专利名称：一种检测西尼罗病毒抗体的重组抗原蛋白、试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种诊断西尼罗病毒抗体的重组抗原蛋白及其制备方法，以及以该抗原蛋白作为包被抗原的西尼罗病毒检测试剂盒。
背景技术：
西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)属黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒，与圣路易斯脑炎病毒(Saint-Louis encephalitis virus)和墨累河谷热病毒(MurrayValley fever virus)同属日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)血清群， 可引起人和动物发生西尼罗河热和西尼罗病毒脑膜脑炎，库蚊属的蚊子是其主要的传播媒介，鸟类是该病毒的中间宿主，而人和马则是终端宿主。WNV病广泛分布于非洲、中东、欧洲的部分地区，以及前苏联、印度、印度尼西亚和亚洲的热带地区等。1999年夏季，WNV首次登陆美国，随后几年内在北美和中美洲迅速传播，导致美国和加拿大等国家历史上虫媒病毒感染的最大流行。虽然我国至今没有WNV疫情发生，但周边国家和地区己经爆发该疫病，随时有输入性传播的可能，而且作为一种潜在的生物战剂，存在被用于生物恐怖袭击的可能，加强相关领域的技术储备，对于我国的公共卫生及生物安全保障具有重要意义。目前用于病毒免疫学检测方法中，酶联免疫吸附试验(ELISA)方法速度快，对实验要求不高，并能自动化、高通量的检测大量样品，同时也具有灵敏度高、可靠性强的优势，并且已经在不同的病原体检测中得到广泛应用，其操作已被广大基层卫生防疫人员熟练掌握，具有较高的应用价值。免疫胶体金快速诊断技术则是基于酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、免疫胶体金技术的新型技术，于1989年首次用于检测抗人类免疫缺陷病毒的抗体，其操作更为简便快速，只需几分钟，阳性反应肉眼可见，不需特殊仪器，不受环境温度影响，试剂稳定易长期保存、特异性和敏感性均较高等优点，特别适用于野外以及实验条件不具备的场所使用，并已在多种病毒的检测中得到应用。在基层单位，以上两种方法有其他方法无法代替的优势，而其关键均在于特异性强、亲和力高抗原的制备，以提高特异性及检出率。现有技术中，关于西尼罗病毒免疫学诊断方法的研究方面，国内也已经见过多篇报道，但由于不同虫媒病毒之间存在严重的血清学交叉反应，在那些存在多种虫媒病毒流行的区域，由于混合感染，患者体内存在交叉抗体，使得免疫学诊断及鉴别诊断十分困难。同时，由于IgG抗体可以在宿主体内存在很长时间，有的超过10个月，甚至终生携带，使得鉴别过去、最近还是现在感染也十分困难，对抗原的质量也提出了更高的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供一种检测西尼罗病毒抗体的重组抗原蛋白及其制备方法，该重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与西尼罗病毒抗体具有极高亲和力。
本发明的所解决的技术问题在于提供一种西尼罗病毒的检测试剂盒，利用所制备的重组抗原蛋白，建立西尼罗病毒抗体的ELISA快速检测技术。为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供一种检测西尼罗病毒的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列。优选地，所述重组抗原蛋白的编码基因序列具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。该重组抗原蛋白是通过选择西尼罗病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，并将该目的基因片段通过原核表达载体导入宿主细胞中进行表答而制备得至IJ，该目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。另一方面，本发明具体实施方式
中还提供了一种检测西尼罗病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，包括如下步骤
一、选择西尼罗病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQID NO. I所示氨基酸序列。优选地，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下正向引物CGGGATCCCCACCAGGCACTTCAGATCCA〈SEQID NO. 3>反向引物ACGCAAGCTTTTAGGCAATCTCATTCCCCATCTT〈SEQID NO. 4>。优选地，在本发明的一个具体实施例中所述原核表达载体选用pMAL c2x原核表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。对于本发明的重组抗原蛋白，其具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与西尼罗病毒抗体具有极高亲和力。在本发明的实施例中，通过将表达获得的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，验证了本发明的重组抗原蛋白具有极高的特异性，并获取了能高效表达西尼罗病毒特异性重组抗原的基因工程菌株，同时结合采用了该重组抗原蛋白的西尼罗病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白在用于检测西尼罗病毒时表现出的高灵敏度、高特异性的优势。对于本发明的重组抗原蛋白制备方法，由于其选择了西尼罗病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠，同时结合上述方案中涉及的专用引物，有效地获取了该目的基因，同时结合该方法中采用的原核表达载体和表达宿主菌，使重组抗原蛋白具备高效的表达效果。另外，在本发明的实施例中，通过将表达获得的抗原蛋白经SDS-PAGE分离后，用病毒抗血清进行Western-blot，同时结合采用了该重组抗原蛋白的西尼罗病毒检测试剂盒在其灵敏度试验、特异性试验结果，更进一步地说明了本发明的重组抗原蛋白的制备方法在高效表达重组抗原蛋白、以及保证本发明重组抗原蛋白的高灵敏度、高特异性方面表现出的优势。另外，本发明还提供了一种西尼罗病毒的检测试剂盒，包括抗体检测板和ELISA反应液，所述抗体检测板上包被有检测西尼罗病毒的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列。其中，试剂盒中ELISA反应液包括酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，酶结合物工作液，阳性对照为西尼罗病毒抗体标准品，阴性对照为西尼罗病毒抗体阴性血清。
优选地，在本发明具体实施例中所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG0优选地，在本发明的一个具体实施例中，所述抗体检测板的制备过程包括如下步骤一、重组抗原蛋白的制备，包括如下步骤(I)、选择西尼罗病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；(2)、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；(3)、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；(4)、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQID NO. I所示氨基酸序列；二、将纯化后的重组抗原蛋白固定于酶联板，该过程包括将步骤一中纯化得到的重组抗原蛋白分别以梯级浓度包被酶联板，每孔50-200ul，4°C包被过夜，而后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤1-2分钟；将其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37°C封闭1-3小时，晾干后即得到所述抗体检测板。再则，结合本发明的重组抗原蛋白用于西尼罗病毒的检测试剂盒的具体实施方式
，充分说明了本发明的重组抗原蛋白在制备诊断西尼罗病毒试剂盒中的运用，能够保证西尼罗病毒诊断过程中的灵敏度和特异性。还需要说明的是，本发明的研发单位为全军及广东省虫媒病毒专业实验室，收集了国内较为全面的虫媒病毒毒株，并制备了其标准血清，为重组抗原蛋白的特异性验证奠定了良好基础。结合实施例中揭示的实验内容可以看出，实验中在保证反应原性的基础上，尽量缩短了抗原片段长度，确保所筛选的原核表达抗原具备良好的特异性，与所测试的辛德毕斯、西门利克、马雅罗、罗斯河、鹭山、盖塔、基孔肯雅、登革广4型、流行性乙型脑炎及黄热病毒均无交叉反应，S/N比值在25以上。同时，所建立的制备方法及西尼罗病毒的检测试剂盒均具备较高灵敏度及检出范围，以西尼罗病毒小鼠免疫血清进行的实验表明，在血清I :10(Tl :25600倍稀释范围内，均可获得阳性结果，检测OD值在O. 19以上，而且无非特异性结果。
图I是本发明实施例I中西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、登革I型病毒多克隆抗体与原核表达抗原的western blot杂交结果；其中，a: SDS PAGE电泳图；b :西尼罗病毒病毒多克隆抗体Wester blot结果；c :乙型脑炎病毒多克隆抗体Wester blot结果；d:登革I型病毒多克隆抗体Wester blot结果。I.未诱导对照；M.蛋白分子量Marker; 2. WnV 16+pMALc2x;3. pMAL c2x0图2本发明实施例2中抗原包被浓度实验结果图。
图3是本发明实施例2中ELISA试剂盒及其应用；其中，b:ELISA特异性实验，Al孔加登革I型病毒抗体，BI为登革2型病毒抗体，Cl为登革3型病毒抗体，Dl为登革4型病毒抗体，El为乙型脑炎病毒抗体，Fl为黄热病毒抗体，Gl为西尼罗病毒抗体，Hl为马雅罗病毒抗体，A2孔加罗斯河病毒抗体，B2为鹭山病毒抗体，C2为盖塔病毒抗体，D2为基孔肯雅病毒抗体，E2为辛德毕斯病毒抗体，F2为西门利克病毒毒抗体，G2为阴性血清，H2为空白对照；c :ELISA敏感性实验，正交法法将鼠抗西尼罗病毒多克隆抗体进行稀释，测定ELISA方法敏感性，其中Al为鼠抗西尼罗病毒多抗1:200倍稀释，并由Al-Hl做系列倍比稀释，随后由第一列向第四列做系列倍比稀释。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。本发明的下列实施例中，选用的西尼罗病毒国际标准株由中国药品生物制品检定所引进，申请人实验室内有毒株样本；而实验中用的内切酶、连接酶、T载体购自大连TaKaRa公司。凝胶纯化回收及质粒快速提取试剂盒购自OMEGA公司。Trizol及反转录试剂购自Invitrogen公司。pET32a表达载体购自Novagen公司，pMAL_C2x表达载体购自New England Biolabs公司，Amylose Resin亲和层析试剂购自NEB公司，表达宿主菌Rosetta (DE3)由本实验室传代保存。实施例I、检测西尼罗病毒的重组抗原蛋白的制备按照如下步骤制备检测西尼罗病毒的重组抗原蛋白步骤一、选择西尼罗病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠；步骤二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段；步骤三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒；步骤四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列。具体实现实现时，上述步骤一中，参考西尼罗病毒基因组序列，利用DNAstar及ANTHEPR0T软件对其编码蛋白疏水性、抗原性、可及性及可塑性进行详细分析，并参考Genbank中的序列信息，对预测的抗原表位进行比对，初步筛选可能的抗原性片段30段。步骤二中，根据步骤一种所选的抗原性片段，并结合多肽结构中需要的延伸区段，并通过优化设计与各区段对应的引物，通过PCR扩增相应的目的基因片段，从而使由延伸区段编码柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。为此，在本步骤的优选过程中，设计PCR扩增引物30对，如表一所示表一抗原片段克隆所用引物序列·
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权利要求
1.一种检测西尼罗病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于所述重组抗原蛋白具有如SEQ ID NO. I所示氨基酸序列。
2.根据权利要求I所述的检测西尼罗病毒抗体的重组抗原蛋白，其特征在于所述重组抗原蛋白的编码基因序列具有如SEQ ID NO. 2所不的核昔酸序列。
3.—种检测西尼罗病毒抗体的重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 一、选择西尼罗病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折置； 二、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段； 三、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒； 四、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ IDNO. I所示氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中采用的PCR扩增引物序列如下 正向引物CGGGATCCCCACCAGGCACTTCAGATCCA〈SEQ ID NO. 3> 反向引物ACGCAAGCTTTTAGGCAATCTCATTCCCCATCTT〈SEQ ID NO. 4>0
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述原核表达载体为pMALc2x原核表达载体，所述表达宿主细胞为大肠杆菌。
6.一种西尼罗病毒的检测试剂盒，包括抗体检测板和ELISA反应液，其特征在于所述抗体检测板上包被有检测西尼罗病毒抗体的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQID NO. I所示氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中ELISA反应液包括酶结合物工作液，阳性对照，阴性对照，浓缩洗涤液，显色液A，显色液B和终止液，酶结合物工作液，阳性对照为西尼罗病毒抗体标准品，阴性对照为西尼罗病毒抗体阴性血清。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于所述酶结合物工作液为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG。
9.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述抗体检测板的制备过程包括如下步骤 一、重组抗原蛋白的制备，包括如下步骤 (1)、选择西尼罗病毒蛋白中呈现病毒高特异性肽段的编码基因作为目的基因片段，该目的基因片段具有如SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，该目的基因片段中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，所述柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折置； (2)、设计PCR扩增引物，并通过PCR扩增所述目的基因片段； (3)、通过限制性酶切和连接，将目的基因片段体连接到原核表达载体中，构建含有所述目的基因片段的重组表达质粒； (4)、将所述重组表达质粒转化至感受态的表达宿主细胞中，培养所述表达宿主细胞使其产生重组抗原蛋白，并通过纯化获取重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白具有如SEQ IDNO. I所示氨基酸序列； 二、将纯化后的重组抗原蛋白固定于酶联板，该过程包括将步骤一中纯化得到的重组抗原蛋白分别以梯级浓度包被酶联板，每孔50-200ul，4°C包被过夜，而后用磷酸盐吐温缓冲液洗涤1-2分钟；将其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37°C封闭1-3小时，晾干后即得到所述抗体检测板。
10.如权利要求I或2所述的重组抗原蛋白在制备诊断西尼罗病毒试剂盒中的运用。
全文摘要
一种检测西尼罗病毒抗体的重组抗原蛋白，所述重组抗原蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，该编码基因序列中包括编码重组抗原蛋白柔性臂的延伸区段，柔性臂能够消除表达载体的融合蛋白对多肽表位的掩盖，使表达的重组抗原蛋白正确折叠。本发明还公开了该重组抗原蛋白的制备方法。另外，本发明公开的西尼罗病毒的检测试剂盒中包含包被有上述重组抗原蛋白的抗体检测板和ELISA反应液。本发明的重组抗原蛋白具有特异性强、亲和力高的优点，与其它相近的虫媒传播病毒无血清学交叉反应，而与西尼罗病毒抗体具有极高亲和力，能够快速、准确地检测西尼罗病毒抗体，从而诊断西尼罗病毒的感染情况。
文档编号C12N15/70GK102827261SQ20121032256
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者任瑞文, 唐博恒, 骆康杰, 胡文龙, 梁克峰 申请人:任瑞文