOOul，采用直接沉淀蛋白法提取样品，用LC-MS/MS(ABScience, USA)进行浓度测定。并用Bradford法定蛋白进行蛋白校准。
【权利要求】
1.一种体外人乳腺癌MCF-7三维多层细胞模型，其特征在于:运用“3D no base andembedded”方法将一定量的人乳腺癌MCF-7细胞种植在Millicell细胞培养小室上，通过十天的培养形成厚度约为40 μ m，层数达到10?12层的人乳腺癌MCF-7细胞的三维多层细胞模型。
2.如权利要求1所述的体外人乳腺癌MCF-7三维多层细胞模型对抗肿瘤药物的转运动力学及摄取行为的评价，其特征在于:多层细胞在培养过程中发生耐药。
3.如权利要求2所述的体外人乳腺癌MCF-7三维多层细胞模型的转运动力学及摄取研究在抗肿瘤药物耐药逆转剂筛选的应用，其特征在于:联用耐药逆转剂组与单用抗肿瘤药物组相比，转运曲线明显降低且对抗肿瘤药物的摄取量显著性增加。
【文档编号】C12Q1/02GK104232584SQ201410471270
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】王广基, 张经纬, 鲁萌, 周芳 申请人:中国药科大学