专利名称：一种人胃癌多药耐药细胞系的制作方法
技术领域：
本发明属肿瘤生物学领域，具体涉及一种人胃癌多药耐药细胞系。
背景技术：
胃癌在我国是死亡率位居前列的恶性肿瘤之一，化疗是胃癌的主要疗法之一，特别对于术后残留癌细胞的清除、防止癌症复发，化疗具有重要的治疗价值。但是，临床上对应用的化疗药物及给药方案的总体评价并不理想，甚至有文献报道胃癌的术后化疗既不能降低复发率，也不能改善预后。研究表明，胃癌化疗失败主要与癌细胞对化疗药物产生多药耐药(multi-drug resistance,MDR)有关,多药耐药成为化疗效果的阻碍。因此，胃癌多药耐药的机制、临床意义及耐药逆转成为肿瘤研究中的热点之一，建立实验需要的胃癌耐药细胞模型更具有重要的意义。·肿瘤细胞的MDR是指肿瘤细胞对某一化疗药物产生耐药后，对其他化学结构及机理不同的化疗药物也产生交叉耐药性。胃癌MDR指癌细胞在接触一种抗恶性肿瘤药后，同时对多种结构不同、作用机制各异的的药物产生了耐受性。国内曾用于MDR研究的胃癌耐药细胞系，多是在体外用抗癌药物逐渐诱导的方法建立的MDR细胞。该类方法建立的细胞系能很好地模拟人类肿瘤化疗过程中经常发生的MDR现象。但此方法建立的MDR细胞，有生物特性和敏感性差异，当处于无化疗药物培养时，稳定性较差，耐药性容易丢失。另外，由该方法建立的细胞产生的MDR机制复杂，如SGC7901/VCR细胞MDR的产生，除P糖蛋白(P_gp)外，还有多药耐药相关蛋白基因MRP等参与，这不利于对MDR现象中单一机制及其逆转的研究，如逆转胃癌细胞mdrl介导MDR的中药活性成分筛选等。
发明内容
mdrl是人类多药耐药基因的基因家族中唯一有功能的耐药基因，编码产物为P糖蛋白(P-gp)。人类的mdrl基因位于7q21. 1，mdrl基因组序列包括28个内含子和26个分割读码框序列，由 Homo sapiens BAC clone CTB-60P12 和 CTB-137N13 from 7, completesequence提供，内含子长度不等,变化在126 15203 bp之间。基于表达载体对插入片段大小的限制，mdrl基因序列太大无法实现表达载体的构建,mdrl cDNA序列长度可以实现。pHaMDRl是缺陷病毒载体，需经包装细胞系提供结构蛋白，才具有感染性，是在敲除癌基因的鼠哈维氏肉瘤病毒的基础上构建而成的。pHaMDRl载体插入mdrl cDNA序列，导入细胞后表达全长的mdrl mRNA。本发明将转录病毒载体pHaMDRl转染包装细胞293T，以产生具有感染性的病毒液。本发明目的是公开一种胃癌多药耐药细胞系，该胃癌多药耐药细胞系可按以下步骤建立(I)将SGC7901细胞放于含100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置37 °C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养；(2)将逆转录病毒载体pHaMDRl转化至DH5 a大肠杆菌，扩增并提取pHaMDRl，对提取的pHaMDRl进行酶切；(3)用lipofectamine 2000转染试剂将酶切后的逆转录病毒载体pHaMDRl转染包装细胞293T，转染后的包装细胞293T继续培养，收集病毒；(4)将病毒液加入步骤(I)所得的SGC7901细胞，37 °C培养6 h后，换用含血清的培养基继续培养；(5)重复上述步骤(4)，将感染后的细胞培养于含60ng / ml秋水仙碱的培养基，培养至克隆形成为止，即得到具有耐药性的SGC7901/mdrl 细胞系。其中，步骤(3)中所收集病毒的病毒滴度为2. 7X IO5 CFU/ml。其中，步骤(5)中每天重复上述步骤(4)，共重复三次。本发明的胃癌多药耐药细胞系是采用基因克隆构建人胃癌多药耐药细胞系，其构建方法是利用逆转录病毒作为载体，将mdrl cDNA基因克隆到胃癌细胞，使其表达有功能的mdrl，产生稳定的耐药性，从而建立胃癌mdr细胞系，以克服上述缺点。·本发明所述的胃癌多药耐药细胞系，可应用于胃癌mdr细胞模型的研究，筛选化疗药物及判断化疗药物的敏感性，分析肿瘤化疗多药耐药机制。利用本发明方法建立的胃癌耐药细胞系，经过细胞克隆检测，并利用SPSS17. 0统计软件进行分析，结果显示，克隆细胞系mdrl mRNA的表达水平、P-gp的表达水平升高，细胞内ADR蓄积量及细胞对ADR的敏感性减少，均区别于亲本细胞SGC7901，接近于SGC7901/VCR。该结果表明，转入的mdr I基因在克隆细胞系中得到了高表达，细胞内的P_gp及mdrl mRNA的表达量显著增加，细胞对化疗药物的耐药性有了较大提高，从而证明mdrl基因编码的P-gp是细胞产生耐药性的机制之一。本发明的优点是①提高了胃癌细胞对化疗药物的耐药性。转入的mdrl基因在感染细胞克隆组得到了高表达，细胞内的P-gp及mdrl mRNA的表达量显著增加，细胞对化疗药物的耐药性有了较大提高，从而证明mdrl基因编码的P-gp是细胞产生耐药性的机制之一；②构建了单一 mdrl介导胃癌MDR的研究平台，为研究胃癌mdrl介导MDR及其逆转打下基础；③利用生物转基因方法建立的胃癌MDR细胞，将为深入研究胃癌MDR提供理想的细胞模型。
图I pHaMDRl质粒图谱。图2秋水仙碱筛选两周的感染组细胞生长情况(100X)，感染细胞突起明显，呈贴壁状。图3感染细胞克隆的外源基因整合检测结果。I为SGC7901 / VCR组；2为SGC7901组；3为感染细胞克隆组；4为阳性对照；M为DNA Marker。图4各组细胞的P-gp表达(400X)。P-gp免疫组化阳性颗粒位于细胞膜，呈棕黄色。①SGC7901/VCR组；②SGC7901 ;③感染细胞克隆组。图5流式细胞仪检测感染后细胞内ADR蓄积量的变动。左侧图为未加ADR组，右侧图为加入ADR组；A为SGC7901/VCR组，B为SGC7901组，C为感染细胞克隆组。实施例实施例I细胞培养
将SGC7901细胞放于含100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置37 °C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养。0. 2%胰蛋白酶消化传代。实施例2 pHaMDRl质粒的转化和扩增
将pHaMDRl加入大肠杆菌DH5 a感受态细胞，冰上作用30 min, 42 °C水浴90 S，冰上作用2 min ;加入400 的LB培养基，37 °C摇床200 r/min 45 min ;随后接种到含100U g/ml Amp的LB冷平板上，将平板倒置入37 °C恒温培养箱培养过夜；用接种环分别挑取已转化质粒pHaMDRl的DH5 a大肠杆菌，37 1摇菌过夜；
实施例3质粒pHaMDRl的包装及病毒滴度测定·
将2 ill lipofectamine 2000转染试剂，加入到含50 U I无血清、无抗生素的培养基的200 u I管中混匀，室温孵育5 min ;将稀释的质粒加入稀释的Lipofectamine 2000中混匀，室温放置20 min，使DNA- Lipofectamine 2000复合物形成；取对数生长的293T细胞，用无抗生素的培养基稀释，以2X IO5个/孔接种于24孔细胞培养板中；培养24 h后，用无血清、无抗生素的培养基洗涤两次，而后加入0. 5 ml洗涤用培养基；从孔的一边至另一边逐滴加入DNA-Lipofectamine 2000复合物到换液后的细胞中，边加边前后摇动培养板，使DNA-Lipofectamine 2000复合物和培养基充分混匀。转染后的包装细胞293T继续培养48 h后，收集上清液，于4 °CU0000 rpm、离心15 min，离心后的上清部分富含病毒即病毒液，将转染后的病毒细胞液用培养基进行稀释，同时再加终浓度为8mg/L的聚凝胺；48 h后培养基中加入60 ng / ml的秋水仙碱培养，每2^3天换液，连续培养I周，一周后计数克隆数，克隆数除以病毒稀释度为病毒滴度。实施例4 SGC7901细胞感染
将SGC7901细胞去除培养基；将病毒滴度测定符合转染要求的病毒液室温解冻后加入细胞，同时加入polybrene使其终浓度为8 mg / L ；37 °C培养6 h后，换用含血清的培养基继续培养；如上感染，每天进行一次，共3次。将感染后的SGC7901细胞培养于含60 ng / ml秋水仙碱的培养基，2 3天换液，直至克隆形成。结果见图2。实施例5感染细胞克隆的外源基因整合检测
按2X 105/ml的细胞密度分别接种SGC7901/VCR、SGC7901、感染细胞克隆组的细胞于25ml的培养瓶中培养；取培养液用0.01 M PBS清洗一次，加入I ml的DNAiso Reagent进行裂解；取细胞裂解液，10，OOOXg 4 °C离心lOmin，得上清；向上清液中加入DNAisoReagent 1/2体积量的无水乙醇,混勻,4，OOOXg室温离心2 min,弃上清,再加入I ml75%的乙醇，洗涤沉淀，12，OOOXg 4 V离心5 min，弃上清；将DNA沉淀在室温下干燥5 15 S，缓加入50 灭菌水溶解，备用。取灭菌的0. 2 ml EP管，依次加入下列试剂，使扩增体系为25 iU :
IOXbuffer2. 5 U I
dNTP (2nM)2. 5 U I
MgC12 (25mM)I. 5 u I
mdrIcDNA 上游引物(50 u M)0. 5 U I
mdrlcDNA 下游引物(50 u M)0. 5 U IDNA2 u I
Taq 酶(5 U/u I)0. 2 U I
ddH2015.3 u I0将上述扩增体系混匀，离心5s后置于PCR仪上扩增，扩增条件为95 °C预变性5min, 94 °C变性30 S，55 °C退火30 S，72 °C延伸50 S，循环30次，最后一个循环结束后72°C延伸5 min。同时以质粒pHaMDRl为模板设为阳性对照。制备I. 2%琼脂糖凝胶，取5 ill PCR扩增产物加样，60 V恒压电泳，溴酚蓝染料迁移至凝胶阳极缘3/4处结束。以DL 2000 DNA Marker作参照,凝胶图像分析仪观察条带的位置，并照像。结果见图3。
实施例6细胞免疫组化检测P-gp的表达
分别选择SGC7901、感染细胞克隆组对数生长期细胞，采用SABC法进行细胞免疫，用tiger图像分析系统，对结果进行半定量分析。用0. 2%胰蛋白酶消化对数生长期细胞至细胞回缩，加培养液终止消化，轻轻吹打制成细胞悬液，调节细胞密度达f2X106/ml，按5 u I/斑点，将细胞悬液滴加于涂有多聚赖氨酸的载玻片上；滴片在4 °C干燥24 h后，4%多聚甲醛固定20 min, 0.01 M PBS充分洗涤；冷风吹干4 6 h，用含0. 3%Triton X-100的0. 01 M PBS溶液透化处理15 min，倾去多余液体，用0.3% H2O2溶液封闭内源性过氧化物酶5 min,0.01 M PBS洗涤；继续用正常羊血清封闭20 min，弃去不洗；兔抗人P-gp多克隆抗体(I: 50)，湿盒内4 °C过夜(12 20 h)，室温复温I h，PBS洗5 minX 3次；生物素化山羊抗兔IgG (1:100),37 V 45 min，PBS洗
5minX3 次；SABC (1:100),37 °C 30 min，PBS 洗 5 minX3 次；DAB 显色，自来水终止；自然晾干，香柏油封片。同时以PBS代替一抗作为阴性对照。结果见图4。实施例7流式细胞仪检测细胞内阿霉素(ADR)的蓄积
用0. 2%胰酶消化对数生长期细胞，调节细胞密度为2 X 105/ml，接种于6孔培养板，培养24 h ;换用含10 u g/ml ADR的RPMI-1640培养液，作用90 min ；0. 2%胰酶消化，收取细胞；用4 °C保存的0.01 M PBS洗涤细胞3次，70%乙醇冰上固定5 min, 2000 rpm室温离心5 min，重悬于冷PBS I ml，备用；用流式细胞仪检测，激发波长为488 nm，接收波长为575nm。同时设同样处理、PBS取代ADR的同种细胞为空白对照。结果见图5。
权利要求
1.一种胃癌多药耐药细胞系，其特征在于胃癌多药耐药细胞系按以下步骤建立(1)将SGC7901细胞放于含100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置37°C、5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养；(2)将逆转录病毒载体pHaMDRl转化至DH5 α大肠杆菌并扩增；(3)用lipofectamine 2000转染试剂将逆转录病毒载体pHaMDRl转染包装细胞293T，转染后的包装细胞293T继续培养，收集病毒；(4)将病毒液加入步骤(I)所得的SGC7901细胞，37 °C培养6 h后，换用含血清的培养基继续培养；(5)重复上述步骤(4)，将感染后的细胞培养于含60ng / ml秋水仙碱的培养基，培养至克隆形成为止，即得到具有耐药性的SGC7901/mdrl细胞系。
2.权利要求I所述的一种胃癌多药耐药细胞系，其特征在于，步骤(3)中收集病毒的病毒滴度为 2. 7 X IO5 CFU/ml。
3.权利要求I所述的一种胃癌多药耐药细胞系，其特征在于步骤(5)中重复上述步骤三次，每天一次。
4.权利要求I所述的一种胃癌多药耐药细胞系，可应用于胃癌mdr细胞模型的研究。
全文摘要
本发明公开了一种胃癌多药耐药细胞系。该胃癌多药耐药细胞系是采用基因克隆构建人胃癌多药耐药细胞系，其构建方法是利用逆转录病毒作为载体，将mdr1cDNA基因克隆到胃癌细胞，使其表达有功能的mdr1，产生稳定的耐药性，从而建立胃癌mdr细胞系。该方法建立的人胃癌多药耐药细胞系，提高了胃癌细胞对化疗药物的耐药性，同时构建了单一mdr1介导胃癌多药耐药的研究平台，在研究胃癌mdr1介导多药耐药及其逆转的作用机理以及深入研究胃癌多药耐药提供细胞模型等方面具有应用前景。
文档编号C12N15/867GK102787098SQ20121032296
公开日2012年11月21日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者侯锐, 包巍, 李勇莉, 李晋雪, 李红军, 王国栋, 程珊, 路军秀, 高福莲 申请人:新乡医学院