专利名称：制备人β细胞系的方法
技术领域：
本发明涉及生物学领域，特别是细胞生物学和细胞治疗领域。
背景技术：
I型糖尿病的病因是胰腺β细胞系的免疫机制的破坏，导致胰岛素生成的缺乏和高血糖。用供体β细胞进行细胞治疗提供了一种医治糖尿病病人的途径。但在实现该目标之前必须解决两个主要问题。第一，必须制定抑制免疫的方案来提供移植的免疫保护。最近的报告表明这方面已经取得了进展(Shpiro等，2000)。第二问题是可用于移植的来自供体的成熟β细胞的数量少(Weir和Bonner-Weir，1997)。需要提供一种功能性成熟β细胞的可替代来源。这正是本发明将要解决的问题。近些年来，通过对胚胎期和胎儿期β细胞的发育的了解和阐述，已经有人提出可以制备新的β细胞并用于I型糖尿病的细胞治疗。因而，人们已经花费极大努力来阐述在啮齿动物中控制出生前胰腺发育的分子机制并取得了巨大进展，已经阐明特异的转录因子和生长因子的作用(Edlund，1998；St Onge等，1999；Wells和Melton，1999；Scharfman，2000；Grapin-Botton和Melton，2000；Kin和Hebrok，2001)。目前还检测了可能富有前体细胞的不同组织来源分化成成熟β细胞的能力。这些细胞来自胎儿或者初生小猪的胰腺(Yoom等，1999；Otonkoski等，1999)，或者来自富有导管细胞的成人胰腺的碎片，其被认为含有前体细胞(Bonner-Weir，1997)。迄今，出生前的人胰腺组织(14-24周)未被成功使用，这是因为所有来自胎儿的组织处于发育后期，当用于各种试验时已经相当成熟(Tuch等，1984；Tuch等，1986；Sandla等，1985；Hayek等，1997；Goldrath等，1995)。例如，Tuch等(1984)、Sandla等(1985)、Goldrath等(1995)和Povlsen等(1974)采用14-24个发育周的人胰腺碎片，将其移植到免疫不相容的小鼠，期望将发育成内分泌组织。数周或数月以后，当去除人的组织时在受体小鼠体内找到了所有分泌细胞的类型(Tuch等，1984；Sandla等，1985)。然而需要记住的是，在14到24个发育周时(植入时的组织年龄)内分泌细胞已经存在并且缔结成郎格罕氏岛(Langerhans)(Bouwens等，1997；Stefan等，1983；Fukayama等，1986；Miettinen等，1992)。而且，在这些使用后期人胎儿组织的试验中，当比较植入前后存在于移植物中的表达胰岛素的细胞的数量时，没有检测到β细胞质量的明显增加(Tuch等)。因此难以确定在数周或数月后存在于小鼠内的人内分泌细胞是新形成的内分泌细胞，还是植入前就已经存在并存活的细胞。
本发明解决上述提供成熟β细胞的问题；实际上，本发明人证明了功能性人β细胞可以在NOD/scid小鼠中从不大于10个发育周的未成熟人胚胎胰腺发育得到。更确切地说，本发明人证明了当将不含或者含有极少表达胰岛素的细胞的人胚胎胰腺(见附图4)移植给免疫不相容的小鼠时，胰腺组织会生长，其重量在6个月内增加了200倍。与此同时，发生内分泌细胞分化，人β细胞的绝对数量增加5000倍。最后，发育得到的内分泌组织具备功能性，能够调节缺乏啮齿类β细胞的小鼠的糖血。
人胚胎胰腺在NOD/scid小鼠中的发育模型似乎模拟体内发生的人胰腺的个体发育，现在可以被用于研究控制人胚胎胰腺发育的机制，过去由于缺乏合适的试验体系在一定程度上避而不谈该机制问题。而且，本发明的数据确实说明了人胚胎胰腺可作为未成熟细胞的来源，当植入成年动物时，这些细胞能够全部增殖和分化成β细胞。因而这种组织可以作为可替代的用于移植的β细胞的来源。
发明详述本发明体供一种在个体中再生胰腺功能的方法，该方法包括(a)有效量的不大于10个发育周的动物胚胎胰腺细胞导入非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)的非人类的动物的肾囊中，其中所述NOD/scid动物是不同于获得所述胚胎胰腺细胞的所述动物的物种；和
(b)使动物胚胎胰腺细胞发育、分化和再生至少一种从调控糖血和分泌消化酶中选择的胰腺功能；和(c)将有效量的在步骤(b)中得到的动物功能性胰腺细胞植入所述个体。
术语“个体”是一种脊椎动物，优选为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、啮齿动物(即小鼠、大鼠、仓鼠)、家畜、比赛动物(sportanimals)和宠物。在一个优选实施例中，该个体是哺乳动物和更优选为人。
在一个优选实施例中，动物胚胎胰腺细胞是人胚胎胰腺细胞。另一方面，可以在例如猪、牛、山羊、绵羊、灵长动物、啮齿动物(即小鼠、大鼠、仓鼠…)的胰腺细胞中选择。本发明的动物胚胎胰腺细胞从发育不超过10周、不超过9周、不超过8周、不超过7周、不超过6周、不超过5周、不超过4周、不超过3周、不超过2周、不超过1周的细胞中选择的细胞。在一个优选实施例中，本发明的动物胚胎胰腺细胞为6-9个发育周。按照一个优选实施例，本发明的动物胚胎胰腺细胞是不大于9个发育周的人动物胚胎胰腺细胞，更优选地包括6-9个发育周之间。
非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)动物选自牛、猪、马、绵羊、山羊、非人类的灵长动物、啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠。在一个优选实施例中，NOD/scid动物是小鼠。优选地，本发明的NOD/scid动物为任何发育年龄，优选地足够大以至能进行肾囊移植。优选地，NOD/scid小鼠约为2-15个发育周，更优选为6-8个发育周。NOD/scid动物是缺乏T和B淋巴细胞的动物，不能产生激素的或者细胞介导的免疫。
“有效量”是足以产生有益的或者期望的临床效果的含量。虽然一次给予足量是优选的，但是可以在一次或多次应用中给予有效量。为了达到本发明目标，胚胎胰腺细胞的有效量是足以产生分化的胰腺细胞的用量，这些分化细胞能够恢复一种或多种胰腺功能。可以预期通过导入相对多的胰腺细胞能够加速功能恢复，例如多于109个细胞。此外，还可以预期当导入少量胰腺细胞时，使胰腺细胞或细胞群在体内增殖将恢复胰腺功能。因此，可以通过给尽量少胰腺细胞足够多时间再生完整或者部分胰腺来获得胰腺细胞的“有效量”。优选地，给予个体的有效量多于约101个胰腺细胞。优选为约102至约1015个胰腺细胞和更优选为约103至约1012个胰腺细胞。在本发明的方法的步骤(c)中的植入的动物胰腺细胞的有效量更优选为103至1012个动物胰腺细胞。在处理中，胰腺细胞的“有效量”是能够改进、减轻、稳定、反转、减缓或延迟如糖尿病等胰腺疾病的进展的含量。
按照一个优选实施例，本发明的方法使用的动物胚胎胰腺细胞可以得自异种供体(异源移植)，例如，器官供体或活体供体。另一方面，通过在发育早期(10个发育周以前)取出个体胰腺的部分或者通过反转成体胰腺细胞的分化表型，并将具有再生胰腺功能的胰腺细胞导入同一个体中来进行自体移植。对于自体移植，取出至少约5％供体个体的胰腺。对于异体移植，取出至少5％，优选超过30％，更优选超过50％和甚至更优选超过80％的胰腺。本发明的方法包括胰腺细胞的异体移植和自体移植。各类移植具有自身优势。特别地，自体移植(其中来自同一个体的胰腺细胞用于再生胰腺功能)用于避免免疫反应。当供体和受体为不同个体时，发生移植物抗宿主反应，供体的免疫系统激发抗移植的反应。组织分型和主要组织相容性(MHC)匹配降低移植物抗宿主的程度和发生率。但是，当个体胰腺患病时自体引入胰腺细胞应当特别小心。在这种情况下，少量自体胚胎胰腺组织将再生功能性胰腺。当这种胰腺不能获得时，例如该个体的胰腺患病时，异体移植是有用的。各种MHC匹配的胰腺细胞可以在体外维持或者从供体分离得到，进行组织分型来使供体与受体相匹配。可以给予免疫抑制性药物如环孢霉素，来减少移植物抗宿主反应。由于单个健康的个体能够提供足够细胞来在许多受体中再生至少部分胰腺功能，采用了通过本发明方法获得的细胞的异体移植也是有用的。由于本发明的胰腺细胞能够十分有效地增殖和分化，所以仅仅需要少量细胞来增加胰腺(细胞)的数目。因此，可以将一个胰腺分开，用于多次异体移植。相似地，可以在体外培养少量来自胰腺的细胞，然后用于多次移植。在本发明的实施例中，本发明的胰腺细胞可以被遗传修饰以使它们与所有或者各种MHC相匹配(这种细胞构成了全能的供体胰腺细胞)。本发明的胰腺细胞是指胚胎胰腺细胞或者已经在NOD/scid动物在发育和分化的功能性胰腺细胞。
适合用于从供体个体分离胰腺组织的技术是本领域熟知的。例如，可以采用通过活体解剖针抽取胰腺细胞，或者手术摘除部分或整个胰腺。
胰腺组织不需要进一步处理或修饰，就可以在本发明的方法中使用。修饰在下文描述。对于被修饰和未被修饰的细胞，优选从该组织获取单种细胞悬液。细胞悬液可以通过本领域已知方法获得，例如通过离心和酶处理。可以冷冻胰腺组织或细胞悬液并在使用前解冻。优选地，细胞在分离和处理后仍具活力。
另一方面，可以在体外长期培养本发明的胚胎胰腺细胞来制备稳定的胰腺再生细胞系。本文所用术语“体外培养”是指细胞在体外存活。优选地，本发明的培养是“长期”培养，其中细胞在体外稳定地增殖更长一段时期。这些稳定的细胞群体能够以胚胎胰腺表型在体外存活和增殖(即这些细胞是“干”细胞)。培养各种类型干细胞的方法是本领域已知的。例如，WO94/16059描述了长期培养(超过7个月)神经细胞。本领域中也描述了其它类型干细胞的长期培养，并可以被应用于本发明的细胞。可以遗传修饰体外培养的胚胎胰腺细胞来表达目标基因，如治疗性基因。
按照本发明，在步骤(c)中被植入的动物功能性胰腺细胞优选地被导入所述个体的胰腺。另外，这种动物功能性胰腺细胞被包装在可植入的囊中，这种囊可以被导入个体体内，任何部位，更优选在胰腺附近，或者在膀胱，或者在肝脏、或者在皮肤下。
本文所用术语“导入”是指提供给或者施与个体。在本发明中，能够再生功能性胰腺细胞的功能性胰腺细胞被导入个体中。将细胞导入个体的方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于注射、静脉或者胃肠外给予。单次、多次、持续或者间断地给予是有效的。胰腺细胞可以被导入多个不同部位的任何一个，包括但不限于胰腺、腹腔、肾脏、肝脏、腹腔动脉、门静脉或者脾。优选地，胰腺细胞被存放在个体的胰腺中。
术语“胰腺”是指存在于脊椎动物中的大而狭长的微黄色腺体。胰腺具有内分泌和外分泌功能，生成激素胰岛素和胰高血糖素，另外还分泌消化酶如胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、羧肽酶原A和B、弹性蛋白酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、磷脂酶原A(prophospholipaseA)、胰脂肪酶、胰α-淀粉酶。术语“胰腺细胞”或者“胰腺的细胞”是指从胰腺获得的细胞。在一个优选实施例中，本发明的胰腺的功能为调节糖血。
本发明还提供一种方法，其中所述个体是胰岛素依赖性糖尿病患者。因此，本发明还将提供一种治疗需要这种治疗的人类患者的糖尿病的方法，该方法包括步骤(a)有效量的不大于10个发育周、更优选为6-9个发育周的人胚胎胰腺细胞导入非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)的非人类的动物的肾囊中；和(b)使胚胎胰腺细胞发育、分化和再生至少胰腺功能；和(c)将有效量的在步骤(b)中得到的人功能性胰腺细胞植入所述患者；(d)和治疗糖尿病，其中所述治疗是通过再生所述调控糖血的胰腺功能来实现。
前述方法特别地用于治疗人类患者的糖尿病。
本文所用术语“再生所述胰腺功能”是指新组织的生长和增殖。在本发明中，增殖是指功能性胰腺组织的生长和发育。在多数情况下，再生的胰腺组织也具有正常胰腺组织的细胞学和组织学特性。例如，期望被导入个体并能再生功能性胰腺组织的胰腺细胞能够表达胰岛素和胰高血糖素、消化酶以及其他指示胰腺的标记物，如Nkx6.1、Pax6或PC1/3。胰腺的功能可以用本领域已知的测定和检验进行分析，如胰岛素和胰高血糖素的表达。按照本发明的优选实施例，非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)动物是小鼠。
本发明还提供一种制备功能性动物胰腺细胞的方法，其中所述方法包括步骤(a)有效量的不大于10个发育周、更优选为6-9个发育周的动物胚胎胰腺细胞导入非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)的非人类的动物的肾囊中，其中所述NOD/scid动物是不同于获得所述胚胎胰腺细胞的所述动物的物种；和
(b)使动物胚胎胰腺细胞发育、分化和再生至少一种选自调控糖血和分泌消化酶的胰腺功能。在一个优选实施例中，所述胰腺功能为调控糖血；和(c)收集在步骤(b)中得到的动物胰腺细胞；和(d)可选择地体外培养在步骤(c)中获得的细胞。
本发明包括可获得的或者通过本发明方法获得的功能性动物胰腺细胞。优选所述细胞选自胰腺α细胞、胰腺β细胞、胰腺δ细胞。优选地，所述细胞是胰腺β细胞。这种胰腺β细胞对葡萄糖应答时优先表达胰岛素。而且，本发明提供对葡萄糖应答时表达胰高血糖素的功能性胰腺β细胞。另外，所述功能性胰腺细胞表达和分泌消化酶。所述细胞优选为人细胞或大鼠细胞。
本发明的胰腺的细胞(即胚胎胰腺细胞或功能性胰腺β细胞)可以被修饰，例如，采用特定细胞培养条件或遗传工程方法。后一种修饰包括将转基因导入所述细胞，整合到所述细胞基因组或者作为染色体外的复制子。在一个实施例中，制备本发明的功能性动物胰腺细胞的方法还包括遗传修饰在步骤(d)中获得的细胞的步骤和/或进一步包括遗传修饰不大于10个发育周的所述动物胰腺细胞的初始步骤。“遗传修饰”是指在所述细胞中导入至少一种转基因(即异源核酸分子)，所述转基因被稳定地传递给细胞后代。本文所用的转基因是指单链或双链的任何核苷酸分子，更优选为任何基因组DNA或RNA，重组DNA或RNA，cDNA序列。
优选地，该转基因包括至少一条可操作地连接到启动子序列形成表达盒的目标序列，该表达盒介导在胰腺细胞中表达该目标基因。所述的转基因或表达盒或是以线性形式存在，但是优选地所述转基因或DNA盒是核苷酸片段的一部分，或者被克隆到克隆和/或表达载体上。本文所用的“可操作地连接”包括意指启动子与第二个基因(即目标基因)之间的功能性连接，其中该启动子序列起始和调节相应于第二个序列的所述DNA序列的转录。“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶和起始转录下游(3’方向)编码序列的DNA调控序列。可以在启动子序列中找到转录起始位点以及用于结合RNA聚合酶的蛋白质结合区。真核启动子通常含有TATA盒以及CAT盒，但并不总是含有。在启动子中或其附近可以找到其他反应元件，如激活序列(“增强子”)、抑制序列(“遏制子”)和上游序列。包括遍在或者组织特异性启动子、可诱导型和组成型启动子等各种启动子可用于起始目标基因表达。优选地，启动子能够至少在胰腺细胞中、或者在特定发育阶段的胰腺细胞中如不大于10个发育日的胰腺细胞、或者在成熟β细胞中起始目标基因的表达。更优选地，该启动子是胰岛素基因启动子和更优选为选自大鼠胰岛素基因启动子(Genebank登记号N°GBJ00748)、小鼠胰岛素基因启动子(Genebank登记号N°GBX04724)、人胰岛素基因启动子(Genebank登记号N°GBAP001994)。另外，启动子可以用抗生素如四环素诱导。在另一个实施例中，启动子以温度依赖性方式起始目标基因的表达；在这种情况下，启动子优选地是编码SV40大T抗原的温敏突变体的基因的启动子。
按照本发明，“载体”是其中连接了另一个多核苷酸片段的复制子，目的是实现所连接片段的复制和/或表达。载体具有一个或多个限制性核酸内切酶识别位点，DNA序列在该位点上能够以确定的方式被剪切而不会损失该载体的主要生物学功能。载体还提供引物位点(如用于PCR)、转录和/或翻译起始和/或调控位点、重组信号、复制子、选择性标记等。载体例子包括质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、人类人工染色体(HAC)、病毒、病毒型载体，如腺病毒载体、慢病毒载体，和其他能够体外或者在宿主细胞中复制或被复制的、或者将期望的DNA片段转运到宿主细胞的预期位点的DNA序列。在一个优选实施例中，载体为病毒型载体，更优选为慢病毒型载体如HIV-1型载体。这种慢病毒型载体优选地用于转染本发明的胚胎胰腺细胞。
用于构建本发明的表达载体的重组DNA技术是本领域技术人员熟知和常用的方法。标准技术被用于克隆、DNA分离、扩增和纯化；包括DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶的酶反应遵照制造商的建议实施。这些技术和其他的技术一般按照Sambrook等(1989)的记载实施。采用已知技术，如磷酸钙沉淀转染法、质粒转染法、电穿孔、热休克、原核微注射、“基因枪”、使用人工细菌被膜、病毒感染法，将本发明的转基因和载体或者导入功能性胰腺β细胞中或者导入不大于10个发育周的胰腺细胞中。通过同源重组或者随机整合或者以染色体外的复制子呈递来将这些转基因或载体整合到宿主基因组中。
本文所用“目标序列”是指任何双链或单链的DNA或RNA分子。其可以是基因组DNA片段，如基因、内含子、外显子、调控序列或者它们的组合或片段，或者重组DNA分子如cDNA基因。当所述目标序列可以是选择基因、报告基因、治疗性基因、永生化基因、转化基因，目标序列表达目标蛋白。这些目标基因含有在宿主细胞中正确表达目标蛋白所需的任何遗传元件。
在一个实施例中，这种“目标序列”编码目标蛋白，具有如诊断或研究的意义。这种具有研究意义的蛋白的例子是选择蛋白。本文所用“选择基因”是指编码蛋白质或多肽(即可选择的标记)的基因，通常在特定条件下即存在选择性试剂时，这些蛋白质或多肽能够用于选择或排除一种分子或者含有该分子的细胞。这些选择蛋白包括但不限于对其他毒性化合物(如抗生素)产生抗性的产物。例如，氨卡青霉素或新霉素的抗性基因构成编码本发明选择标记的基因。那些选择标记可以是阳性或者阴性(见Capecci等，US5631153)。根据一个优选实施例，所述选择标记蛋白是由一个基因编码的阳性选择标记蛋白，该基因选自由抗生素抗性基因、hisD基因、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Gpt)基因构成的组。所述抗生素抗性基因选自由潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因、四环素抗性基因、氨卡青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、腐草酶素抗性基因、博来霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟菌素-S-脱氨酶基因构成的组。在一个优选实施例中，所述抗生素抗性基因是潮霉素抗性基因，优选为大肠杆菌潮霉素-B-磷酸转移酶(hpt)基因。此时，选择性试剂是潮霉素。在另一个优选实施例中，所述抗生素抗性基因是新霉素抗性基因。此时，选择性试剂是G418。在另一个实施例中，本发明的阳性选择标记蛋白是His D；在那种情况下，选择性试剂是组氨醇。在另一个实施例中，本发明的阳性选择标记蛋白是次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或者次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)；在那种情况下，选择性试剂是次黄嘌呤。在另一个实施例中，本发明的阳性选择标记蛋白是鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Gpt)；在那种情况下，选择性试剂是黄嘌呤。采用阴性选择标记蛋白也在本发明的保护范围内。例如，编码这种蛋白的基因是HSV-TK基因；在那种情况下，选择性试剂是无环鸟苷-9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤(Acyclovir-Gancyclovir)。例如，编码这种蛋白的基因是次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因或者鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Gpt)基因；在这些情况下，选择性试剂是6-硫鸟嘌呤。例如编码这种蛋白的基因是胞嘧啶脱氨酶；在那种情况下，选择性试剂是5-氟-胞嘧啶。阴性选择标记蛋白的其他例子为病毒和细菌的毒素如白喉毒素A(DTA)。
具有研究意义的蛋白的例子是报告蛋白。“报告基因”是指任何编码表达可以被检测的产物(即报告蛋白)的基因。报告蛋白具有下列特征之一，但不限于荧光、酶活性或者能够被第二分子特异性地结合(例如生物素或者抗体识别表位)。报告蛋白的例子为自身荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)、强化绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和这些蛋白的荧光变体。在一个优选实施例中，目标基因是编码GFP的基因。具有酶活性的报告蛋白的例子是β半乳糖苷酶、β葡糖透明质酸酶(glucoronidase)、碱性磷酸酶、荧光素酶、醇脱氢酶、氯霉素-乙酰转移酶、过氧化物酶。
在另一个实施例中，目标序列是治疗性基因。“治疗性基因”是修正或弥补可能的蛋白质缺乏的基因，或者作为选择是在特定病理状态或综合征下能够下调特定基因或者对其编码产物产生副作用的基因。例如，本发明的治疗性基因是将增强胰腺细胞胰岛素分泌的转录因子或激素、生长因子。
在另一个优选实施例中，目标序列是转化基因。“转化基因”是指使含有并表达该基因的细胞具有被转化的或者癌性的表型的基因。被转化的细胞优选地具有以下特征永生(或者无限生长)、丧失接触抑制、不依赖于生长因子、肿瘤发生能力、不贴壁。转化基因的例子为细胞基因ras、met、NGL(ex-neu)、bcl-X、端粒酶基因或者病毒基因如SV40大T抗原或其温敏突变体形式。按照一个优选实施例，目标基因是猿病毒(SV40)的大T抗原的温敏突变体。
在一个优选实施例中，目标序列是永生化基因。“永生化基因”是指使含有和表达该基因的细胞能够(几乎)无限地生长的基因。不同于正常细胞程序化地分裂有限次数(例如成纤维细胞分裂少于50次)，用永生化基因转染的细胞能够(几乎)无限分裂。在永生化基因中，可以myc和myb细胞基因、DNA病毒基因如大T抗原或大T抗原的温敏突变体形式E1A为例。永生化基因一般编码直接地或通过蛋白因子间接地结合DNA的核蛋白。
除了通过将编码永生化基因的转基因导入细胞来永生化本发明的胰腺细胞之外，本发明还包括通过用一种化合物转染来永生化胰腺细胞，该化合物选自由天然病毒、重组病毒或其片段、含有永生化基因的病毒型载体组成的组。因此，制备本发明的功能性动物胰腺细胞的方法还包括永生化不大于10个发育周的所述动物胰腺细胞的步骤，和/或还包括永生化在步骤(d)中获得的细胞。该病毒选自慢病毒、猿病毒SV40、EB病毒、莫洛尼氏白血病毒。优选地，本发明的细胞用慢病毒型载体、更优选用HIV-1型载体转染。
本发明的病毒型载体，更优选地本发明的HIV-1型载体含有前述表达盒，该表达盒包括可操作地连接到启动子如大鼠胰岛素启动子或人胰岛素启动子的目标基因。在一个实施例中，HIV-1型载体含有作为目标基因的报告基因，更加优选是可操作地连接到大鼠胰岛素启动子的GFP基因。在另一个实施例中，本发明的HIV-1型载体含有一个包括可操作地连接到大鼠胰岛素启动子的目标基因癌基因的表达盒。
多重转基因细胞也在本发明保护范围内。而且本发明的胰腺细胞可以用上述化合物永生化和被遗传修饰来表达其他目标基因。
本发明的分离的功能性胰腺细胞在被导入个体之前在体外培养。合适的培养液是本领域技术人员熟知的，可以含有提高存活、增殖或者选择性地促进特定亚型的胰腺细胞如α、β、δ胰腺细胞生长的生长因子或其他化合物。
本发明的另一个实施例还提供作为药物的本发明的胰腺细胞。更确切地说，本发明涉及用本发明的胰腺细胞制备治疗糖尿病、低血糖症或者与消化酶功能失调相关的病理学的药物的用途。在一个优选实施例中，本发明涉及用本发明的胰腺细胞制备用于治疗糖尿病的药物的用途。本发明还提出了本发明的胰腺细胞用于细胞治疗的用途。
本发明还包括疾病治疗和改善与疾病相关的症状，可以基因转移到通过本文所述方法获得的胰腺细胞群中。与包括但不限于激素、酶、干扰素、生长因子等特定分泌产物的缺乏相关的疾病也可以用遗传修饰的胰腺细胞治疗。
用本发明的胰腺细胞来研究糖尿病的生理病理学发展也是本发明目的。这种在体外培养或者以异体移植或自体移植被植入个体的细胞对于研究糖血调控和/或消化酶表达、分泌和调控的分子的、生物学的、生理学的和/或生理病理学机制是十分有用的。永生化的功能性β细胞特别适合于这种应用。实际上，本发明生成了人β细胞系。
本发明还提供一种制备处于不同发育阶段的动物胰腺细胞的方法，其中所述方法包括步骤(a)有效量的发育不大于10个发育周的动物胚胎胰腺细胞导入非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)的非人类的动物的肾囊中，其中所述NOD/scid动物是不同于获得所述胚胎胰腺细胞的所述动物的物种；和(b)使动物胚胎胰腺细胞发育、可选择地分化和可选择地再生至少一种从调控糖血和分泌消化酶中选择的胰腺功能；和(c)在不同时期收集在步骤(b)中得到的动物胰腺细胞，和(d)可选择地体外培养在步骤(c)中获得的细胞。
通过本发明方法获得的这种胰腺细胞对于研究胰腺发育是有用的。这种胰腺细胞和在上述方法中使用的胚胎胰腺细胞可以是被遗传修饰的。优选地，得到的胰腺细胞被永生化。
本发明的另一个实施例是已经移植了胚胎胰腺细胞的NOD/scid动物。这种NOD/scid动物含有至少一种任意发育阶段的本发明的功能性胰腺细胞，该细胞来自所移植的胚胎胰腺细胞。
本发明涉及用本发明的NOD/scid动物研究和探讨健康的或病理的胰腺的发育和机能的用途。这种动物构成探讨和研究胰腺发育，主要是人胰腺发育的极好模型。而且，这种动物将被用于筛选能够通过如调节或作用于胰岛素或胰高血糖素的表达或与糖血调控有关的任何靶向基因或蛋白的表达来调节胰腺发育或调节糖血调控的化合物。这种动物还可以用于筛选能够调节消化酶表达的化合物。“调节”是指“增强”、“减弱”或“消除”。
除非另外定义，本文所用的所有科技术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解相同的意义。
下面给出的附图和实施例是作为对本领域普通技术人员的进一步指导，无论如何不应被解释为限定本发明。
附图简述附
图1NOD/scid小鼠中人胰腺的发育。(A)移植前8个发育周的胰腺。(B-E)胰腺被移植到NOD/scid小鼠的肾囊中并且在7天后(B)、2个月后(C)、6个月后(D)和9个月后(E)被分析。
附图2被移植的胰腺的重量的变化。在移植后的不同时间点取出移植物，小心剔除脂肪并称重。总共分析22个移植物。
附图3组织学分析。8个发育周的人胰腺在移植前(A)，和移植后1个月(B)和6个月(C)用抗-泛细胞角蛋白抗体(显示为绿色)或者用抗-波形蛋白抗体(显示为红色)染色。
附图4NOD/scid小鼠中胰腺内分泌组织的发育。8周的胰腺在移植前(A)和移植后7天(B)、1个月后(C)、2个月后(D)、6个月后(E)和9个月(F)。
胰岛素(显示为绿色)和胰高血糖素(显示为红色)的免疫染色。(A)中的箭头表示染色为胰岛素和淀粉酶都为阳性的2个细胞。在G和H中代表性地显示8周人胰腺的移植前(G)和移植后6个月(H)的切片上的胰岛素原探针的杂交。
附图5在移植过程中内分泌细胞质量的变化。
用任意单位(arbitrary unit)表示表达胰岛素的细胞的绝对质量。总共16个移植物被分析。
附图6细胞增殖分析。
在scid小鼠中1个月中(A和B)或者在3个月中(C，D)发育的人胚胎胰腺的切片上进行BrdU(红色)和泛细胞角蛋白(绿色)(A，C)或BrdU(红色)和胰岛素(绿色)(B，D)的双重免疫染色。小鼠在注射BrdU 2小时后被处死。
附图7人内分泌细胞在小鼠类成熟内分泌细胞中发育。
移植后6个月的人胚胎胰腺的切片。(A).胰岛素(显示为绿色)和Pax6(显示为红色)；(B).胰岛素(显示为绿色)和Nkx6(显示为红色)；(C，D).胰岛素(显示为红色)和PC1/3(显示为绿色)；(E).胰岛素(显示为绿色)和细胞角蛋白19(显示为红色)；(F).仅细胞角蛋白19(显示为红色)。
附图8人胰腺移植物的功能发育。
(A)移植后3个月，scid小鼠(红线)被注射四氧嘧啶。未被移植的小鼠(蓝线)也注射四氧嘧啶。虽然未被移植的小鼠的糖血迅速升高，而被移植的小鼠的糖血保持恒定。当在第7天和第43天通过肾切除术去除移植物，糖血迅速升高。
(B)对四氧嘧啶处理前和试验结束时(C)(注射四氧嘧啶后43天)的小鼠胰腺染色来检测胰岛素(显示为红色)和胰高血糖素(显示为绿色)，表明四氧嘧啶已经破坏了绝大部分宿主-胰岛素-表达细胞。(D).对试验结束时(注射四氧嘧啶后43天)的人移植物切片染色来检测胰岛素(显示为红色)和胰高血糖素(显示为绿色)，表明四氧嘧啶对发育的人β细胞无作用。
附图9移植到scid小鼠中的大鼠胚胎胰腺的发育和探索用重组慢病毒转导胰岛素表达细胞的条件。
解剖E16期大鼠的胰腺。在A中，立即染色来检测胰高血糖素(绿色)和胰岛素(红色)。在B和C中，用表达受胰岛素启动子控制的GFP的慢病毒感染，并在7天内被移植。B.染色检测胰高血糖素(绿色)和胰岛素(红色)。C.在该条件下不能检测到表达GFP的细胞。在D和E中，分离E16期的胰腺，接着用表达受胰岛素启动子控制的GFP的慢病毒感染。D.染色检测胰高血糖素(绿色)和胰岛素(红色)。E.在该条件下可以检测到表达GFP的细胞。
附图10在表达胰岛素的细胞中GFP的表达。
解剖E16期大鼠的胰腺，接着用表达受胰岛素启动子控制的GFP的慢病毒感染并在7天内被移植。A.GFP染色；B.胰岛素染色；C.叠加组A和B；D.染色检测胰高血糖素(红色)和GFP(绿色)；E.染色检测细胞角蛋白(红色)和GFP(绿色)。
附图11在表达胰岛素的细胞中长期表达GFP。
解剖E16期大鼠的胰腺，接着用表达受胰岛素启动子控制的GFP的慢病毒感染并在1个月中被移植。A，D.GFP染色；B，E.胰岛素染色；C，F.叠加组A+B和D+E。
附图12从被感染的祖细胞中发育的GFP+/INS+细胞。
A.之前(第0天)和移植7天后(第7天)的E16期胰腺中的胰岛素含量。B.E16期怀孕大鼠被注射BrdU。在左边的组中，染色组织来检测BrdU(红色)和胰岛素(绿色)。在右边的组中，染色组织来检测BrdU(红色)、胰岛素(蓝色)和胰高血糖素(绿色)。表明内分泌细胞未增殖。C.解剖E13期的大鼠的胰腺，接着用表达受胰岛素启动子控制的GFP的慢病毒感染并在7天内被移植。左边.GFP染色；中间.胰岛素染色；右边.叠加左边和右边的组。
实施例1-试验设计和方法1.1人组织依照当前的法国法律和本研究所的规定，人胰腺分离自在6-9个发育周(WD)之间实施的自愿流产之后立即获得的胚胎组织碎片。温热局部缺血时间少于30min。从多种发育标准来确定怀孕时期无月经期；通过超声波扫描仪测定的顶臀长；手足形态。分离胰腺并固定和包埋在石蜡中，或者如下描述移植给非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)小鼠。
1.2动物和移入NOD/scid小鼠NOD/scid小鼠在供给无菌过滤、控温的空气的隔离装置中饲养。鼠笼、垫料和饮用水都经过高压灭菌。鼠料经过X-光杀菌。所有的操作都在层流净化罩中进行。用解剖显微镜，将胚胎胰腺(6-9个发育周(WD))植入6-8周龄的NOD/scid小鼠左边的肾囊中，小鼠已用Hypnomidate(Janssen-Cilag)麻醉。在移植后的不同时间点(7天-9个月)，处死小鼠并取出移植物，称重，在3.7％福尔马林中固定并包埋在石蜡中。用于细胞增殖分析，在处死前2小时给小鼠注射溴脱氧尿苷(BrdU)(50mg/kg)。
1.3免疫组织化学在胶化的载玻片上切割4μm厚的切片。进行免疫染色，切片在甲苯中脱蜡、在pH6，0.01M柠檬酸缓冲液中再水合、微波处理，和在含有0.1％曲通(triton)的Tris-缓冲盐(TBS)中渗透20min。在4℃下温育过夜。然后洗涤切片，并在室温下与适宜的第二抗体温育1h，用2种不同荧光染料进在含有3％BSA和0.1％吐温(tween)20的TBS中封闭非特异性位点30min，切片与第一抗体第一抗体是小鼠抗人胰岛素(Sigma Aldrich，1/1000)；豚鼠抗猪胰岛素(Dako；1/2000)；小鼠抗人胰高血糖素(Sigma Aldrich，1/2000)；兔抗人泛细胞角蛋白(Dako；1/500)；小鼠抗人细胞角蛋白19(Dako；1/50)；小鼠抗猪波形蛋白(Dako；1/30)；兔抗转化酶原(proconvertase)1/3(Steiner博士赠送，1/200)；兔抗Pax6(S.Saule博士赠送)；兔抗大鼠Nkx-6.1(Serup博士赠送)；鼠抗BrdU(Amersham)。荧光第二抗体为荧光抗豚鼠抗体(Dako，1/500)；荧光抗兔抗体(Immunothech，1/200)；荧光抗小鼠抗体(Immunothech，1/200)；德克萨斯红抗小鼠抗体(Jackson，1/200)；德克萨斯红抗兔抗体(Jackson，1/200)。
1.4表面量化和统计分析所有图像用滨松C5810冷却三-CCD相机数字化。在相同放大倍数下拍摄照片，并用IPLab软件(3.2.4版本，Scananlytics公司)分析。对于各个被移植的组织，在整个移植过程中定期制备切片并染色检测胰岛素。对3-4个切片和每个切片3-5个图像进行分析。通过相应的移植物重量计算β细胞质量在移植阶段的变化，作为染色为胰岛素阳性的表面产物。
1.5原位杂交对于原位杂交，切片在含有1％曲通X-100的PBS中脱蜡、再水合和渗透。在杂交缓冲液(50％甲酰胺、5X SSC、5X Denhardts溶液、250μg/ml酵母RNA、500μg/ml鲱鱼精子DNA)中70℃下预杂交。采用DIG-RNA标记试剂盒(保灵曼(Boehringer Mannheim))通过体外转录用DIG-UTP标记RNA探针。加入含有Ipg/ml探针的新鲜杂交缓冲液来起始杂交并在70℃下持续过夜。此后，用递减浓度的SSC洗涤载玻片。通过免疫组织化学进行分析。非特异性位点用在pH7.5的25mM Tris、140mM NaCl、2.7mM KCl、0.1％Tween20中的2％封闭剂在室温下封闭30min。然后载玻片与用碱性磷酸酶偶联的多细胞系羊抗DIG抗体(1∶1000稀释，保灵曼(Boehringer Mannheim))在4℃下温育过夜。通过硝基蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐溶液(保灵曼(BoehringerMannheim))的酶催化颜色反应来使反应产物可视化。温育切片直到杂交位点上出现有色反应产物。载玻片在水中洗涤，装载到Leitz DMRD光学显微镜上(莱卡)并观察。此处所用探针是人胰岛素原。
1.6糖尿病的诱导试验为了检测移植物调控小鼠的糖血的能力，给被移植和未被移植的NOD/scid小鼠静脉注射(i.v.)四氧嘧啶(Sigma-Aldrich，90mg/kg体重)，已知四氧嘧啶会破坏啮齿动物的β细胞，但是不破坏人的β细胞(Eizirik等，1994)。在一个星期的每一天从尾静脉收集血液，用便携式葡萄糖测定仪(Glucomen，A.Menarini diagnostics，佛罗伦萨，意大利)测定葡萄糖水平。为了确定移植物对正常化宿主中的血糖值的作用，在注射四氧嘧啶后的不同时间点(7天或42天)通过单侧肾切除手术去除移植物，并测定血糖水平。
1.7动物和解剖怀孕大鼠购自Janvier繁殖中心(CERJ，Le Genet，法国)。发现阴道粘液栓的早晨确定为胚胎期第0.5天(E0.5)。用二氧化碳杀死怀孕大鼠，收集胚胎并分离胰腺。对于细胞增殖分析，在处死前30min，给怀孕大鼠注射BrdU(100mg/kg)。
1.8构建和制备HIV-RIP-GFP载体DNA构建和载体制备无启动子的pTRIP GFP已被描述(Zennou等，2000)。采用具有下列引物的扩增系统通过PCR从pBS-RIP-β球蛋白质粒(由P.Herrera友情提供，(Sanvito等，1995))制备408bp的大鼠胰岛素启动子片段(RIP408)MluI RIP正义＝5’cgacgcgtGGACACAGCTATCAGTGGGA 3’(SEQ ID N°1)BamHI RIP反义＝5’cgggatccTAGGGCTGGGGGTTACT 3’(SEQ ID N°2)。
生成的PCR产物被亚克隆到pGEMT简易载体(easy vector)(Promega)。然后将MluI-BamHI片段插入到MluI-BamHI线性化无启动子的pTRIP GFP载体中。测序整个插入的RIP408来排除由PCR导致的点突变。
如先前的描述(Zennou等，2000)，通过用p8.7被囊质粒(ΔVprΔVifΔVpuΔNef)(Zufferey等，1997)、编码VSV包膜的pHCMV-G和pTRIP RIP408-GFP载体(Yee等，1994)过渡共转染293T细胞来制备载体原种。用DNAse I处理上清液后超速离心，然后悬浮在PBS中并冷冻(-80℃)直到使用。
1.9感染胚胎胰腺用重组慢病毒感染完整的或者解离的胰腺。进行解离时，根据胰腺的大小用0.16mg分散酶I(Roche Boeringer)温育5-30min，并机械解离。感染时，完整或者解离的组织与200μl含有青霉素(100单位/ml)、链霉素(100mg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)和10μl病毒颗粒(12μg/ml的p24)的RPMI溶液1640在37℃下温育1h。加入浓度为10μg/ml的DEAE-右旋糖苷来提高病毒感染率。
1.10移植scid小鼠饲养在供给无菌过滤、控温的空气的隔离装置中。鼠笼、垫料和饮用水都经过高压灭菌。鼠料经过X-光杀菌。所有的操作都在层流净化罩中进行。按照先前的描述(Castaing等，2001)和如下改进，用解剖显微镜将解离的胚胎胰腺植入左边的肾囊中。取出左肾，在靠近下极的胰腺腹侧表面的被膜上造一个小的横向切口。在被膜下形成袋状，将小硅环的部分推入该被膜的袋中，给植入的组织提供小腔(Thomas等，1997)。然后用带有钝的22号标准针头的50μl汉密尔顿注射器将解离的细胞导入该小腔中，将硅环完全地装入袋中，这样顶上的被膜和底下的肾实质形成了装载胰腺细胞的密闭空间。这种方法将细胞限定在单一位置上，容易研究细胞发育。在移植后的不同时间点，用二氧化碳杀死小鼠，取出肾脏，在3.7％的福尔马林中固定移植物，并包埋在石蜡中。
1.11免疫组织化学如别处所描述(Cras-Meneur等，2001；Miralles等，1998)，收集4μm厚的切片并通过免疫组织化学分析。在下列稀释液中使用抗血清小鼠抗人胰岛素(Sigma，1/2,000)、小鼠抗人胰高血糖素(Sigma)，1/2000；小鼠抗人泛细胞角蛋白(Sigma)，1/100；小鼠抗BrdU(Amersham)，1/4)；兔抗人泛细胞角蛋白(Dako)，1/500；兔抗胰高血糖素(DiaSorin)，1/2000)；兔抗猪胰岛素(DiaSorin)，1/2000；和兔抗GFP(Clontech)，1/200。购自杰克逊免疫研究实验室的荧光第二抗体为FITC抗兔抗体，1/200；和德克萨斯红抗小鼠抗体，1/200。对于双标记免疫荧光分析，将在不同动物中产生的抗体应用于切片，并用标记了两种不同荧光染料的抗种属抗体来显示。与非匹配第二抗体温育的单标记切片显示无免疫染色，证明了第二抗血清的特异性。用荧光显微镜(莱卡，Leitz DMRD)拍摄切片的照片。这些照片用滨松(Midlesex，NJ)C5810冷却三-CCD相机数字化。
1.12胰岛素含量匀化胚胎胰芽或者被移植的胰腺来测量胰岛素含量。在10ml-20℃冷却的酸化乙醇(1.5％HCl，75％EtOH)中提取胰岛素过夜。提取物在-20℃下保存直到用于分析胰岛素。
用放射性免疫测定来测量免疫反应的胰岛素，用125I-标记碘化的猪胰岛素(Sorin Biochemdia，Sallugia，意大利)作为示踪物，以由VanSchravendijk博士(布鲁塞尔，比利时)友情提供的豚鼠抗胰岛素抗体和纯化的大鼠胰岛素(Novo Nordisk，布伦，法国)作为标准。用木炭分离除去结合的激素。分析灵敏度为0.25ng/ml。
2-结果2.1 NOD/scid小鼠中的人胚胎植入物在本研究中，48个胚胎胰腺组织(6-9WD)被植入NOD/scid小鼠中。在移植后的不同时间点(7天-9个月)处死小鼠，解剖移植物。回收39个移植物。在9例未被回收的移植中，一只被移植的小鼠死亡，但移植物仍存在。在其他8例中，小鼠死于未知原因，没有分析移植物的生长。接下来是移植物的体积和质量的变化。如附图1所示，当被移植到scid小鼠的肾囊时，人胚胎组织大量发育。移植前，怀孕7-9周时的胚胎胰腺的体积不超过4mm3(附图1A)，但是在宿主小鼠中逐渐增长，并在6个月后达到几个cm3(附图.1B-E)。移植组织的质量变化如下。虽然在小鼠体内1周后移植物的重量少于10mg，与未被移植的组织处于相同范围内，但是随后其逐渐地迅速增长，8-12周后达到100mg且33-38周后达到1000mg(附图2)。移植前，采用抗-细胞角蛋白和抗-波形蛋白的抗体进行免疫组织化学来追踪存在于人胚胎胰腺中的上皮细胞和间质细胞在移植阶段的变化。如附图3A所示，移植前8WD的胰腺由形成导管的上皮细胞和间质细胞组成。移植后1个月和6个月，该组织还是由染色为细胞角蛋白阳性的上皮细胞和染色为波形蛋白阳性的间质细胞组成，表明在移植过程中这两种细胞类型确实发育了(附图3B和C)。
2.2内分泌组织的发育移植前，通过免疫组织化学只检测到少数内分泌细胞染色为胰高血糖素阳性或者染色为胰岛素和胰高血糖素均为阳性。这些细胞分散在胰腺组织中，没有缔结成郎格罕氏岛(附图4A)。一旦被移植后，内分泌细胞开始发育并且数量逐渐增加(附图4B-F)。在组G和H中，给出对8周龄胰腺在移植前和移植后6个月的代表性胰岛素原杂交。可以清楚看出表达胰岛素原mRNA的细胞的数量急剧增加。在免疫组织化学分析后，量化胰岛素阳性的细胞质量的变化。如附图5所示，在小鼠中，被表达胰岛素的细胞占据的整个表面在8-12周后增长300倍，在21-28周后增长5000倍。
2.3人未分化的上皮细胞而非内分泌细胞在移植阶段增殖为了确定内分泌细胞的绝对数量的增加是否是由于前体细胞的分化还是由于移植前就存在的少数内分泌细胞增殖，在处死前2h给被移植小鼠注射BrdU，进行免疫组织化学分析。如附图6所示，在小鼠体内发育1个月和3个月之后，虽然时常能够检测到染色为细胞角蛋白和BrdU阳性的细胞，但是极少发现染色为胰岛素和BrdU均为阳性的细胞。这些结果有力地说明内分泌细胞的增加是由于前体细胞的分化，而不是少数预先存在的内分泌细胞增殖。
2.4人内分泌细胞在小鼠类成熟内分泌细胞中发育为了确定在NOD/scid小鼠体内发育的人内分泌细胞是否表达已知存在于体内发育的人β细胞中的标记，用免疫组织化学检测一系列抗体。如附图7所示，在NOD/scid小鼠体内发育的β细胞表达特异性转录因子如Nkx6.1和Pax6(组A，B)以及在胰岛素原转化为胰岛素过程所需的酶PC1/3(组C，D)。而且移植物中的内分泌细胞常常缔结成郎格罕氏岛，具有被表达胰高血糖素的细胞包围的表达胰岛素的细胞中心(附图4，组E，F)。最后，虽然如先前报告(Bouwens等，1997)，首先在人胚胎胰腺中发现的内分泌细胞染色为细胞角蛋白阳性，但是在NOD/scid小鼠中发育的人表达胰岛素的细胞不表达细胞角蛋白19(附图7，组E，F)。
2.5人胰腺移植物的功能发育为了确定在移植物中发育的人β细胞是否具有功能，给15只NOD/scid小鼠移植人胚胎胰腺。三个月后，给被移植和未被移植的NOD/scid小鼠注射四氧嘧啶，一种已知对鼠科β细胞有毒而对人β细胞无害的药物(Eizirik等，1994)。在注射四氧嘧啶之前，被移植小鼠和未被移植小鼠的血糖水平之间不具有统计学差异。在用四氧嘧啶处理之后，所有未被移植小鼠的糖血增加到6g/l，而15只被移植小鼠中的12只的糖血保持恒定。为了证明注射了四氧嘧啶的被移植小鼠中的糖血调控的确是由于移植物的发育，实行单侧肾切除手术去除6只小鼠中的移植物并监视血糖水平。如附图8A所示，在通过单侧肾切除手术去除移植物后，在注射四氧嘧啶后的第7天或第43天小鼠都为高血糖。分析在四氧嘧啶注射之前或者在处死小鼠结束试验时，鼠的胰腺和移植物中是否存在表达胰岛素和胰高血糖素的细胞。如附图8所示，与未用四氧嘧啶处理的NOD/scid小鼠相比，在注射了四氧嘧啶的被移植NOD/scid小鼠的胰腺中检测到极少表达胰岛素的细胞。另一方面，在注射四氧嘧啶后，大量产生胰岛素的细胞存在于人移植物。
本发明人证明了人早期胚胎胰腺被移植到NOD/scid小鼠的肾囊中后能够发育。移植物的体积和重量显著地增长，并且内分泌细胞分化并组成朗格罕氏岛，表现出许多成熟标准。最后，发育的人内分泌胰腺组织能够反转小鼠的糖尿病，表明其功能性。
在本研究中，用NOD/scid小鼠作为移植受体。NOD/scid小鼠是通过用C.B-17-scid/scid小鼠的scid突变体与NOD小鼠杂交产生。这些小鼠缺乏T和B淋巴细胞(Shultz等，1995)，不能产生激素的或者细胞介导的免疫。由于scid小鼠不存在异种移植物排斥，它们先前被用作人或胎儿的血管淋巴组织或细胞的受体(Roncarolo等，1995)。非造血人组织如卵巢皮质(Weissman等，1999)、甲状腺(Martin等，1993)、皮肤(Levey等，1998)和呼吸道(Delplanque等，2000)也成功地在该模型中移植。但是，极少数证明这些组织能够发展功能特性并恢复生理功能。一个生理功能恢复的例子是通过移植牛肾上腺皮质细胞能够形成肾上腺皮质组织并且恢复小鼠肾上腺的基本功能(Thomas等，1997)。但在该研究中被移植的组织不是人的而是牛源的。而且，这些组织从牛肾上腺皮质细胞的初级培养物扩展得到。因而在移植时供体细胞已经完全分化。
在本发明中，发明人证明了未成熟的人胚胎胰腺能够在scid小鼠中发育并获得功能特性。
通过移植含有未分化的上皮细胞和间充质组织并且几乎没有表达胰岛素的细胞的未成熟原基(Rudiment)，本发明人证明6个月后表达胰岛素的细胞的绝对质量在小鼠中增加了近5000倍。事实上，移植前极少内分泌细胞存在，但是几个星期后检测到大量内分泌细胞，这清楚表明在本模型中发生内分泌细胞的新生。
理论上，所观察到的人β细胞质量的增加可能是由于极少预先存在的表达胰岛素的细胞增殖，或者由于前体细胞分化。一般认为出生前β细胞质量的增加主要是由于前体细胞的分化，而不是预先存在的β细胞增殖。这在啮齿动物中已经十分清楚，已经进行的大量实验表明胎儿期所观察到的内分泌细胞质量的增加不能解释为预先存在的内分泌细胞增殖(Swenne，1992)。虽然较少信息可以获得，但是在人类中似乎也是与此相同的情形，其中在胚胎/胎儿期表达胰岛素的细胞染色极少为Ki67阳性，因此极少或者不是周期性变化的(cycling)(Potak等，2000；Bouwens等，1997)。本发明的数据表明当给嵌合小鼠注射BrdU时，大量细胞角蛋白阳性细胞存在于染色为BrdU阳性的移植物中，但是没有或者极少胰岛素阳性的细胞存在。因此，可以假定一个概括了正常发育的机制，即在移植物中新形成的β细胞来自存在于导管上皮中的前体细胞，这些前体细胞在移植过程中增殖和分化，而不是来自存在于该啮齿动物中的少数内分泌细胞的增殖。
不同证据表明在NOD/scid小鼠体内发育的人β细胞是成熟的。首先，这些表达胰岛素的细胞不会同时表达胰高血糖素，因而区别于在发育早期在人胰腺中发现的第一表达胰岛素的细胞(Polak等，2000；Larsson和Hougaard，1994；De Krijger等，1992)。其次，已经证明存在于16个发育周之前的胰腺中的表达胰岛素的细胞表达细胞角蛋白19，但是在发育过程中后来发现的表达胰岛素的细胞染色为细胞角蛋白19阴性(Bouwens等，1997)。本发明数据表明在NOD/scid小鼠内发育的人β细胞染色为细胞角蛋白19阴性，因而与成人成熟β细胞相似。接着，在NOD/scid小鼠内发育的人β细胞表达激素原反转酶PC1/3，该酶是将胰岛素原加工成胰岛素所必需的(Kaufman等，1997；Furuts等，1998)。最后，本发明数据表明在NOD/scid小鼠内发育的人内分泌细胞团能够极佳地调节缺乏内源β细胞的NOD/scid小鼠的糖血，因而是功能性的。这些人内分泌细胞保持功能性并能够调节小鼠糖血至少43天，即所试验的在去除移植物前的最长时期。
本发明在此证明新分化的人β细胞可以从人早期胚胎胰腺制备，这些β细胞能够调节丧失自身β细胞的宿主的糖血。因此，人胚胎胰腺提供了用于生产移植用的功能性人β细胞的可替代的组织来源。而且，现在移植了人胚胎胰腺的小鼠模型可用于推进人胰腺发育的研究，这种研究由于缺乏人胚胎胰腺和合适的试验体系难以进行。
2.6移植到scid小鼠中的大鼠胚胎胰腺的发育和探索用重组慢病毒转导表达胰岛素的细胞的条件本发明首次研究了胰腺组织被移植到scid小鼠中时的生长和发育能力。解剖5个E16期的胰腺并接着植入scid小鼠的肾囊中。移植后7天，杀死小鼠，取出移植物。如先前说明(Rall等，1973)，移植前E16期胰腺中的大部分内分泌细胞是表达胰高血糖素的细胞，在该阶段极少存在表达胰岛素的细胞。这种表达胰岛素的细胞分散地存在(附图9A)。另一方面，当E16期胰腺移植7天后，表达胰岛素的细胞发育并且被发现缔结成朗格罕氏岛(附图9B)。本发明人接着用含有报告分子绿色荧光蛋白(GFP)的HIV-1型载体。GFP由大鼠胰岛素启动子(RIP)起始，来限制β细胞表达GFP。感染E16期的胰腺并在7天内移植。如附图9C所示，在该条件下没有检测到表达GFP的细胞。本发明人接着重复该试验，但是在感染和移植前解离该组织。如附图9D所示，在该条件下内分泌组织正常地发育。而且，当在感染前用分散酶解离组织时，大量细胞表达GFP(附图9E)。在未被感染的组织中从未检测到GFP(数据未显示)。
2.7表达胰岛素的细胞中长期表达GFP接着的步骤是确定表达GFP的细胞类型。分别用抗胰岛素、胰高血糖素和细胞角蛋白进行双免疫组织化学来确定表达GFP的细胞是否为β细胞、α细胞或者导管细胞。如附图10所示，在表达胰岛素的细胞中清楚地检测到GFP。另一方面，在表达胰高血糖素和细胞角蛋白的细胞中未检测到GFP。
最后如附图11所示，当由胰岛素启动子起始GFP时，可以实现持续表达GFP超过1个月(所分析的最长时间点)。
2.8得自被感染的祖细胞的表达GFP的β细胞两组证据表明表达GFP的β细胞得自祖细胞，这些祖细胞首先用RIP-GFP感染，接着分化成β细胞，而不是通过感染存在于E16期并随后增殖的少数β细胞来获得。首先，在移植到scid小鼠肾囊的E16期胰腺的发育模型中发生β细胞分化。实际上，如附图12A所示，在一周的移植期中，放射免疫分析测定的每个胰腺的胰岛素含量增长了超过250倍。如附图12B所示，虽然在该阶段胰腺细胞如预期极度增殖，但是表达胰岛素的细胞没有增殖。为了进一步证明胰岛素/GFP细胞来自被感染的祖细胞而不是来自预先存在的成熟β细胞，用解离的E13期胰腺重复感染。如先前说明，在该阶段极少存在完全未成熟的表达胰岛素的细胞(Jackerott等，1996；Miralles等，1998；Pictet和Rutter，1972)。现在已经确定这种表达胰岛素的未成熟细胞以后不会增殖为成熟的β细胞(Jensen等，2000)。如附图12C所示，当解离的E13期胰腺用RIP-GFP感染并植入scid小鼠肾囊中，1周后可以检测到表达GFP的β细胞，进一步表明胰岛素/GFP双阳性细胞来自E13期被感染的内分泌祖细胞。
参考文献Becker等(1994)生物化学杂志26921234-21238Bonner-Weir等(2000)美国国家科学院院报977999-8004Buchet等(2002)分子细胞神经科学19389-401Bouwens等(1997)糖尿病学(diabetologia)40398-404Case等(1999)美国国家科学院院报962988-2993
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Miralles等(1998)发育学1251017-1024Miyoshi等(1999)科学283682-686Otonkoski(1999)移植681674-1683Pawliuk等(2001)科学2942368-2371Pictet等(1972)胚胎胰腺的发育Polak等(2000)糖尿病49225-232Povlsen等(1974)自然248247-249Roncarolo等(1995)乔治敦TXLandesRall等(1973)美国国家科学院院报703478-3482Salmon等(2000)分子治疗2404-414Salton等(1991)分子细胞生物学112335-2349Sandler等(1985)糖尿病341113-1119Sanvito等(1995)生物化学生物物理学研究通讯2171279-1286Shapiro等(2000)N Engl J Med 343230-238St-Onge等(1999)遗传发育前沿热点9295-300Shapiro等(2000)N Engl J Med 343230-238Sharfmann(2000)糖尿病学431083-1092Shultz等(1995)免疫学杂志154180-191Stefan等(1983)糖尿病32293-301Swenne(1992)糖尿病学35193-201Thomas等(1997)自然医学3978-983Tuch等(1984)糖尿病331180-1187Tuch等(1986)糖尿病35464-469Uchida等(1998)美国国家科学院院报9511939-11944Verma等(1997)自然389239-242Weir，Bonner(1997)糖尿病461247-1256Weissman等(1999)生物学报告601462-1467Wells，Melton(1999)细胞发育生物学研究年报15393-410Yee等(1994)美国国家科学院院报919564-9568Yoon等(1999)细胞移植8673-689Zennou等(2000)细胞101173-185Zufferey等(1997)自然生物技术15871-875
序列表<110>巴黎第七大学国家科学研究中心<120>制备人β细胞系的方法<130>346073-CN<140>
<141>
<150>PCT/IB 02/04 599<151>2002-10-18<160>2<170>PatentIn ver.2.1<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物MluIRIP<400>1cgacgcgtgg acacagctat cagtggga 28<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述反义引物BamHI RIP<400>2cgggatccta gggctggggg ttact 2权利要求
1.一种在个体中再生胰腺功能的方法，该方法包括(a)将有效量的不大于10个发育周的动物胚胎胰腺细胞导入非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)的非人类动物的肾囊中，其中所述NOD/scid动物是不同于获得所述胚胎胰腺细胞的所述动物的物种；和(b)使动物胚胎胰腺细胞发育、分化和再生至少一种胰腺功能；和(c)将有效量的在步骤(b)中得到的动物功能性胰腺细胞植入所述个体。
2.权利要求1的方法，其中该个体是哺乳动物。
3.权利要求2的方法，其中该哺乳动物是人。
4.权利要求1的方法，其中所述动物胚胎胰腺细胞是人胚胎胰腺细胞。
5.权利要求4的方法，其中所述人胚胎胰腺细胞为6-9个发育周。
6.权利要求1的方法，其中所述非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损动物是小鼠。
7.权利要求1的方法，其中在步骤(c)中植入的有效量动物胰腺细胞包括在约103到1012之间的动物胰腺细胞。
8.权利要求1的方法，其中在步骤(c)中植入的动物胰腺细胞被导入所述个体的胰腺。
9.权利要求1的方法，其中所述胰腺功能是调控糖血。
10.权利要求1的方法，其中所述个体是胰岛素依赖的糖尿病患者。
11.一种治疗需要这种治疗的人类患者的糖尿病的方法，该方法包括步骤(a)将有效量的不大于10个发育周的人胚胎胰腺细胞导入非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)的非人类的动物的肾囊中；和(b)使胚胎胰腺细胞发育、分化和再生至少胰腺功能；和(c)将有效量的在步骤(b)中得到的人功能性胰腺细胞植入所述患者；(d)和治疗糖尿病，其中所述治疗是通过再生所述调控糖血的胰腺功能来实现。
12.权利要求11的方法，其中其中所述非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损动物是小鼠。
13.一种制备功能性动物胰腺细胞的方法，其中所述方法包括步骤(a)将有效量的不大于10个发育周的动物胚胎胰腺细胞导入非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)的非人类的动物的肾囊中，其中所述NOD/scid动物是不同于获得所述胚胎胰腺细胞的所述动物的物种；和(b)使动物胚胎胰腺细胞发育、分化和再生至少一种胰腺功能；和(c)收集在步骤(b)中得到的动物胰腺细胞；和(d)可选择地体外培养在步骤(c)中获得的细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述胰腺功能是调控糖血。
15.权利要求13的方法，还包括永生化在步骤(d)中获得的细胞的步骤。
16.权利要求13的方法，包括永生化所述不大于10个发育周的动物胚胎胰腺细胞的初始步骤。
17.权利要求15和16的方法，其中该细胞用一种化合物永生化，该化合物选自含有天然病毒、重组病毒，或者它们的片段、病毒型载体，所述病毒选自慢病毒、猿病毒SV40、EB病毒、莫洛尼氏白血病毒。
18.权利要求17的方法，其中该化合物是慢病毒型载体，优选为HIV-1型载体。
19.权利要求17的方法，其中该病毒型载体含有包括可操作地连接到大鼠胰岛素基因启动子的目标基因的表达盒。
20.权利要求19的方法，其中目标基因是报告基因，优选为编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因。
21.权利要求19的方法，其中目标基因是致癌基因。
22.按照权利要求13的方法，还包括遗传修饰在步骤(d)中获得的细胞的步骤。
23.按照权利要求13的方法，还包括遗传修饰所述不大于10个发育周的动物胰腺细胞的初始步骤。
24.通过权利要求13的方法获得的功能性动物胰腺细胞，其中所述细胞是胰腺β细胞。
25.权利要求24的胰腺β细胞，其中所述细胞对葡萄糖应答时表达胰岛素。
26.按照权利要求24到25的胰腺细胞，其中所述细胞是人类细胞。
27.按照权利要求24和25的胰腺细胞，其中所述细胞是大鼠细胞。
28.作为药物的按照权利要求24和25的胰腺细胞。
29.按照权利要求24-26的胰腺细胞用于制备治疗糖尿病的药物的用途。
30.按照权利要求24-26的胰腺细胞用于细胞治疗的用途。
31.按照权利要求24-27的胰腺细胞用于研究糖尿病的生理病理学进展的用途。
32.一种制备不同发育阶段的动物胰腺细胞的方法，其中所述方法包括步骤(a)将有效量的不大于10个发育周的动物胚胎胰腺细胞导入非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺损(NOD/scid)的非人类的动物的肾囊中，其中所述NOD/scid动物是不同于获得所述胚胎胰腺细胞的所述动物的物种；和(b)使动物胚胎胰腺细胞发育、可选择地分化和可选择地再生至少一种胰腺功能；和(c)在不同时期收集在步骤(b)中得到的动物胰腺细胞，和(d)可选择地体外培养在步骤(c)中获得的细胞。
33.通过权利要求32的方法获得的胰腺细胞用于研究胰腺发育的用途。
全文摘要
本发明提供一种通过植入有效量功能性胰腺细胞在个体中再生胰腺功能的方法，这些胰腺细胞得自不大于10发育周的胚胎胰腺细胞。本发明还提供制备功能性动物胰腺细胞的方法，更确切地是永生化的人β细胞系。本发明还提供治疗糖尿病的方法。以及提供作为药物的胰腺β细胞来治疗糖尿病。
文档编号C12N5/00GK1662644SQ02824787
公开日2005年8月31日 申请日期2002年10月18日 优先权日2001年10月19日
发明者P·切尔尼霍夫, R·沙夫曼, P·拉瓦斯德, J·马莱 申请人:巴黎第七大学, 国家科学研究中心