专利名称：洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(fps)基因真核表达载体的构建及转化的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种洋甘菊法尼基焦磷酸合酶基因克隆及真核表达与应用。
背景技术：
洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)为菊科母菊属的一年生草本植物，全草芳香，含有芳香性挥发油。洋甘菊具有消炎、抑制真菌、解痉[1_3]、改善肺癌病人症状等作用。洋甘菊原产欧洲，本世纪初引种我国，现北京，上海、江苏、湖南等地少有栽培。洋甘菊含有多种化学成分挥发油、黄酮苷类、愈创奥内醋类、香豆精素、多糖类、有机酸等成分。洋甘菊挥发油是花序中最主要的有效成分，其挥发油由于独特的香气而广泛用于食品、饮料、烟草、日化、医药等领域中，是一种极具开发价值的药用植物和香料植物。洋甘菊花中精油含量在
0.2% 0.8%，最高可达1.9%。洋甘菊挥发油呈暗蓝色，芳香，久置或在日光照射下不久既可变成绿色，直至呈褐色。作为一种很有经济价值的植物，在我国尚未得到充分的开发及利用。母菊奥(I，4- 二甲基-7-乙基奥)属于倍半萜类物质，是母菊挥发油中最有价值的成分之一，欧洲各国常根据它在挥发油中的含量，作为评定药材质量的标准。因产地、生长条件的差异及化学变种的存在，各地洋甘菊挥发油中的蓝香油奥的含量往往变化很大，据欧洲某些国家的资料，蓝香油奥在挥发油中的含量可在0 18. 8%之间。母菊奥在花盛开时的含量最高。母菊奥及其合成衍生物愈创奥均有消炎作用。愈创奥对大鼠的右旋糖配性浮肿有显著抑制作用对透明质酸酶、甲醛、组织胺性浮肿仅有中等程度的抑制。为了更好地开发利用我国引种的洋甘菊资源，杨彦松等对新疆洋甘菊头状花序中的黄酮类化学成分进行了研究，从其95%乙醇提取物中分离得到2个黄酮类化合物。目前，虽然国内外很多文章报道了洋甘菊挥发油成分分析，及洋甘菊挥发油抗炎，抗肿瘤及对小鼠伤口愈合的促进作用等。但尚未有洋甘菊挥发油中控制母菊奥代谢途径有关酶类及基因的研究。母菊奥的代谢途径为异戊二烯生物合成途径，此过程有三个比较重要的限速酶，分别是HMG-CoA还原酶(HMGR)，法尼基焦磷酸合酶(FPS)和倍半萜合酶。法尼基焦磷酸合酶(FPS)是控制母菊奥合成的关键酶，利用基因工程技术克隆FPS基因，借助根癌农杆菌侵染洋甘菊的愈伤组织，可提高母菊奥产量，对医药行业贡献极大。
发明内容
本发明的目的是提供一种洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因真核表达载体的构建及转化方法。本发明采用如下技术方案一种洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因真核表达载体的构建及转化方法，具体按如下步骤进行
(I)洋甘菊FPS RNA的提取从洋甘菊花瓣中提取RNA，保存在_70°C冰箱中备用；(2)洋甘菊FPS基因RT-PCR扩增根据洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全长序列设计引物上游引物5’(BamHI) CG GGATCC ATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3’下游引物5，(SacI)CGAGCTC CTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3’
其中GGATCC与GAGCTC分别为BamHI和SacI的酶切位点；以洋甘菊总RNA为模板，反转录为cDNA ;然后以反转录的单链cDNA为模板,采用TransStart Taq DNA Polymerase进行PCR扩增；用PCR纯化回收试剂盒回收目的片段，_20°C保存；(3) PCR扩增产物的阳性克隆和鉴定克隆载体pEASY_T4Zero Cloning vector连接4. 5iUPCR产物+0. 5iUT载体，25°C连接13分钟；转化取50 ill DH5a感受态加入5 U I上述连接产物，冰上放置20_30min. 42°C热激30s，立即放在冰上2-3min，加入400 U I不加AMP的液体LB培养基；37°C，200转孵育培养Ih ;取IOOu I培养液均匀涂布于AMP, IPTG, X-gal的平板上；37°C倒置培养12_16h ;挑白色单菌落于Iml含AMP的LB培养基中，37°C振荡培养5_6h，采用M13引物进行菌液PCR鉴定，以降低假阳性的干扰；筛选阳性重组克隆进行DNA测序，用DNAMAN序列分析软件对测序结果进行分析；(4)质粒提取按照质粒提取试剂盒的步骤分别提取克隆载体T和表达载体PBI121 ；(5)双酶切使用BamHI和SacI两种限制性内切酶对T质粒和PBI 121质粒进行切割，20 iU体系37°C切3小时，然后加IOXBufTer 2ml终止反应，跑胶观察质粒是否被切开；切开后，切胶回收T质粒和PBI121质粒中实验所需要的片段；双酶切体系lul, SacI Iul,IOx K Buffer I U I,质粒8 U 1，灭菌水定容至20 U I ;(6)切胶回收针对双酶切后的克隆载体T和表达载体PBI121，采用切胶回收试剂盒根据实验所需进行回收基因片段；(7)重组质粒pBI121/FPS的构建T4连接酶连接体系T4连接酶I yl，T4Buffer lul,表达载体I. 5 iU，目的片段6. 5 ill ;在PCR仪中16°C连接16h ;取上述连接产物5 U I加入50 的DH5a的感受态细胞中进行转化；摇菌I. 5h，涂板，37°C倒置培养16h ;挑单菌落摇菌，PCR鉴定和酶切验证重组子。(8)重组子导入感受态农杆菌取_70°C保存的EHA105农杆菌感受态细胞置于冰上融化，分别向200 感受态细胞中加入8 ii I表达载体质粒,混勻；冰浴30min,转入液氮中速冻lmin,37°C温育5min,迅速放置冰上2min ;然后加入800iilLB液体培养基，28°C，200rpm/min振荡培养5h ;取300 u I培养液均匀涂布于含80ii g/mlKan的平板上，待菌液被吸收后倒置培养皿；28°C暗培养1-2天，挑取单菌落，280C，200rpm/min振荡培养；取上述转化菌液用PCR法进行检测。
法尼基焦磷酸合酶(FPS)是控制母菊奥合成的关键酶，本发明利用基因工程技术克隆FPS基因，借助根癌农杆菌侵染洋甘菊的愈伤组织，可提高母菊奥产量，对医药行业贡献极大。以下结合附图通过具体实施方式
对本发明技术方案做进一步说明。
图I是洋甘菊总RNA电泳图。图2是洋甘菊FPS基因ORF框的PCR结果。图2中M为DNA分子量标准I为PCR产物。图3是切胶纯化回收前后的目的DNA图谱。
图3中M为DNA分子量标准I为胶回收产物。图4是蓝白斑筛选照片。图5是M13引物菌液PCR。图5中M是.DNA分子量标准I是菌液PCR产物。图6为提取的T质载体电泳图谱。图6中M为DNA分子量标准；I为提取的T质粒.图7为提取的表达载体PBI121电泳图谱。图7中M为DNA分子量标准；1为提取的表达载体PBI121。图8是双酶切电泳图。图8中M是DNA分子量标准，I是双酶切的T质粒，2是未酶切的T质粒，3是双酶切的PBI121质粒，4.是未酶切的PBI121质粒。图9是PBI121/FPS的PCR鉴定电泳图。图9中M是DNA分子量标准，I是菌液PCR产物。图10是转化到根癌农杆菌EHA105的PBI121-FPS质粒菌液PCR鉴定电泳图。图10中M是DNA分子量标准I是菌液PCR产物。
具体实施例方式I.材料与方法I. I实验材料I. I. I植物材料洋甘菊花(采自安徽农业大学农萃园)、云烟85烟草无菌苗(安徽农业大学生命科学学院组织培养室提供)。I. I. 2菌株和质粒大肠杆菌DH5a感受态细胞购于TAKARA公司，农杆菌EHA105，PBI121载体是安徽农业大学生命科学院江海洋老师惠赠，pEASY-T4 Zero Cloning Vector和Transl-Tl感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司。I. I. 3主要生物学试剂限制性内切酶SacI、BamHI，T4DNA连接酶，rtaq均购于TAKARA公司，TransStart Taq DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司，RNAisoplus, DNA分子量标准，DNA胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒购于TAKARA公司，引物合成及DNA序列测定由英骏生物技术有限公司完成，其他试剂均为国产分析纯。I. 2试验方法
I. 2. IRNA 的提取液氮研磨0. 2g洋甘菊花瓣至粉末状,2ml RNAiso plus,覆盖样品，室温静置15min。至样品完全融化，再用研杵研磨至裂解液呈透明状。将匀浆转移至离心管，室温静置5min。12000rpm，4°C，15min，吸取上清。加200ul氯仿，剧烈震荡15s，待溶液充分乳化。12000rpm，4°C，15min，吸取上层水相。加600ul异丙醇，上下颠倒混匀，15_30°C下静置IOmin. 12000rpm, 4°C, IOmin,去上清。加 lml75% 乙醇，12000rpm, 4°C, 5min,去乙醇。室温干燥2-5min，加入20ulDEPC水。将提取的RNA保存在_70°C冰箱中备用。I. 2. 2洋甘菊中FPS基因RT-PCR扩增根据洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全长序列设计出引物上游引物5’(BamHI) CG GGATCC ATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3’下游引物5，(SacI)CGAGCTC CTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3，其中GGATCC与GAGCTC分别为BamHI和SacI的酶切位点。以洋甘菊反转录的单链cDNA为模板，设定一定梯度的引物退火温度，采用TransStart Taq DNAPolymerase 进行 PCR 扩增。TransStart Taq DNA Polymerase 延伸速度为l-2kb/min，扩增产物3’端带“A”碱基，可直接用于TA载体克隆。反应体系25iU反
应体系
权利要求
1.一种洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因真核表达载体的构建及转化方法，具体按如下步骤进行 (1)洋甘菊FPSRNA的提取 从洋甘菊花瓣中提取RNA，保存在_70°C冰箱中备用； (2)洋甘菊FPS基因RT-PCR扩增 根据洋甘菊法呢基焦磷酸合酶mRNA全长序列设计引物 上游引物5’ (BamHI) CG GGATCC ATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3’ 下游引物5’(SacI)C GAGCTC CTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3’ 其中GGATCC与GAGCTC分别为BamHI和SacI的酶切位点；以洋甘菊总RNA为模板，反转录为cDNA ;然后以反转录的单链cDNA为模板；采用TransStart Taq DNA Polymerase进行PCR扩增；用PCR纯化回收试剂盒回收目的片段，_20°C保存； (3)PCR扩增产物的阳性克隆和鉴定 克隆载体pEASY_T4 Zero Cloning vector 连接4. 5ulPCR产物+0. 5ulT载体，25°C连接13分钟； 转化取50 μ I DH5a感受态加入5μ I上述连接产物，冰上放置20_30min. 42°C热激.30s，立即放在冰上2-3min，加入400 μ I不加AMP的液体LB培养基；37°C，200转孵育培养Ih ;取100 μ I培养液均匀涂布于AMP, IPTG, Χ-gal的平板上；37°C倒置培养12_16h ;挑白色单菌落于Iml含AMP的LB培养基中，37°C振荡培养5_6h，采用M13引物进行菌液PCR鉴定，以降低假阳性的干扰；筛选阳性重组克隆进行DNA测序，用DNAMAN序列分析软件对测序结果进行分析； (4)质粒提取 按照质粒提取试剂盒的步骤分别提取克隆载体T和表达载体PBI121 ； (5)双酶切 使用BamHI和SacI两种限制性内切酶对T质粒和PBI121质粒进行切割，20ul体系.37°C切3小时，然后加IOXBufTer 2ml终止反应，跑胶观察质粒是否被切开；切开后，切胶回收T质粒和PBI121质粒中实验所需要的片段；双酶切体系=BamHI I μ 1，SacIl μ I, IOx KBuffer I μ I,质粒8 μ I,灭菌水定容至20 μ I ; (6)切胶回收 针对双酶切后的克隆载体T和表达载体ΡΒΙ121，采用切胶回收试剂盒根据实验所需进行回收基因片段； (7)重组质粒pBI121/FPS的构建 Τ4连接酶连接体系Τ4连接酶1μ 1，T4Buffer I μ 1，表达载体I. 5 μ 1，目的片段.6.5 μ I ;在PCR仪中16°C连接16h ;取上述连接产物5 μ I加入50 μ I的DH5a的感受态细胞中进行转化；摇菌I. 5h，涂板，37°C倒置培养16h ;挑单菌落摇菌，PCR鉴定和酶切验证重组子。
(8)重组子导入感受态农杆菌 取_70°C保存的EHA105农杆菌感受态细胞置于冰上融化，分别向200 μ I感受态细胞中加入8μ I表达载体质粒,混勻；冰浴30min,转入液氮中速冻lmin,37°C温育5min,迅速放置冰上2min ;然后加入800 μ ILB液体培养基，28°C，200rpm/min振荡培养5h ;取300ul培养液均匀 涂布于含80 μ g/mlKan的平板上，待菌液被吸收后倒置培养皿；28°C暗培养1_2天，挑取单菌落，280C，200rpm/min振荡培养；取上述转化菌液用PCR法进行检测。
全文摘要
本发明公开了一种洋甘菊法尼基焦磷酸合酶(FPS)基因真核表达载体的构建及转化方法，从洋甘菊花瓣中提取RNA，以洋甘菊总RNA为模板，反转录为cDNA；然后以cDNA为模板；进行PCR扩增；得到目的片段，目的片段与T4连接酶连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到真核表达载体PBI121/FPS，然后将重组表达载体导入根癌农杆菌EHA105后，根癌农杆菌EHA105侵染模式植物云烟85等过程，最终获得抗性烟草植株。本发明利用基因工程技术克隆FPS基因，借助根癌农杆菌侵染植株的愈伤组织，通过FPS基因在植物体内的表达为提高母菊薁产量作铺垫。
文档编号C12N15/66GK102816784SQ201210322250
公开日2012年12月12日 申请日期2012年9月4日 优先权日2012年9月4日
发明者袁艺, 杨秀梅, 邰玉玲 申请人:安徽农业大学