专利名称：高转移人乳腺癌细胞系及其建立方法
技术领域：
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种具有高自发性肺转移特性的人乳腺癌细胞系的建立及其建立方法。
背景技术：
乳腺癌是危害女性身心健康的主要疾病之一。在西方发达国家和我国经济发达地区，其业已成为女性最常见的恶性肿瘤。随着乳房钼靶X线摄片的推广和女性对乳腺癌防范意识的加强，越来越多的患者得以在乳腺癌的早期发现。各种辅助治疗的应用使得乳腺癌患者的局部复发率和长期生存率都有了不同程度的改善。尽管如此，肿瘤的远处转移仍是其治疗失败的主要原因之一。仅在美国，每年就有4.5万名乳腺癌患者因肿瘤远处转移而死亡。因此，加强对乳腺癌细胞转移机制的研究，将有助于进一步提高乳腺癌的治疗水平。
在有关乳腺癌浸润、转移的研究中，MDA-MB-435是较为常用的人乳腺癌细胞株。文献报道，裸鼠乳腺脂肪垫原位接种该细胞4周、8周和12周时，鼠肺的转移率分别是30％、70％和100％。由此可见，虽然该细胞株最终可以有较高的肺转移率，但需较长的实验周期和较高的实验投入，故其在此领域的研究中具有较大的局限性，制约了对乳腺癌转移机制作更为深入地探讨。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高自发性肺转移表形的人乳腺癌细胞系及其建系方法。
本发明采用MDA-MB-435细胞株作为建系的源细胞，通过裸鼠体内连续筛选的方法，建立了一种具有高自发性肺转移表形的人乳腺癌细胞系，命名为MDA-MB-435HM。与MDA-MB-435细胞相比，本细胞系具有以下特点细胞为亚三倍体核型，染色体数目50-52条；S期细胞的比例提高了15％；其浸润、迁徙能力是MDA-MB-435细胞的2倍；裸鼠原位移植瘤模型提示，本细胞还具有成瘤率高，肺转移时间早，转移灶数目多的特点。8000点基因芯片的检测结果显示，两者存在60种基因表达差异。
本发明通过下述方法和步骤建立高自发性肺转移的人乳腺癌细胞系。
1.按常规方法建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，将人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞悬液接种于裸鼠乳腺建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型。
2.筛选肺转移细胞，于体外进行肺转移灶细胞扩增，培养液为DMEM/F12(GIBCOBRL，Grand Island，NY，USA)加10％(V/V)胎牛血清(Hyclone，Utah，USA)。37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度培养。将培养所得的细胞按步骤1接种于裸鼠乳腺脂肪垫，按步骤2行体外扩增，同法重复4-6轮筛选。
3.建立细胞系，将筛选所得的肺转移细胞行体外培养，培养条件同上。隔天更换培液，每4天传代一次，常规冻存后，复苏，建立具有高自发性肺转移的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435HM(MDA-MB-435 highmetastasis)。
经常规系列实验检测，本发明的细胞系具有以下特点
1.一般生物学特性表明，该细胞系外形呈梭型，贴壁生长，接触性生长抑止丧失，亚三倍体核型，染色体数目50-52条，细胞群体倍增时间约44小时。流式细胞检测结果表明，细胞各时相的百分率分别是凋亡细胞1.43％，G0-G1期43.44％，S期56.11％，G2-M期0.45％。体外侵袭实验显示，其浸润、迁徙能力是MDA-MB-435的2倍。
2.成瘤性与转移性检测表明，1×106细胞(0.1ml)接种于裸鼠乳腺脂肪垫的成瘤率是100％，成瘤潜伏期＜7天。肿瘤生长迅速，至接种42天后，肿瘤体积平均可达1002.3mm3。接种4周时，其鼠肺转移率即可达100％。6周时，转移灶中位数为37个/肺。
3.8000点基因芯片(由联合基因公司提供)的检测结果显示，与MDA-MB-435相比，其有60种基因的表达水平发生改变。表1是基因芯片检测结果。
结果表明，本发明细胞系具有成瘤率高、转移时间早、转移数目多的特点，是一种更为理想的乳腺癌转移研究模型，其在揭示乳腺癌的转移机制和抗转移药物筛选的应用中将有着广阔的前景。
表1Genbank_IDDefinitionAverage_RatioHomo sapiens carbonic anhydrase VIIINM_004056 (CA8)，mRNA 0.130Homo sapiens frizzled(Drosophila)NM_003507 homolog 7(FZD7)，mRNA0.233Homo sapiens，slug(chicken homolog)，zinc finger protein，clone MGC10182BC014890 IMAGE3908245，mRNA，complete cds 0.248Homo sapiens follistatin(FST)，NM_006350 transcript variant FST317，mRNA 0.261Homo sapiens ectonucleotidepyrophosphatase/phosphodiesterase 2NM_006209 (autotaxin)(ENPP2)，mRNA 0.273Homo sapiens mRNA；cDNA DKFZp547J2313AL512688 (from clone DKFZp547J2313) 0.301Homo sapiens glutaminyl-peptidecyclotransferase(glutaminyl cyclase)NM_012413 (QPCT)，mRNA 0.311
Homo sapiens mRNA；cDNA DKFZp434P0721AL133623 (from clone DKFZp434P0721)；partial cds 0.340Homo sapiens phosphoribosylNM_002765 pyrophosphate synthetase 2(PRPS2)，mRNA 0.344Homo sapiens hypothetical proteinNM_015680 (CGI-57)，mRNA0.374D86982 Human mRNA for KIAA0229 gene，partial cds 0.374Homo sapiens ariadne (Drosophila)nomolog，ubiquitin-conjugating enzymeNM_005744 E2-binding protein，1(ARIH1)，mRNA0.391Homo sapiens mRNA；cDNA DKFZp586F1924AL117657 (from clone DKFZp586F1924)0.395Homo sapiens Fanconi anemia，NM_004629 complementation group G(FANCG)，mRNA 0.404Homo sapiens ATPase，H+ transporting，lysosomal(vacuolar proton pump)，betapolypeptide，56/58kD，isoform 2(ATP6B2)，NM_001693 mRNA 0.412Homo sapiens YEAF1 mRNA for YY1 and E4TF1AB029551 associated factor 1，complete cds 0.430Homo sapiens chimerin(chimaerin) 1NM_001822 (CHN1)，mRNA 0.439Homo sapiens，clone IMAGE3947276，mRNA，BC004538 partial cds 0.457Homo sapiens nucleolar protein(KKE/DNM_006392 repeat)(NOP56)，mRNA 0.466Homo sapiens mRNA for KIAA1902 protein，AB067489 partial cds 0.480Homo sapiens ribosomal protein S7(RPS7)，NM_001011 mRNA 0.482Homo sapiens high-mobility group(nonhistone chromosomal)protein 14NM_004965 (HMG14)，mRNA 0.489Homo sapiens DKFZp564J157 proteinNM_018457 (DKFZP564J157)，mRNA 2.113Homo sapiens KIAA1094 protein(KIAA1094)，NM_014908 mRNA 2.116Homo sapiens hypothetical protein MGC5576NM_024056 (MGC5576)，mRNA 2.117Homo sapiens hypothetical proteinNM_018046 FLJ10283(FLJ10283)，mRNA 2.135Homo sapiens mRNA；cDNA DKFZp586K1922AL110204 (from clone DKFZp586K1922)2.178Homo sapiens sparc/osteonectin，cwcv andkazal-like domains proteoglycanNM_004598 (testican)(SPOCK)，mRNA 2.233Homo sapiens T cell activation，increasedNM_005816 late expression(TACTILE)，mRNA2.245
Homo sapiens GRB2-associated bindingNM_002039 protein 1(GAB1)，mRNA 2.253Homo sapiens MADS/MEF2-familytranscription factor(MEF2C)mRNA，L08895complete cds 2.291Homo sapiens mRNA for KIAA1325 protein，AB037746 partial cds 2.301Homo sapiens thromboxane A synthase 1(platelet，cytochrome P450，subfamily V)NM_001061 (TBXAS1)，transcript variant TXS-I，mRNA 2.321Homo sapiens hypothetical proteinNM_017918 FLJ20647(FLJ20647)，mRNA 2.325Homo sapiens hematological andNM_016185 neurological expressed 1(HN1)，mRNA 2.327Homo sapiens mRNA；cDNA DKFZp586I1419AL050107 (from clone DKFZp586I1419)；partial cds 2.359Homo sapiens epithelial membrane proteinNM_001423 1(EMP1)，mRNA 2.392NM_003928 Homo sapiens CAAX box 1(CXX1)，mRNA 2.442BC016962 Homo sapiens，clone IMAGE4182947，mRNA 2.470Homo sapiens mRNA；cDNA DKFZp761G02121AL137 311 (from clone DKFZp761G02121)；partial cds 2.564Homo sapiens FXYD domain-containing iontransport regulator 3(FXYD3)，transcriptNM_02191O variant 2，mRNA 2.565Homo sapiens hypothetical proteinNM_018355 FLJ11191(FLJ11191)，mRNA 2.584Homo sapiens plasminogen activator，NM_002659 urokinase receptor(PLAUR)，mRNA 2.589Homo sapiens proteoglycan 1，secretoryNM_002727 granule(PRG1)，mRNA 2.821Homo sapiens，Similar to hypotheticalprotein FLJ14627，clone MGC20447BC011878 IMAGE3532898，mRNA，complete cds2.843Homo sapiens decidual protein induced byNM_007021 progesterone(DEPP)，mRNA 2.875Homo sapiens loss of heterozygosity，11，chromosoma 1 region 2，gene A(LOH11CR2A)，NM_014622 mRNA 2.936Homo sapiens cDNAFLJ23418 fis，cloneHEP21245，highly similar to HSU35048AK027071 Human TSC-22 protein mRNA 2.938Homo sapiens cDNA FLJ14821 fis，cloneOVARC1000556，highly similar to RIBOSOMALAK027727 PROTEIN S6 KINASE II ALPHA 2(EC 2.7.1.-) 2.971Homo sapiens mRNA；cDNA DKFZp761E1512AL157424 (from clone DKFZp761E1512)3.025NM_006818 Homo sapiens ALL1-fused gene from 3.045
chromosome 1q(AF1Q)，mRNAHuman prostate catcinoma tumor antigenL78132 (pcta-1)mRNA，complete cds3.083Homo sapiens serine(or cysteine)proteinase inhibitor，clade A(alpha-1ant iprote inase，antitrypsin)，member 3NM_001085 (SERPINA3)，mRNA 3.253Homo sapiens cDNAFLJ22330 fis，cloneHRC05729，highly similar to AF131821 HomoAK025983 sapiens clone 24877 mRNA sequence 3.254Homo sapiens pleiotrophin(heparinbinding growth factor 8，neuriteNM_002825 growth-promoting factor 1)(PTN)，mRNA 4.124Homo sapiens nucleosomal binding proteinNM_030763 1(NSBP1)，mRNA4.813Homo sapiens group-specitic componentNM_000583 (vitamin D binding protein)(GC)，mRNA 4.882Homo sapiens interleukin 13 receptor，NM_000640 alpha 2(IL13RA2)，mRNA7.360Homo sapiens cDNA FLJ14941 fis，cloneAK027847 PLACE1010944 10.618Homo sapiens，clone MGC16086BC008915 IMAGE3618167，mRNA，complete cds20.70
图1 MDA-MB-435HM裸鼠移植瘤组织学切片(HE×400)图2 MDA-MB-435HM裸鼠原位接种4周时，其肺转移灶的组织学切片，箭头所示为肺转移灶(HE×200)图3 MDA-MB-435HM染色体分析结果具体实施方式
实施例1按常规方法建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，将人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞悬液，调整细胞浓度为1×107/ml，取0.1ml细胞悬液接种于裸鼠乳腺脂肪垫，建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型。所述人乳腺癌细胞株MDA-MB-435购自ATCC；裸鼠由中国科学院上海药物研究所提供，品系为BALB/C-nu/nu，均为雌性，4-6周龄，饲养于无特殊病原体环境中。
细胞接种后第6周，解剖实验动物，取出其肺转移灶，于体外进行细胞扩增，培养液为DMEM/F12(GIBCOBRL，Grand Island，NY，USA)加10％(V/V)胎牛血清(Hyclone，Utah，USA)。培养温度为37℃，气体环境为5％CO2/95％空气，湿度为饱和湿度。将培养所得的细胞按步骤1接种于裸鼠乳腺脂肪垫，按步骤2行体外扩增，同法重复6轮筛选肺转移细胞。
将第6轮筛选所得的肺转移细胞行体外培养，培养条件同上。隔天更换培液，每4天传代一次，常规冻存后，复苏成活良好。经上述连续6轮筛选，建立具有高自发性肺转移的人乳腺癌细胞系MDA-MB-435HM。
进行常规系列实验检测，包括一般生物学特性检测和成瘤性与转移性检测以及8000点基因芯片检测，结果表明，本发明细胞系细胞为亚三倍体核型，染色体数目50-52条；S期细胞的比例提高了15％；其浸润、迁徙能力是MDA-MB-435细胞的2倍；细胞中60种基因的表达水平发生改变。并且具有成瘤率高、转移时间早、转移数目多的特点。
权利要求
1.一种高转移人乳腺癌细胞系，其特征是所述细胞为亚三倍体核型，染色体数目50-52条，S期细胞的较源细胞比例提高15％，其浸润、迁徙能力是源细胞的2倍，裸鼠原位移植成瘤率高，肺转移时间早，转移灶数目多，8000点基因芯片检测其中60种基因表达差异。
2.按权利要求1所述的高转移人乳腺癌细胞系，其特征是所述源细胞是MDA-MB-435细胞。
3.按权利要求1所述的高转移人乳腺癌细胞系，其特征是所述裸鼠原位移植成瘤率是100％，肺转移时间为接种4周时，转移灶数目为37个/肺。
4.权利要求1所述的高转移人乳腺癌细胞系的建立方法，其特征是包括下述步骤，1)按常规方法建立人乳腺癌裸鼠原位移植瘤模型，将人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞悬液接种于裸鼠乳腺。2)筛选肺转移细胞，于体外进行肺转移灶细胞扩增，培养液为DMEM/F12加10％(V/V)胎牛血清，37℃，5％CO2/95％空气，饱和湿度培养。将培养所得的细胞按步骤1接种于裸鼠乳腺脂肪垫，按步骤2行体外扩增，同法重复4-6轮筛选。3)建立细胞系，体外培养所筛选的肺转移细胞，隔天换培液，每4天传代一次，常规冻存，复苏，建高自发性肺转移人乳腺癌细胞系4)系列实验检测，验证细胞特征。
全文摘要
本发明属微生物动物细胞系领域。本发明采用人乳腺癌MDA－MB－435细胞株作为建系的源细胞，通过裸鼠体内连续筛选的方法，建立了具有高自发性肺转移表形的人乳腺癌细胞系。所述细胞为亚三倍体核型，染色体数目50－52条，S期细胞的较源细胞比例提高15％，其浸润、迁徙能力是源细胞的2倍，裸鼠原位移植成瘤率高，肺转移时间早，转移灶数目多，8000点基因芯片检测其中60种基因表达差异。是一种理想的乳腺癌转移研究模型，在揭示乳腺癌的转移机制和抗转移药物筛选的应用中将有着广阔的前景。
文档编号C12N5/06GK1490404SQ03150539
公开日2004年4月21日 申请日期2003年8月25日 优先权日2003年8月25日
发明者邵志敏, 丁健, 侯意枫, 沈镇宙, 罗建民, 吴炅, 陆劲松, 刘刚, 李鹤成 申请人:复旦大学附属肿瘤医院