专利名称:重组体杆状病毒载体中乙型肝炎病毒抗原的表达的制作方法
本发明涉及生产人体病毒性乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及其有关的Pre-S2蛋白质的方法。
人体乙型肝炎病毒HBV，即hepadna病毒种群之一是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常见病因。该病毒基因组包括小圆形的、部分是单链的脱氧核糖核酸(DNA)物种，在病毒颗粒中与病毒DNA聚合酶相连接。DNA聚合酶的功能使病毒DNA成为双股形式，以及在感染细胞内复制病毒DNA。HBV具有肝细胞向性。人们相信这种向性的分子基础存在于病毒颗粒的表面蛋白中，在开始感染的某个阶段，与存在于受纳细胞上的细胞结构(受体)反应。细胞和人体受感染开始可被由人体抗外源病毒蛋白中产生的抗体阻滞。人们通常从急性病开始感染，常常导致长期的慢性病，包括高浓度病毒抗原(某些以所谓22毫微米非感染形式颗粒或澳大利亚病毒抗原)和42毫微米感染病毒(“Dane颗粒”)在传染期的患者血液中循环的持续性病毒感染。还在其他体液中发现病毒和病毒抗原(精液、唾液、鼻咽分泌物、经血、腹水、胆汁、泪液、乳液、脑脊髓液等)，及随环境传播的病毒。人体“病原携带者”在急性感染期和慢性感染期，对疾病的流行病学都是重要的。
脂膜小球结构形式的所谓22毫微米颗粒(15～22毫微米)是作为受纳细胞活性病毒感染的副产品产生的。它主要由包埋在脂膜中的病毒(主要为HBsAg及一些Pre-S2)表面蛋白(抗原)组成。还在患者血液中发现含这些抗原的其它病毒诱发结构是丝状或杆状结构(有22毫微米宽，但有几百毫微米长)。HBsAg是用病毒遗传信息表示蛋白组分的病毒编码糖蛋白(有多至3个碳水化合物侧链的蛋白)，以及用病毒所生长的细胞机器表示碳水化合物组分。像传染病毒那样，22毫微米脂类组分和其它颗粒是由病毒所生长的宿主细胞脂膜衍生的。这样，脂类和碳水化合物组分都可用细胞表示。HBsAg蛋白序列、其内在的抗原结构和碳水化合物侧链的附着位点，以及植入在脂类内的HBsAg蛋白部分都用病毒遗传序列表示。球形42毫微米传染的病毒颗粒包括DNA内部核心和结合DNA聚合酶，其包括由7毫微米脂类组成的外壳包围的核心抗原(HBcAg)和“e”抗原(HBeAg)、HBsAg和一些Pre-S2蛋白。Pre-S2是病毒和其它病毒诱发结构的微量组分，可代表对HBsAg不完全处理的蛋白质前体，因为它含有整个HBsAg序列及在HBsAg的氨基末端(“上游”)大约55个额外氨基酸。
在由BN Fields编的“Virology”(Raven Press)NW.1392页图5中表示的包含大约3200碱基长HBV(Robinson，1985年)的限制性内切酶位点(Bam HI，Acc I，等)的位置。在部分双股病毒DNA的完全(长)链中DNA具有4个开译读码(ORF)，ORF包括可从互补信使核糖核酸(mRNA)序列转译成氨基酸(蛋白质)连接序列的DNA核苷酸序列。ORF-2包含表达处于同相和163个氨基酸“Pre-S”序列下游的大概25，000道尔顿HBsAg(约200个氨基酸)的序列。不能确定HBcAg和Pre-S2蛋白质是如何由ORF-2编码序列衍生而来，ORF-3编码用于相当于HBcAg(190～220个氨基酸)的主要核心蛋白。ORF-1(多半是病毒聚合酶)和ORF-4的基因产物是否相同还未肯定。
人受HBV感染通常包括熟友(常经皮肤接触)血清和含个人之间物质的血清的传输(此处为血清性肝炎的又一名称)。该疾病特别流行于发展中国家，如中国、大洋洲、南太平洋、非洲、中东及南美洲和印度的某些地区，在东南亚的一些国家中这种患病率很高(5～20%)，然而这种病还发生在世界的其它地区，尤其在特殊的少数民族人群之中，即与慢性病毒携带者的密切接触、与急性乙型肝炎患者的性接触、受感染母亲的新生儿、性乱交者、共用注射针的违法吸毒者、接受血制品的血友病患者、血液渗析患者及与其接触者，以及医护人员(牙医师、护士、外科医师、临床化验室工作人员)。肝癌细胞和乙型肝炎病毒感染的结合被认为是由于从慢性抗原血症导致慢性肝炎、肝硬化，然后肝细胞瘤发展的起始病毒感染。
诊断受乙型肝炎病毒的感染，通常从疾病患者的临床主诊开始，继之以检查妨碍患者代谢的生化试验(转氨酶、胆红素等)。在乙型肝炎病毒感染开始以后，产生对HBcAg、HBsAg和HBeAg的抗体，由此鉴定血液中的病毒抗原(包括病毒)(粪便等;1～6月;放射免疫测定〔RIA〕，酶连接的免疫吸附剂测定〔ELISA〕，免疫电泳法，血凝反应等)，或病毒特殊抗体的存在(例如用RIA、ELISA、免疫电泳法、血凝反应等鉴定早期免疫球蛋白M抗HBcAg〔2～8月〕;免疫球蛋白G抗HBeAg〔4～10个月〕和免疫球蛋白G抗HBcAg〔5～6月和终生〕，从而诊断乙型肝炎病毒的感染。
虽然细节并未肯定，可相信受纳细胞中涉及到HBV的感染过程包括基因组从病毒衣壳组分中脱出，病毒DNA移位至细胞核，病毒DNA的合成使DNA基本上成圆形，在基因组中mRNA的转录和从病毒启动子完全RNA复制，RNA移位至细胞质，病毒蛋白物种从mRNA物种转译，以及从病毒RNA转录本的基因组DNA复制的蛋白首次接触抗原(逆转录作用)。最后，形成病毒核心结构，包括部分连接核心抗原(蛋白)基因组的双股DNA形式。转译以后，HBsAg(和Pre-S2)的处理和移位至细胞表面，在细胞表面发生核心结构的包膜。病毒从细胞表面释放使其它细胞受感染。从包含22毫微米颗粒和丝状形而缺乏病毒DNA但具有HBsAg的未成结构的感染细胞的释放，也发生在细胞表面。
乙型肝炎病毒表面抗原和相关的Pre-S2蛋白在诊断疾病中，可用作鉴别患者体液中诱发病毒抗体的抗原，或者用于产生为了鉴别患者或其它物质中病毒抗原的参照抗体。HBsAg和Pre-S2蛋白也可用于预防由于接种的感染。
从活的病毒取得HBsAg和Pre-S2蛋白质的现代方法存在着原料不足的不利因素，而任何生产的方法包括对感染的病毒的利用，由于存在着使生产工作者受感染的危险，以及活的病毒传进所需要的产品中的可能性，所以可能是危险的。现今采用的应用重组体DNA技术生产HBsAg和Pre-S2蛋白质的方法包括原核细胞的转化已经证明不是特别有效的。
已经发现，应用以杆状病毒为基础的表达载体感染昆虫或昆虫细胞，可以很容易地生产出HBsAg和Pre-S2蛋白质。
因此根据本发明的一个方面，提供了生产多肽的一种方法，至少包括HBsAg或Pre-S2蛋白质的一种抗原部分，这个方法包括在polyhedrin启动子的表达控制下，用包括具有用于所说的多肽编码的一个DNA片段的重组体杆状病毒表达载体来感染敏感的昆虫或昆虫细胞。
本发明也包括这种重组体杆状病毒本身。
这样，本发明提供包括人体乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和由生长在昆虫或昆虫培养细胞的重组体杆状病毒合成相关的Pre-S2蛋白的产物。该重组体杆状病毒可通过带有传染性杆状病毒DNA的昆虫培养细胞与杆状病毒转移载体质粒的共转染产生，该质粒含有构建代表乙型肝炎病毒抗原和代替杆状病毒多面体(polyhedrin)基因的起始端(5′)编码序列的基因，但是要在残余多面体(polyhedrin)启动子的控制下。表达肝炎抗原的polyhedrin阴性病毒，存在于共转染的子代中是传染性的。当这些病毒生长于昆虫或昆虫培养细胞中时，开始可根据非表现型polyhedrin来选择，接着用以表达乙型肝炎抗原。大多数肝炎抗原由像颗粒的重组体病毒感染细胞分泌，在血清学上和结构上都像22毫微米乙型肝炎颗粒。它们可以用常规方法如差速离心或平衡梯度离心法和色谱法，从昆虫提取液或昆虫培养细胞上清液提纯。
昆虫细胞可以分泌肝炎抗体这个事实，对已经注意到过去未能从其他的重组体系统如由酵母细胞分泌抗原来说是十分惊奇的。再者，十分意外的是集中在类似22毫微米颗粒的颗粒中而发生在一种昆虫或昆虫细胞为基础的系统中。
在本申请中，术语的定义如下质粒(如通常用的pUC8)是含于用受纳细胞(如细菌)复制所需序列的双股DNA的染色体外序列。它是可以通过称为转化的方法引入细胞的一种复制子。
启动子是能从连接启动子的DNA序列(基因)转录信使核糖核酸(mRNA)的DNA序列。mRNA是某单股DNA的复制，mRNA可用来操纵DNA序列中蛋白质的合成(转译)，通过能识别包括启动子的DNA序列的RNA聚合酶催化转录作用。
基因是一片借助其内在序列(连接的或间断的)，决定着氨基酸蛋白质链合成的DNA。
感染是由遗传物质(以DNA形式或病毒)侵入受纳细胞，继而复制该物质。在通过病毒或代表病毒的DNA感染的情况下，可从传染性子代病毒的那些细胞中得到结果。
转染和共转染涉及将遗传物质如一种或多种DNA引入细胞的实验方法，使DNA能感染细胞。凡DNA是共线性的，存在发生重组(交换)过程的可能性。可用包括带有特殊盐类(通常为有磷酸盐、硫酸葡聚糖等参加的氯化钙)沉淀DNA和把生成的混合物用于含有某些DNA的细胞等方法进行转染。
参照附图更详细介绍本发明的HBsAg和Pre-S2的产生图1图2表示构建本发明第一重组体转移载体的方法。
图3表示构建本发明第二重组体转移载体的方法。
图4(a)图4(b)表示在用本发明重组体杆状病毒感染的昆虫细胞培养物上清液进行放射免疫测定的结果。
图5表示从HBV感染患者的血液中分离确实为22毫微米颗粒与上述这种上清液的显微摄影对比。
图6表示通过本发明重组体杆状病毒感染的昆虫细胞随时间而变化的HBV抗原的产生。
按下述进行本发明重组杆状病毒的构建从患者血液中分离乙型肝炎病毒(adw亚类)的DNA，用限制性核酸内切酶Bam HI将DNA消化成特殊碎片(见BN Fields编的“Virology”，Raven Press，NW 1392页图5)。限制性内切酶识别DNA的特殊核苷酸序列，在或邻近那些序列处催化水解。根据酶的特异性，生成的产物都有“钝”端，其中每个衍生的DNA片段的两个DNA链都是等长的，在切割位点都不重叠，也不具有一个单链长于另一个链的“粘性”末端，由限制性内切酶消化的产物最容易用具有互补“粘性”末端的其它酶(连接酶)重连接(例如被连接的Bam HI消化DNA产物一起回复或回复到Bam HI消化另一个DNA的产物)。当DNA片段是有“钝”端时，连接还是可能的。
用Bam HI限制性内切酶消化的HBV DNA产生约1400 HBV DNA碱基对的片段，该碱基对包围(见图1，图2，L单链顺时针方向5′至3′)“Pre-S2”区的附加部分、所有HBsAg ORF-2编码序列和邻近3′序列。大量必需的HBV序列转移后，可按下述进行基因的重新构建。
将含HBsAg序列的Bam HI衍生片段连接到细菌质粒pUc8的Bam HI位点(图1，图2)，该pUc8质粒在特定细菌细胞中复制，并在外来序列如HBV DNA序列插入后，重组体pUc8质粒可以被复制、克隆和选择。重组体pUc8-HBs可用这些方法衍生，即分离并用Bam HI消化它的DNA，然后回收含大量HBsAg基因的Acc I和生成的DNA大片段(图1，图2)。将该片段连接到合成寡核苷酸序列，正确地构建HBsAg转译终止序列，提供连续处理的限制位点(如Bam HI位点)，以及提供代表切割Hind Ⅲ序列的末端序列(“粘性”末端)。这种连接之后，这些产物重新连接到预先用Bam HI和Hind Ⅲ(图1，图2)消化的pUc8质粒，导致形成和回收重组体质粒pHBsYK2。这种重组体质粒的DNA用Bam HI消化，分离含HBV序列的片段，并将其连接到以pAcRP6表示的杆状病毒转移载体。在连接前，转移载体pAcRP6用Bam HI切割。在细菌中克隆后，得到以pAcRP6-HBsYK14表示的重组体质粒转移载体(图1，图2)。转移载体pAcRP6-HBsYK14保存在美国典型菌种保藏委员会，登记号为ATCC 67203(1986年9月12日)。
由Possee(5Virus Research 43页，1986年)，Matsuura等67J.Gen.Virol 67期1515页，1986年)介绍pAcRP质粒转移载体的来源。质粒pAcRP6类似于由Smith、Summers和Fraser(Mol.and Cell.Biol.1983年3卷No.12，2150～2165页)所介绍的从Autographa Californica核多面体病毒(AcNPV)衍生的质粒转移载体，具有合成寡核苷酸短“联结子”序列，含有Bam HI限制性内切酶识别位点代替polyhedrin基因残基-8～+175。其原始polygedrin ATG密码子计作+1至+3(参见Hooft van Iddekinge，Smith和Summers 131 Virology 561页，1983年)。该Bam HI位点只是在通过Bam HI酶可以在该位点上完全消化的质粒中的Bam HI位点。此外，可用杆状病毒转移载体。还可构建pAcRP6质粒衍生物，其中，放置合成Bam HI-Sma I-Bam HI短结合器序列代替Bam HI联结子，可以在它们唯一Sma I位点消化质粒。
pAcRP6-HBsYK14重组体转移载体用于Spodoptera frugiperda昆虫细胞与从AcNPV分离的传染性DNA共转染。从共转染、重组体、polyhedrin-negative的子代病毒中，通过感染细胞的克隆中缺乏肉眼可见的polyhedra来鉴定和回收这些病毒，并将空斑克隆在S.frugiperda培养细胞中。重组体病毒如AcNPV-HBsYK14用来表达昆虫和昆虫培养细胞中的HBsAg。为了测定HBV抗原用感染的昆虫培养细胞上清液，从1/1连续稀释至1/64，对125I示踪的抗HBV进行放射免疫测定。结果示于图4，由此可见稀释和结合抗体之间存在线性关系。
对细胞上清液(ⅰ)、净化的细胞上清液(ⅱ)、20x浓缩的细胞上清液(ⅲ)和含真实的22毫微米颗粒的血清(ⅳ)，进行显微镜检查(图5)，结果证明用本发明的重组体转移载体感染的昆虫细胞产生的颗粒与22毫微米HBV抗原难以区分。
用重组体病毒AcNPV-HBsYK14和起始(未转换)病毒AcPNV感染昆虫细胞，对每一种病毒，测量随时间变化的HBV抗原的产生，可以看到只有转换载体得到阳性的测定结果。
据证明Pre-S2对提高HBsAg的免疫性是重要的，为此构建第二重组体转移载体，这种载体含有HBsAg和整个必需的上游Pre-S2序列。将代表在pHBsYK2质粒DNA中缺少Pre-S2上游序列的合成寡核苷酸连接至含从pHBsYK2 DNA回收的HBV序列的Bam HI衍生片段的两端。除了连续操作所需的限制性内切酶序列(例如Xho I)和用于合成Pre-S2蛋白的ATG转译起始密码子以外，寡核苷酸具有适当末端序列可使“粘性”末端连接到Bam HI衍生DNA的末端(见图3)。然后将寡核苷酸的连接产物和Bam HI衍生pHBsYK2片段连接到质粒PJM119和重组体质粒，该重组体质粒含有回收的寡核苷酸序列，并用序列分析证明(图4，PJM119-PsSYK25)，具有HBsAg序列的55个氨基酸Pre-S2上游的整个编码区，并在3′末端相反方向具有重复的寡核苷酸序列(超出HBsAg基因的TAA转译终端密码子的范围)。质粒PJM119-PsSYK25的DNA用Xho I消化，通过用DNA聚合酶的克列诺夫片段和适宜的脱氧核糖核苷三磷酸盐处理，末端成为钝端，将产物连接到含有唯一Sma I位点的pAcRP6转移载体。得到图3所示的带有基因排列的重组体(pAcRP6-PsSYK27)。
上述pAcRP6-PsSYK27重组体转移载体用于Spodoptera frugiperda昆虫细胞及从AcNPV分离得到的传染性DNA的共转染。从这些共转染、重组体、polyhedrin阴性的子代病毒中，鉴定这些病毒，将空班克隆到培养的S.frugiperda细胞中。重组体病毒用于表达昆虫和昆虫培养细胞中的Pre-S2 HBsAg。
涉及本文的重组体载体和转化的病毒已经另外储存以美国形式培养收集如下(1)E.coli MC1061(pAcRP6-HBsYK14)-ATCC 67220(2)E.coli MC1061(pAcRP6-PsSYK27)-ATCC 67221(上述两者于1986年9月25日保存)(3)A.californica AcNPV-PsSYK27(4)A.californica AcNPV-HBsYK14-VR 2158(上述两者于1986年12月30日保存)
权利要求
1.一种生产至少含有一种HBsAg或Pre-S2蛋白质的抗原部分的多肽的方法，该方法包括用一种含有重组体杆状病毒的表达载体，在一种polyhedrin启动子的表达控制下，感染敏感的昆虫或昆虫细胞，所说的重组体杆状病毒具有用于上述多肽编码的一种DNA片段。
2.根据权利要求
1的方法，其中重组体杆状病毒具有Polyhedrin-非表现型(negative phenotype)。
3.根据权利要求
1或2的方法，其中重组体杆状病毒是从Autographa californica核多角体病毒衍生出的重组体杆状病毒。
4.根据上述任何一项权利要求
的方法，其中表达载体是由含有所说的DNA片段和所说的杆状病毒的感染性DNA的重组体转移载体的重组作用而形成的。
5.根据权利要求
4的方法，其中所说的重组作用是由用含有所说的DNA片段和所说的杆状病毒的感染性DNA的重组体转移载体转染敏感的昆虫或细胞来进行的。
6.根据上述的任何一项权利要求
的方法，其中所说的DNA片段含有Bam HI插入的转移载体pAcRP6-HBsYK14(ATCC 67203)。
7.一种重组体杆状病毒，具有至少为HBsAg或Pre-S2蛋白质的一种抗原部份编码的DNA片段。
8.一种能够在细菌中繁殖并适应于应用杆状病毒重组的转移质粒，所说的杆状病毒具有用于至少一种HBsAg或Pre-S2蛋白质的抗原部份编码的DNA片段。
专利摘要
本发明介绍在昆虫和昆虫培养细胞中，人体乙型肝炎病毒(HBV)抗原的表达。用重组体杆状病毒感染受纳昆虫和受纳细胞。在杆状病毒polyhedrin基因启动子的控制下，重组体杆状病毒具有必需的插入杆状病毒基因组的人体HBV基因，并代替病毒polyhedrin蛋白的起始(5′)编码顺序。
文档编号C12N15/866GK87106266SQ87106266
公开日1988年6月29日 申请日期1987年9月8日
发明者戴维·H·L·毕晓普, 康赐永 申请人:戴维·H·L·毕晓普, 康赐永导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan