唾液酸糖基胆甾醇，它们的制备方法及含有它们的治疗神经病的药物的制作方法

专利名称:唾液酸糖基胆甾醇，它们的制备方法及含有它们的治疗神经病的药物的制作方法
本发明是关于唾液酸糖基胆甾醇，特别是关于用作治疗因周围神经和中枢神经损伤而造成的各种疾病的唾液酸糖基胆甾醇。
在本技术领域：
迄今已知，唾液酸存在于许多动物体内，并且作为唾液酸基化的分子配合物(例如糖蛋白、糖脂、低聚糖或多糖)存在于一些细菌的细胞表面。
在医学上，近来认为，唾液酸在神经功能、癌、炎症、免疫、病毒感染、分化、激素受体及其他方面具有重要的作用。此外，在人们对位于细胞表面的这种特别有活性的物质也给予了很大的重视。但是，在唾液酸基化的分子配合物中唾液酸的作用尚未弄清。
此外，唾液酸已由许多天然有机化学工作者研究，并制得它的许多种类的衍生物。但是，至今尚未得到具有显著生理活性的衍生物。
另外，通过治疗使得造血器官的恶性肿瘤、各种癌症和胶原性疾病得到不同程度的改进，确实可以延长人类的生命。但是，医疗上这些改进不可避免地要增加应用诸如肾上腺皮质激素、免疫抑制剂等药物。因而产生了许多不希望有的付作用(例如免疫能力降低)。
本发明的发明者特别注意到生物固有的成分-唾液酸，并且在化学上通过将唾液酸进行结构改造，对实际上无付作用并能对免疫系统起监控作用的免疫调节剂进行了广泛的研究。结果，本发明的发明者制得了可用作治疗神经疾病药物的唾液酸糖基胆甾醇。本发明的基础是，当将唾液酸糖基胆甾醇加到小鼠成神经细胞瘤细胞(Neuro2a)培养物上检查其作用时，发明人发现，唾液酸糖基胆甾醇可以促进Neuro2a轴突的生长。
本发明的目的是提供一种新的唾液酸糖基胆甾醇。
本发明的另一目的是提供制备唾液酸糖基胆甾醇的新方法。
本发明的又一目的是提供新的治疗神经疾病的药物。
另外，由于本发明的唾液酸糖基胆甾醇是以钠盐的形式存在，因此本发明的胆甾醇具有很好的水溶性，并且具有较广泛的效用。
本发明与具有下述一般式(4)或(5)的化合物有关
本发明还涉及到制备化合物(4)或(5)的方法，该方法包括使具有一般式(1)的化合物与胆甾醇反应，得到具有一般式(2)或(3)的化合物，然后将化合物(2)或(3)水解
另外，本发明还关系到含有化合物(4)或(5)的治疗神经疾病的药物。
下面将详细叙述本发明。
制备化合物(4)或(5)的方法首先以下述反应式概述。
本发明中应用的化合物(1)是已知化合物，并且市场上可以买到。
在上述反应中，在柯尼希-诺尔(koenigs-knorr)催化剂存在下，于约20～25℃，在常压下使化合物(1)与胆甾醇反应约1～7天。在反应中，使约1～5摩尔的胆甾醇与1摩尔化合物(1)反应。
使用的催化剂有溴化汞、氰化汞、高氯酸银、三氟甲磺酸银、三氟醋酸银等。每1当量的化合物(1)用约1.0～1.2当量的催化剂。
本发明中可以应用的溶剂有乙腈、硝基甲烷、丙酮、苯、四氢呋喃、二氯甲烷等。其中，优先选用的溶剂为苯、二氯甲烷和四氢呋喃。在本发明中，可以应用干燥剂。作为干燥剂，可以应用燥石膏或4A分子筛。
生成的化合物(2)和(3)可通过常规的方法(例如柱层析)进行分离和纯化。
然后，使化合物(2)和(3)水解，将它们的甲氧羰基转变为钠羧基，并将它们的乙酰基转变为氢。通过水解，得到化合物(4)和(5)。水解通常用常规的方法进行。例如，在约15～25℃，用浓度为1～3N的碱溶液处理化合物(2)或(3)约5～15小时。
本发明的化合物可以口服。但是本发明化合物最好经眼应用、经吸入应用、肌内注射、皮下注射或静脉注射。服用量根据疾病的情况和患者的体重而定。但是用量最好为0.001～10毫克。
通过下述实例，详细地叙述本发明。
实例15-乙酰氨基-4，7，8，9-四-O-乙酰基-2-O-乙酰基-2-O-(5-胆甾烯-3-β-基)-3，5-二脱氧-α-D-甘油-D-半乳糖-2-吡喃壬糖酮酸甲酯的合成取0.77克(2毫摩尔)予先充分干燥了的胆甾醇，溶于10毫升溶剂(如无水二氯甲烷)中。将0.5克4A分子筛(予先在真空下高温干燥)加到胆甾醇溶液中之后，在室温下于氩气流中将生成的混合物搅拌30分钟～1小时。向该混合物中加入1.02克(2毫摩尔)化合物(1)，然后加入2～2.4毫摩尔三氟甲磺酸银。于室温下在斜面光作用下，将生成的混合物搅拌过夜，以进行反应。
反应溶液通过硅藻土过滤。以饱和盐溶液除去银盐。用无水硫酸钠等干燥混合物。真空蒸去溶剂，得白色固体。
为了分离和纯化化合物(2)和(3)，将白色固体进行柱层析(硅胶)。得0.56克(产率33%)化合物(2)和0.55克(产率32%)化合物(3)。
化合物(2)的物理性质质谱(EI)m/z860(M+1)，800(M-59)元素分析，C47H73O13N计算值(%)C65.63;H8.55;N1.63分析值(%)C65.41;H8.61;N1.60〔α〕25D-23.8°(C＝1，氯仿)熔点113～115℃薄膜法红外光谱ν 3250，2940，1745，1660和1540cm-1最大1H核磁共振谱，CDCl3，δ(TMS)，400MHz0.669 3H，s，CH3-180.985 3H，s，CH3-191.8833H，s，NAc2.026，2.031，2.126，2.145，3Hx4，sx4，OAcx42.596 1H，dd，J＝5.2，12.8Hz，21Heq3.6501H，m，H-33.7903H，s，COOMe4.02-4.09 2H，m，H-41，H-51
4.166 1H，dd，J＝5.8，12.5Hz，Ha-814.347 1H，dd，J＝2.5，12.8Hz，Hb-814.854 1H，ddd，J＝5.2，9.8，12.0Hz，H-315.2051H，d，J＝10.1Hz，NH5.33-5.37 2H，m，H-61，71化合物(3)的物理性质质谱(EI)m/z860(M+1)，800(M-59)元素分析，C47H73O13N计算值(%)C65.63;H8.55;N1.63分析值(%)C65.89;H8.58;N1.66〔α〕25D-40.2°(C＝1，氯仿)熔点138～140℃薄膜法红外光谱ν 3420，3250，2930，1740，1660和1540cm-1最大1H核磁共振谱，CDCl3，δ(TMS)，400MHz0.670 3H，s，CH3-180.999 3H，s，CH3-191.8713H，s，NAc2.021，2.021，2.077，2.130，3Hx4，sx3，OAcx42.525 1H，dd，J＝4.9，13.1Hz，Heq-213.5721H，m，H-33.798 3H，s，COOCH34.04-4.13 2H，m，H-41，514.146 1H，dd，J＝7.6，12.5Hz，Ha-814.888 1H，dd，J＝1.8，12.5Hz，Hb-81
5.07 1H，tt，J＝2.0，8.2Hz，H-715.22-5.27 1H，m，H-315.34-5.38 2H，m，NH，H-61实例25-乙酰氨基-2-O-(5-胆甾烯-3-β-基)-3，5-二脱氧-α-D-甘油-D-半乳糖-2-吡喃壬糖酮酸的合成将实例1得到的化合物(2)溶于2毫升甲醇中。向该溶液中加入3毫升1N氢氧化钠水溶液，然后于室温下搅拌过夜。向生成的溶液中加入2毫升水之后，溶液用强酸型离子交换树脂Dowex 50(H+)中和，过滤除去少量的沉淀，滤液真空干燥，得31.4毫克(产率79.7%)化合物(4)(为白色粉末)。
以上述相同的方法，从化合物(3)可得到30.0毫克(产率76.1%)化合物(5)。
化合物(4)的物理性质薄膜法红外光谱ν 2750，1570cm-1最大1H核磁共振谱，CDCl3，δ(TMS)，90MHz0.71(3H，S，CH3-18)0.84和0.91(6H，CH3-26和CH3-27)0.95(3H，d，J＝4.5Hz，CH3-21)1.00(3H，S，CH3-19)2.01(3H，S，NAc)2.43(1H，dd，J＝4.5和12.6Hz，3-Heq)
〔α〕25D-12.58°(C＝0.41，甲醇)化合物(5)的物理性质KBr红外光谱ν 2870，1620和1550cm-1最大1H核磁共振谱，CD3OD，δ(TMS)，90MHz0.71(3H，S，CH3-18)0.86和0.92(6H，CH3-26和CH3-27)0.95(3H，d，J＝4.5Hz，CH3-21)1.00(3H，S，CH3-19)2.00(3H，S，NAc)2.39(1H，dd，J＝4.5和12.6Hz，3-Heq)〔α〕20D-31.77°(C＝0.78，甲醇)实例3取50毫克化合物(2)〔即5-乙酰氨基-4，7，8，9-四-O-乙酰基-2-O-(5-胆甾烯-3-β-基)-3，5-二脱氧-α-D-甘油-D-半乳糖-2-吡喃壬糖酮酸甲酯〕，溶于100毫升甲醇中。一边搅拌，一边向该溶液中滴入约20毫升2N氢氧化钠水溶液，得到约0.2N氢氧化钠/甲醇溶液，然后于室温下搅拌过夜，使化合物皂化。
然后，一边搅拌一边向生成的溶液中加入强酸型离子交换树脂Dowex(H+)。在溶液的pH值调至酸性(约pH4)以后，除去树脂。溶液在真空中干燥，得5-乙酰氨基-2-O-乙酰基-(5-胆甾烯-3-β-基)-3，5-二脱氧-α-D-甘油-D-半乳糖-2-吡喃壬糖酮酸，为白色粉末。将该白色粉末溶于0.02N氢氧化钠水溶液。将生成的溶液通过Dianon HP20树脂柱进行层析，用水洗涤树脂。在用75%甲醇水溶液洗脱之后，蒸出甲醇，进行冷冻干燥，得37毫克(产率91%)5-乙酰氨基-2-O-(5-胆甾烯-3-基)-3，5-二脱氧-α-D-甘油-D-半乳糖-2-吡喃壬糖酮酸钠〔化合物(4)〕，为白色粉末。化合物(4)的物理性质同实例2所述。
实例4取50毫克化合物(2)，溶于100毫升甲醇，向该溶液中加入20毫升，2N氢氧化钠水溶液。于室温下将生成的溶液搅拌过夜，使其皂化。向该溶液中加入强酸型离子交换树脂Dowex 50W(H+)并搅拌混合物之后，使混合物的pH值控制在7～8。为了除去树脂，将混合物抽滤，再用甲醇洗涤。滤液与甲醇洗涤合并，蒸去甲醇。过滤收集析出的白色不溶解物质，并冷冻干燥，得39毫克(产率96%)白色粉末〔化合物(4)〕。
化合物(4)的物理性质质谱(FD)m/z722(M+Na)，700(M+1)，386，336和314元素分析，C38H62O9NNa·2H2O计算值(%)C61.96;H8.42;N1.90分析值(%)C61.92;H8.71;N2.04〔α〕24D+2.2°(C＝1.0，甲醇)KBr红外光谱ν 3250，2940和1605cm-1最大1H核磁共振谱，CD3OD，δ(TMS)，400MHz0.704(3H，S，CH3-18)0.870和0.885(3H×2，d，J＝1.7Hz，CH3-26和CH3-27)0.936(3H，d，J＝6.5Hz，CH3-21)
0.992(3H，S，CH-19)2.010(3H，S，NAc)2.839(1H，dd，J＝4.2和12.0Hz，2′-Heq)5.332(1H，d，J＝5.5Hz，6-H)13C核磁共振谱，CD3OD，δ(TMS)，100MHz175.91(NAc)175.26(1′-COONa)142.87(C-5)122.59(C-6)102.57(C-1′)70.50(C-3)41.00(C-2)实例5重复实例3的方法，但应用化合物(3)〔即5-乙酰氨基-4，7，8，9-四-O-乙酰基-2-O-(5-胆甾烯-3-β-基)-3，5-二脱氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-吡喃壬糖酮酸甲酯〕代替化合物(2)，得36毫克(产率88%)化合物(5)〔即5-乙酰氨基-2-O-(5-胆甾烯-3-β-基)-3，5-二脱氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-吡喃壬糖酮酸钠〕。化合物(5)的物理性质与实例2所述相同。
实例6重复实例4的方法，但应用化合物(3)代替化合物(2)，得到化合物(5)(40毫克，产率98%)。
化合物(5)的物理性质
质谱(FD)m/z722(M+Na)，700(M+1)和386元素分析，C38H62O9NNa·H2O计算值(%)C63.52;H8.91;N1.95分析值(%)C63.81;H9.25;N2.13〔α〕24D-10.6°(C＝1.0，甲醇)KBr红外光谱ν 3270，2950和1608cm-1最大1H核磁共振谱，CD3OD，δ(TMS)，400MHz0.700(3H，S，CH3-18)0.861和0.880(3H×2，d，J＝1.5Hz，CH3-26和CH3-27)0.928(3H，d，J＝6.5Hz，CH3-21)0.991(3H，S，CH3-19)1.972(3H，S，NAc)2.482(1H，dd，J＝4.5和13.0Hz，2′-Heq)5.282(1H，d，J＝5.3Hz，6-H)13C核磁共振谱，CD3OD，δ(TMS)，100MHz176.95(NAc)174.51(1′-COONa)143.08(C-5)122.46(C-6)101.37(C-1′)72.37(C-3)43.82(C-2′)
实例7取50毫克化合物(2)，溶于100毫升无水甲醇中。向该溶液中加入0.02毫克28%的甲醇钠溶液，然后将生成的溶液于室温搅拌约1小时，以进行脱乙酰基反应。向生成的溶液中加入强酸型离子交换树脂Dowex 50Wx8(H+)，并进行搅拌和中和。为除去树脂，将溶液抽滤，并用甲醇洗涤。滤液和甲醇洗涤液合并，然后向该溶液加入20毫升2N氢氧化钙水溶液，于室温搅拌过夜，使进行皂化。向皂化的溶液中加入弱酸型离子交换树脂Amberlite IRC-50(H+)。生成的溶液搅拌并控制其pH在5～7。为除去树脂将溶液抽吸过滤，接着用甲醇洗涤。滤液和甲醇洗涤液合并，真空干燥以便蒸除甲醇。滤集少量析出的白色不溶解物质，并冷冻干燥，得38毫克(产率93%)化合物(4)，为白色粉末。其物理性质同实例2所述。
实例8重复实例7的方法，但应用化合物(3)代替化合物(2)，得35毫克(产率86%)化合物(5)。其物理性质同实例2所述。
实例9注射剂组合物在安瓿中装有2.5毫克本发明化合物，0.25毫克磷酸二氢钠二水合物、3毫克磷酸氢二钠十二水合物和注射用蒸馏水，得到总量为1毫升的注射剂组合物。
实例10在应用前使其溶解的注射剂组合物将0.5毫克本发明化合物与1毫升生理盐水混合，制得注射剂组合物，然后进行冷冻干燥，装入管形瓶。为了使该注射剂组合物溶解，可向管形瓶中加入1毫升注射用蒸馏水。
实例11应用于眼的组合物在管形瓶中装入1毫克本发明化合物、52.5毫克硼酸、14.5毫克硼砂、适量的氯化苯甲烃铵(benzalkoniumchloride)和眼用加溶溶液，得到总量为5毫升可应用于眼的组合物。
实例12吸入组合物在玛脑研钵中将本发明化合物很好地研磨，使细粉的直径为1～20微米。向该细粉中加入乳糖，研磨并混合均匀。向该混合物中再一点一点地加入乳糖，再仔细地研磨并混合均匀，得一粉末，其中本发明化合物被稀释20至40倍。按一般方法，将20～40毫克药粉装入胶囊中或用药包纸包好。胶囊剂用于粉状气雾剂，药包纸包装的粉剂用于液体气雾剂。
证实本发明化合物具有促进轴突生长作用的试验叙述如下。
实验1对成神经细胞瘤细胞(Neuro2a株)增生的影响将Neuro2a悬浮在由90%Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基和10%牛胎血清(FCS)所组成并含有100单位/毫升青霉素G和100微克/毫升硫酸链霉素的培养基上，然后置于含有空气和5%二氧化碳的二氧化碳孵化器内于37℃培养。所用培养皿是直径为60毫米的聚苯乙烯皿。在各培养皿中植入1～2×10成神经细胞瘤细胞并培养48小时。从所得的细胞培养物中除去含牛胎血清(FCS)的培养物。向不含FCS的培养物(该培养物含100%最低必须培养基，而抗菌素的浓度则与除去FCS之前的培养基相同)分别加入下述试验样品并继续培养化合物(4)(表1);化合物(5)(表2);Gal(β1-3)Gla NAC(β1-4)＜NAC Neu-(α2-3)＞Gal(β1-4)Glc(β1-1)-神经酰胺(下面用GM表示)(表3);和＜NAC Neu(α2-8)NAC Neu(α2-3)＞Gal(β1-3) Gal NAC(β1-4)-＜NAC Neu-(α2-8)NAC Neu-(α2-3)＞-Gal(β1-4)Glc(β1-1)-神经酰胺(下面用GQ1b表示)(表4)，试验样品的加热量分别见表1～表4。加热上述药品24和48小时之后，测定培养物中活细胞增加的数量、轴突增加的数量以及轴突增加的长度。每个浓度的试验用三个培养皿。结果用平均值加标准误(S·E)表示。
结果在化合物(4)、GM1和GQ1b加到培养物上之后48小时，它们的最小有效浓度分别为10毫微克、10微克/毫升和10微克/毫升。考虑到上述药物的分子量，化合物(4)的活性为GM的420倍，为GQ1b的270倍。在加入化合物(5)之后48小时，它的最小有效浓度为100毫微克/毫升，化合物(5)的活性为GM1的42倍，为GQ1b的27倍。
此外，当培养进行24小时的时候，GM1和GQ1b没有作用。但是化合物(4)和(5)的试验结果表明，当培养进行24小时的时候，化合物(4)和(5)的浓度为10毫微克/毫升，它们仍有作用。上述结果清楚地表明，化合物(4)和(5)对于轴突增生具有很好的作用。
急性毒性试验将化合物静脉注入45周龄的ddy雄性小鼠以进行急性毒性试验。结果表明，化合物(4)和(5)的LD50分别为93毫克/公斤和291毫克/公斤。
实际用途本发明的唾液酸糖基胆甾醇是有用的，特别是可用作治疗神经疾病的药物。

权利要求
1.制备具有下述一般式(B)的唾液酸糖基胆甾醇的方法；
其中Ac为乙酰基，R3和R4中一个为-COONa，另一个具有下述一般式
该方法包括使具有下式(1)的化合物与胆甾醇在柯尼希-诺尔(koenigs-knorr)催化剂存在下进行反应，
得到具有下式(A)的化合物，然后将化合物(A)进行水解，
其中R1和R2中一个为-COOCH3，另一个为具有下式的基团，
2.权利要求
1所述的方法，其中该柯尼希-诺尔催化剂系选自溴化汞、氰化汞、高氯酸银、三氟甲磺酸银和三氟醋酸银。
3.权利要求
2所述的方法，其中化合物(1)和胆甾醇之间的反应在约20～25℃、于常压下进行1～7天。
4.权利要求
1所述的方法，其中所述胆甾醇的用量为1摩尔化合物(1)用1～5摩尔氮胆甾醇。
5.权利要求
2所述的方法，其中所述柯尼希-诺尔催化剂的用量为1当量化合物(1)用1.0～1.2当量催化剂。
6.权利要求
1所述的方法，其中所用的溶剂可选自苯，二氯甲烷和四氢呋喃。
7.权利要求
1所述的方法，其中为使化合物(A)水解，将其用1～3N的碱溶液于15～25℃处理5～15小时。
专利摘要
本发明是关于唾液酸糖基胆甾醇的钠盐。本发明的化合物具有很好的水溶解性，因此该化合物作为治疗由于周围神经和中枢神经损伤所致的各种疾病的药物是十分有用的。
文档编号C07J17/00GK87106177SQ87106177
公开日1988年4月20日 申请日期1987年9月3日
发明者小仓治夫, 古畑公夫, 佐藤慎吾, 伊藤正善, 志鸟善保 申请人:美克德株式会社