加氢甾醇组合物及其应用的制作方法

专利名称：：加氢甾醇组合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含加氢谷甾醇(sitostanol)的植物加氢甾醇(stanol)组合物，该组合物特别是可用作血清胆甾醇水平降低物。本发明还涉及适合在食用油、脂肪及含脂肪食物中使用的所述组合物的酯化形式。
背景技术：
：植物甾醇是所有植物的基本组分。它们在植物中的功能相对于哺乳动物中胆甾醇的作用。植物群中最丰富的植物甾醇是β-谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇。这些植物甾醇的结构与胆甾醇的极其类似，它们仅在分子骨架的侧链上存在差异。例如，与胆甾醇相比，谷甾醇的侧链含有附加的乙基而菜油甾醇的侧链带有附加的甲基。自二十世纪五十年代始，人们业已认识到植物胆甾醇具有降低血清胆甾醇水平的功效。甚至在以较低剂量施用时(每天数克)，它们也可以有效降低胆汁胆甾醇和饮食胆甾醇的被吸收性，从而降低了血清内总的和LDL-胆甾醇的水平(12,28，参见27,32)。人们对于限制胆甾醇吸收的机理仍不很了解，但据推断，植物甾醇替换出胶束相内的胆甾醇，从而阻止了胆甾醇的被吸收。实际在所有早期的研究中，谷甾醇或其氢化形式-加氢谷甾醇是主要的令人感兴趣的植物甾醇。然而，甾醇组合物的被测制剂却总未得到很好的整理，并且多数实验中的甾醇制剂还含有不同数量的其它甾醇。植物甾醇已被认为是降低血清胆甾醇浓度的安全物质，这归因于它们是植物脂肪和植物油的天然组分。此外，健康人体肠内的植物甾醇吸收较有限，并且这种被吸收的有限量被分泌到体内的胆汁中。植物甾醇的吸收率随个体差异和植物甾醇的不同而变化，就健康人体而言，通常低于5％的植物甾醇由消化道吸收(27)。但是，对食物菜油甾醇的吸收却高达10％(20)。在少数罕见的疾病(例如谷甾醇血症(sitosterolemia))中，植物甾醇的摄取异常高效，并且经体内胆汁途径的排除作用也发生损伤。谷甾醇、菜油甾醇以及它们的饱和形式-加氢谷甾醇和加氢菜油甾醇皆增高，致使饱和加氢甾醇水平增高的最可能的原因是由于它们的高效内源性合成而不是高度吸收(10,27)。若不治疗，谷甾醇血症将在青年时期就导致黄瘤病和冠心病的发生。就患该疾病的人群而言，以超过日常食物所含的量来给予不饱和植物甾醇可能会对健康产生危险。Lees和Lees(25)测定了三种不同谷甾醇制剂对血浆脂质和脂蛋白浓度的作用。制剂之一为Cytellin，一种市售(EliLillyCo.USA)的含60-65％谷甾醇和35-40％其它甾醇(主要是菜油甾醇)的制剂。分为三次使用的18g/天平均剂量能够使血浆总胆甾醇平均降低10.5％，同时也使LDL-胆甾醇降低15％。然而，当血浆内仅检测出常规的痕量植物甾醇(包括菜油甾醇在内)时(10,33)，在Lees&amp;Lees(25)所测定的对象中，菜油甾醇的血浆浓度在4-21mg/dl(分升)之间。在讨论中作者极力认为，由于菜油甾醇的致粥样硬化性(atherogenicity)还不清楚，含有较多菜油甾醇的谷甾醇制剂(类似于他们在实验中所用的Cytellin制剂)不能被推荐。此外，Lees等人(26)研究了来源于大豆油和妥尔油(talloil)的植物甾醇在降低血胆甾醇水平中的有效性。他们分别选用了各植物甾醇的两种物理形式，即悬浮液和散剂。大豆甾醇含有60-65％谷甾醇和35％菜油甾醇，并且以18g甾醇/天(9-24g)且分成三等份剂量的平均日剂量服用。该试验中采用的妥尔油甾醇制剂仅含约5％的菜油甾醇。妥尔油甾醇的两种制剂(粉末和悬浮液)都以3g的日剂量进行测定。此外，还对剂量为6g的妥尔油甾醇悬浮液进行测定。两种物理形式的大豆甾醇及散剂形式的妥尔油平均使血浆胆甾醇含量降低12％(26)。然而，本试验中还观测到胆甾醇所具有的已见报导的高吸收性。5位受试者中，血浆菜油甾醇的水平在5-21mg/dl内(平均16mg/dl)。因此，即使大豆甾醇的血胆甾醇降低功效较显著，但作者仍不建议将其用作胆甾醇-降低剂。相反，他们推荐那些含有最低量菜油甾醇和最高量谷甾醇的药用植物甾醇制剂。基于上述两个试验得出的结论是植物油型甾醇(例如大豆甾醇)的应用极其不宜。在绝大多数植物油中，饱和植物甾醇(例如加氢谷甾醇和菜油甾醇)仅以痕量存在。但是，妥尔油甾醇含有10-15％的加氢谷甾醇，即谷甾醇的饱和形式。加氢谷甾醇还可以由氢化谷甾醇所含双键来制得。在最新的有关人体和动物的试验中，加氢谷甾醇被证实比谷甾醇具有更有效的血胆甾醇降低作用(8,16,17,18,19,36)。加氢谷甾醇的另一个优越性是实际中不被吸收。若干研究(例如9,16,17,21)揭示出加氢谷甾醇基本不被吸收，但其小量(＜5％)不饱和形式-谷甾醇被吸收。同样，Amstrong&amp;Carey(6)在体外试验中发现，作为胆甾醇饱和形式的加氢胆甾醇显示出较高的疏水性，因此较胆甾醇不易吸收。当通过氢化最常见植物甾醇源来生产加氢谷甾醇时，还从菜油甾醇生成了另一种饱和植物甾醇，即加氢菜油甾醇。迄今为止，对于这种加氢甾醇的吸收性及其可能的血胆甾醇降低作用还知之甚少。基于上述有关饱和甾醇比它们的不饱形式具有较低被吸收性的数据来看，可以假定加氢菜油甾醇应在实际中不被吸收。为研究不同植物甾醇的被吸收性，Heinemman等人(20)采用肠灌注技术对胆甾醇与菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇的肠内吸收进行比较，并对人体内低浓度的加氢谷甾醇和加氢菜油甾醇进行了研究。结果表明，不同植物甾醇的吸收率在不同植物甾醇中的变化平均为谷甾醇4.2％，豆甾醇4.8％，菜油甾醇9.6％和加氢菜油甾醇12.5％。吸收有效性之间存在的最大差异是在10名男性对象中测出的。因此，据Heinemann等人(20)称，加氢菜油甾醇比其不饱和形式-菜油甾醇更易被吸收。这种结果与基于上述饱和甾醇(加氢谷甾醇、加氢胆甾醇)比其不饱和形式不易吸收的试验所作出的假设相反。导致如此结果的原因仍不清楚。据Heinemann等人(20)推测，造成上述矛盾结果的原因可能是由于Amstrong&amp;Carey(6)的试验是在体外条件下进行，而在胶束结合和/或吸收中作为主要因素的疏水性原理可能仅适于体内条件。但是，这样的假说并不能解释若干试验中加氢谷甾醇在体内试验条件下比谷甾醇具有较低被吸收性的事实。因此，Heinemann等人(20)不同意先前作者未作出解释的结果。Sugano等人(34)对玉米甾醇(组成31％菜油甾醇、4％豆甾醇和65％谷甾醇)和加氢玉米甾醇(组成31％加氢菜油甾醇和69％加氢谷甾醇)的降胆甾醇活性进行了研究，所述加氢玉米甾醇是由玉米油甾醇混合物氢化制得。两个试验都选用大鼠为试验对象。当甾醇和加氢甾醇在饮食中为0.5-1％的水平时就可以对摄入的胆甾醇(饮食中1％)发挥胆甾醇降低功效。在第一个试验中，植物甾醇和加氢植物甾醇的血胆甾醇降低作用并无显著性差异。然而，在第二个试验中，相同饮食水平下的加氢植物甾醇显示出比植物甾醇更明显的血浆胆甾醇浓度降低性能(具有统计学意义p＜0.02)。此外，以含1.0％加氢甾醇的食物饲养的大鼠与用不含胆甾醇的食物喂食的动物相比，血浆胆甾醇浓度显著降低(p＜0.02)。这种现象在用含1.0％甾醇的食物饲养的大鼠中却未出现。Sugano等人(34)没有研究具有高含量加氢谷甾醇和低含量加氢菜油甾醇的加氢甾醇混合物(妥尔油型甾醇)与具有较高水平加氢菜油甾醇(植物油型甾醇)的加氢甾醇混合物之间在降低血胆甾醇方面存在的差异。他们仅对比了不饱和甾醇混合物与相应的饱和加氢甾醇混合物之间血胆甾醇降低功效的不同。该组研究人员在其近期试验中已着重于研究加氢谷甾醇的特定血胆甾醇降低作用，并与谷甾醇进行了比较(21,22,23,35)。事实上，他们在近期的出版物(23)中提及上述植物甾醇的试验(34)仅描述了β-加氢谷甾醇的血胆甾醇降低作用并与β-谷甾醇作了比较，但未探讨饱和甾醇(包括加氢菜油甾醇)与不饱和甾醇之间血胆甾醇降低作用的差异。上述近期试验所采用的是具有典型组成的氢化妥尔油甾醇的甾醇混合物，所述氢化妥尔甾醇含有高含量的加氢谷甾醇(＞90％)。Miettinen&amp;Vanhanen(30)发现，与游离谷甾醇相比，脂肪酸酯形式的加氢谷甾醇更有效地降低了血清胆甾醇水平。最近的试验表明，将加氢谷甾醇酯作为日常饮食的组成部分来使用是减少血清总胆甾醇和LDL-胆甾醇浓度的有效方法(13,14,15,31,37,38)。采用加氢甾醇酯而不是游离加氢甾醇的优越性还在于加氢甾醇酯是脂溶性的，因此它们适宜被掺入到多种食物中而并不改变产品最终的口味、香味及物理性质。美国专利5,502,045(2)中公开了加氢谷甾醇脂肪酸酯的制备方法以及脂溶性加氢甾醇酯在食物中的应用，该文献在此引入作为参考。Straub(3)提供了饱和的加氢甾醇(加氢谷甾醇、加氢γ-谷甾醇、22,23-加氢菜子甾醇、加氢菜油甾醇以及它们的混合物)在制备食品添加剂组合物中的应用，其中，加氢甾醇与可食用的溶解剂、有效量的适当抗氧剂和有效量的适当分散剂混合。这些食品添加剂能够降低含胆甾醇的食品及饮料(例如肉类、蛋类及乳制品)中的胆甾醇吸收。但是，该专利没有公开任何有关临床效果和饮食胆甾醇吸收作用的数据。Eugster等人(1)推荐将少量甾醇、它们的脂肪酸酯及糖苷应用于肿瘤治疗中。Eugster等人建议的制备方法涉及有害的化学试剂(例如N,N’-羰基-二咪唑、亚硫酰氯)和溶剂(例如四氢呋喃、苯、氯仿或二甲基甲酰胺)。Eugster等人谈及上述物质可能作为饮食和食品添加剂的用途，但未提供任何有关血胆甾醇降低作用或对这种用途的权利要求。从Eugster等人的公开文本中难以清楚地看出成品是如何纯化成大量的足以用作食品组分的纯化甾醇酯。文献所指出的纯化方法仅是薄层层析法和高效液体色谱法。因此，Eugster等人的专利提供的制备方法也仅限于较低量。美国专利3,751,569(4)描述了在烹饪油中添加植物甾醇脂肪酸酯的方法，该方法的目的是降低人体血清内的胆甾醇水平。该专利文献提供一种用于酯化游离甾醇的方法，但该方法绝对不能满足制备可食用级别产品的要求。在该专利中，酯化反应是在游离甾醇和脂肪酸酐之间进行并以高氯酸为催化剂。这些催化剂和试剂在食品加工中无法接受。此外，该专利仅涉及了天然植物甾醇的脂肪酸酯。德国专利DE2248921(5)提供的将油和脂肪中的甾醇进行酯化的方法是一种符合食品加工标准的化学酯交换技术。在该专利中，游离甾醇与过量的脂肪酸酯被加至油或脂肪的混合物中，此后通过常规的已知酯交换技术将全部脂肪混合物进行酯交换。事实上在所得的脂肪混合物中，所有游离甾醇已被转化为脂肪酸酯。这样做的目的在于保护植物油和动物油中的游离甾醇不在加工中发生改变。先前的数据表明，菜油甾醇(一种重要的植物甾醇)较易被吸收。因此认为应使用仅含最低量菜油甾醇的植物甾醇混合物。在实际中这就导致甾醇混合物(例如具有高含量谷甾醇的妥尔油甾醇)的应用。大部分的加氢甾醇研究工作仅涉及到加氢谷甾醇。Heinemann等人的研究(20)表明，菜油甾醇的饱和形式加氢菜油甾醇比菜油甾醇或谷甾醇更易于吸收(分别为12.5％,9.6％和4.2％)，由此产生的“同感”是具有高含量加氢菜油甾醇的饱和甾醇混合物因其加氢菜油甾醇的被吸收而不具有安全性。该试验表明，有关加氢甾醇(加氢谷甾醇)应用的全部临床试验都基于含有高含量加氢谷甾醇和低含量加氢菜油甾醇的甾醇混合物。由许多试验(例如8,17,18,19,23,36)获得的事实是，加氢谷甾醇(谷甾醇的饱和形式)与其相应的不饱和谷甾醇相比具有更有效的血胆甾醇浓度降低功效。此外，饱和甾醇的被吸收量极其有限，这使饱和甾醇的应用在总体基础上成为安全的降血胆甾醇方法。在不饱和甾醇中，尤其菜油甾醇被以较高的量吸收，从而引起了与甾醇混合物应用相对抗的强硬建议，所述甾醇混合物含有浓度增高的菜油甾醇(例如植物油型甾醇混合物)(25,26)。因此，任何反对加氢菜油甾醇以较高量的物质加入食物来使用的看法都是极大的偏见，这将致使含植物甾醇原料的应用范围严重局限在含较低量菜油甾醇及其饱和形式(加氢菜油甾醇)原料内。发明概述本发明涉及用于降低血清胆甾醇水平的含有加氢谷甾醇作为主要组分但仍含有实际量加氢菜油甾醇的植物加氢甾醇组合物，它们既可以是游离的形式也可以酯化为脂肪酸酯。本发明还涉及含有加氢谷甾醇或其脂肪酸酯作为主要组分但仍具有实际量加氢菜油甾醇的加氢甾醇组合物在食用商品中作为降血清胆甾醇浓度的饮食组分的应用。本发明的目的在于拓宽植物原料在制备可食用商品物质中的应用范围，尤其是在制备控制血清内胆甾醇水平的食用油、脂肪和含脂肪食物中的应用。本发明允许使用以此为目的用作原料的植物油和脂肪，所述的植物油和脂肪除含有谷甾醇外还含有实际量的菜油甾醇。适于制备本发明组合物的原料是，例如，玉米、大豆和油菜籽，其他具有植物组成成分并且菜油甾醇组成含量较高的植物也可以被采用。本发明的新组合物，尤其是它的酯化形式都可以被掺入到食品中，例如烹饪油、人造奶油、奶油、蛋黄酱、色拉调味品、起酥油、干酪(包括生的和熟的干酪)以及其他含脂肪食品。本发明组合物还可以如此来耗用。发明详述在本发明中，所述植物加氢甾醇组合物除包含作为主要组分的加氢谷甾醇外还含有至少10％的实际量加氢菜油甾醇。本发明组合物优选含有20％-40％，最优选25％-35％，例如约30％的菜油甾醇，或者当组合物经酯化具有亲脂性时含有菜油甾醇的脂肪酸酯。在本申请说明书中，所有百分比都以重量计，除非另有说明。说明书中括号内的数字是指列在所附参考文献目录中的公开出版物。所得的令人惊奇且与盛行偏见相左的数据表明，含有加氢谷甾醇作为主要组分但也含有实际量加氢菜油甾醇的氢化加氢甾醇混合物至少具有与含有不低于90％加氢谷甾醇和低含量加氢菜油甾醇的加氢甾醇混合物同样的功效，这表明，在减少胆甾醇吸收中，加氢菜油甾醇至少与加氢谷甾醇一样有效。此外，由血清甾醇实验获得的数据清楚地表明，加氢菜油甾醇事实上仍未被吸收，其血清含量约比加氢谷甾醇的血清含量低40％。因此，含有加氢谷甾醇作为主要组分但仍含有实际量加氢菜油甾醇的加氢甾醇混合物应至少被看作与常规的妥尔甾醇型加氢甾醇混合物一样安全。这样的数据与现有的关于含有较高量加氢菜油甾醇的加氢甾醇混合物的有效性和安全性的意见相反(参见20,27,34)。美国专利5,502,045(2)认为，加氢谷甾醇的脂肪酸酯比游离加氢谷甾醇具有更有效的降血胆甾醇水平功效。最新研究更确切地证实了含脂溶性加氢谷甾醇脂肪酸酯的人造奶油的降血胆甾醇作用(例如31)。用加氢甾醇脂肪酸酯代替游离加氢甾醇对于这些物质在众多含脂食品中的广泛应用极其重要，这是由于，只有加氢甾醇脂肪酸酯可以以足够的量溶解在食用油和脂肪中，从而达到有效降低消化道对饮食内胆甾醇和胆汁内胆甾醇的吸收。加氢甾醇酯在食用油和脂肪中的溶解度高达35-40％，而游离甾醇在食用油和脂肪中的溶解度在21℃时的最大值仅限于2％(重量)(24)。可利用多种表面活性剂、助溶剂和分散剂掺入较高量，但利用这些物质并不能确保具有脂溶性。上述物质的使用通常也受到限制，甚至为法规所禁止。此外，1％水平时的游离甾醇将影响脂肪或油的物理性质引起产品在结构与物理性质上的改变。使用加氢甾醇脂肪酸酯就不会出现这种情况，这是由于，通过改变混合物的脂肪酸组成可很容易地改良脂肪混合物的物理性质。显然，如本发明所述，加氢甾醇脂肪酸酯易于掺入并分散到除人造奶油之外的其它食品中。美国专利5,502,045(2)进一步提供了此类应用的可行实施例。但是，本领域技术人员显然可以认识到，可将加氢甾醇脂肪酸酯加入到多种食品尤其是含脂肪食品中。许多制备甾醇脂肪酸酯的方法都已被公开。这些方法的缺点是几乎所有方法都采用化学试剂，这对于生产在食品中用作大量营养剂的产品是难以接受的。有毒试剂(例如亚硫酰氯和脂肪酸的酸酐衍生物)的使用是常见的。美国专利5,502,045描述了制备甾醇的加氢甾醇脂肪酸酯的优选方法(2，在此引入作为参考)。该方法基于食用脂肪和油加工业中广泛采用的酯交换方法。该酯化方法有益地由上述制备方法改变而来，这种酯化方法中，除了游离加氢甾醇、脂肪酸酯或脂肪酸酯混合物以及酯交换催化剂(例如乙醇钠)之外，不采用任何其它物质。该方法的一个重要特征在于所用反应物之一(即脂肪酸酯)过量并且充当溶剂，使加氢甾醇在所选反应条件下溶解(真空度5-15mmHg)。该反应可制得脂肪酸酯与加氢甾醇脂肪酸酯的混合物。通过真空蒸馏除去了过量的脂肪酸酯，由此加氢甾醇脂肪酸酯很容易浓缩成近乎纯态的加氢甾醇脂肪酸酯。另外，可以在除臭步骤前将如此状态的混合物加入到最终的脂肪混合物中。加氢甾醇在天然物中的含量很小，例如小麦、黑麦和tritricale，并且在乳制品中的含量也较低(11,14)。加氢甾醇通过氢化天然甾醇混合物即可制得。在1996年以前，只有具备高纯度的妥尔甾醇混合物(甾醇含量＞98％)才可以用于食品并被出售。含有实际量菜油甾醇的植物甾醇(例如植物油型甾醇混合物)可以作为例如维生素E生产的副产物从植物油馏出物中获得。所得植物甾醇通过上述已知的氢化工艺被转化为加氢甾醇，例如使用碳载钯催化剂并在有机溶剂中进行反应(7，在此引入作为参考)。本领域技术人员显然了解，氢化反应可以采用多种钯催化剂和溶剂，当该氢化反应在最佳条件下进行时，仅有微量未转化不饱和甾醇而所形成的典型脱羟副产物-甾烷(stane)和甾烯(stene)含量很低(＜1.5％)。本发明就含高浓度加氢谷甾醇的加氢甾醇混合物和含实际量加氢菜油甾醇的加氢甾醇混合物的血胆甾醇降低作用进行了比较，上述含高浓度加氢谷甾醇的加氢甾醇混合物通常被该领域专家认为是最安全有效减少胆甾醇的吸收并由此降低血清胆甾醇水平的物质。在本申请中，首次报导了植物油型加氢甾醇在人体内的降血胆甾醇作用。本发明第一次表明了具有实际量加氢菜油甾醇(超过10％并且优选约30％)的加氢甾醇混合物至少与具有高浓度加氢谷甾醇的加氢甾醇混合物同样有效。此外，本发明的研究结果清楚的揭示出与Heinemann等人报导(20)的相反，加氢菜油甾醇事实上并不被吸收。临床试验为了研究植物油加氢甾醇酯人造奶油和妥尔油加氢甾醇酯人造奶油的降血胆甾醇作用，本发明设计了为期5周的双盲交叉试验以及2周的洗出阶段。研究的试验安排如下所述本发明试验的试验安排数字1-6是指在日常饮食(1,2)、第一个干预(给药)期后(3,4)和第二个干预期后(5,6)所取的血样。VS=植物油型加氢甾醇酯人造奶油，TS=妥尔油型加氢甾醇酯人造奶油。组1．(n=12)日常饮食干预期洗出期干预期5周2周5周具有适当增高胆甾醇水平的24个志愿并且自由生活的健康的妇女(平均6.12±0.16mmol/l)每天消耗约25g(250g桶/10天)作为每日饮食组成部分的待测人造奶油，而且食用是随机的。在日常饮食期和各试验期结束时，测定血清类脂(总胆甾醇、LDL-胆甾醇、HDL-胆甾醇和甘油三酯)及血清甾醇的含量。在日常饮食期内各周的不同时间以及人造奶油各试验期结束时取两次血样。表Ⅰ列出所得的血清类脂数值。表1．在日常饮食期间以及使用了植物油型加氢甾醇酯人造奶油(VS)和妥尔油加氢甾醇酯人造奶油(TS)的5周处理后的血清类脂浓度(mmol/l,平均值±SE),(n=24)日常饮食VSTS总胆甾醇6.12±0.165.77±0.18*5.95±0.23LDL-胆甾醇4.03±0.153.60±0.17*3.76±0.19*HDL-胆甾醇1.54±0.091.62±0.09*1.63±0.10*甘油三酯1.22±0.131.20±0.111.26±0.15*p＜0.05或更低两种被测人造奶油在血清类脂方面都获得良好的结果。LDL-胆甾醇值的降低和HDL-胆甾醇数值的增高都具有统计学意义(p＜0.05或更低)。此外，植物油型甾醇酯在降低总胆甾醇方面也具有统计学意义。在降总胆甾醇和降LDL-胆甾醇中，植物油型加氢甾醇酯人造奶油比妥尔油型加氢甾醇酯人造奶油更高效。甘油三酯的结果无变化。血清类脂结果表明在加氢甾醇部分含有实际量加氢菜油甾醇的植物油型加氢甾醇酯人造奶油应比妥尔油加氢甾醇人造奶油更有效。在早期试验中(14,15,31)，妥尔油加氢甾醇酯人造奶油显示出有效的降血胆甾醇作用。因此，基于本试验的交叉设计，可以得出植物油型加氢甾醇至少与妥尔油型加氢甾醇具有同样有效的降血胆甾醇功效的结论。利用气液色谱法并按照先前公开的方法(29，作为参考)可定量分析血清甾醇浓度。计算出各阶段血样中血清类脂两个测量值的平均值。表2和表3列出了日常饮食期间和各试验期后的平均血清植物甾醇浓度数据以及在这些浓度下观测到的平均变化值。表2．在日常饮食期间和各干预期后的血清植物甾醇浓度(平均值±SE,μg/dl)(n=24)。VS=植物油型加氢甾醇酯人造奶油，TS=妥尔油加氢甾醇酯人造奶油日常饮食VSTS菜油加氢甾醇47±258±347±3加氢谷甾醇94±392±596±5菜油甾醇472±37337±25350±28谷甾醇277±17198±12227±15*p＜0.05或更低表3．血清植物甾醇浓度(μg/dl)的平均变化(±SE)(n=24)。VS=植物油型加氢甾醇酯人造奶油，TS=妥尔油型加氢甾醇酯人造奶油，HD=日常饮食Δ(VS-HD)Δ(TS-HD)Δ(VS-TS)菜油加氢甾醇11±2*0±2-11±2*加氢谷甾醇-2±32±4-4±4菜油甾醇-134±19*-122±21*-12±13谷甾醇-80±11*-51±12*-29±8**p＜0.05或更低两种被测人造奶油都显著降低了血清菜油甾醇和血清谷甾醇的水平。菜油甾醇的血清浓度被认为能够反映胆甾醇在人体肠内的吸收(29,39)。因此，菜油甾醇较低，肠内胆甾醇的吸收也较少。试验期间内，血清菜油甾醇水平的显著减少(25-28％)表明，两种加氢甾醇酯人造奶油都可减少胆甾醇的肠内吸收。此外，观察到的血清谷甾醇浓度未出现差异，但以植物油加氢甾醇酯干预期后的平均菜油加氢甾醇血清浓度却比日常饮食期和妥尔油加氢甾醇酯干预期后的要显著增高。然而，加氢菜油甾醇的绝对浓度仅相当于加氢谷甾醇的约63％，通常这将被视为实际未被吸收。这种较低的菜油加氢甾醇血清浓度表明该物质的吸收极其有限，这与Heinemann等人所提出的结果(20)相矛盾。所以，认为含有高浓度加氢谷甾醇的加氢甾醇混合物对人体而言是安全的，那么，基于加氢菜油甾醇类似于加氢谷甾醇基本不被吸收的事实，应将含实际量菜油加氢甾醇的加氢甾醇混合物也视为同样安全有效。本发明加氢甾醇酯组合物的制备以及在上述临床试验中所用的人造奶油将在下列实施例中详细描述。实施例1甾醇混合物的氢化来源于植物油馏出物的市售甾醇混合物(组成菜子甾醇2.7％，菜油甾醇26.7％豆甾醇18.4％谷甾醇49.1％及加氢谷甾醇2.9％)在小规模反应器内氢化(25L)。将26g纤维状钯催化剂(Smop-20；10重量％的钯含量，Smoptech,TurkuFinland)、26g蒸馏水(用于活化催化剂)以及11.7kg丙醇加入到反应器中。反应器中通入氮气并在1bar的氢气压下活化催化剂，反应温度为65℃，反应时间为30分钟。活化后，将混合物冷却到40℃，随后加入1.3kg甾醇混合物。在氮气氛下将丙醇甾醇混合物加热至65℃，最后用氢气代替氮气。当氢气的通入达到完全后，在1bar的氢气压下进行氢化反应。常规的转化时间约为120分钟。通过取等份样品并以HPLC进行分析来检测上述转化反应。降低氢气压力并向反应器内通入氮气。在氮气氛下滤除纤维性催化剂。丙醇加氢甾醇混合物在10℃条件下过夜结晶，真空下滤出加氢甾醇晶体，滤饼以0.5kg冷丙醇洗涤。所得加氢甾醇混合物在60℃下真空柜内干燥。收率为75％，利用毛细管气相色谱分析法对所得加氢甾醇混合物的组成进行测定菜油甾醇0.2％，加氢菜油甾醇28.9％，豆甾醇0.1％，谷甾醇0.2％，加氢谷甾醇70.1％。应注意菜子甾醇被氢化为24β-甲基加氢胆甾醇，它是加氢菜油甾醇的一种差向异构体，但用于它们在普通毛细管气相色谱过程中在同一位置出峰，并且无法根据手性来区分，因此通常它也被算作加氢菜油甾醇。以初始的甾醇混合物计，24β-甲基加氢胆甾醇的含量应为2.7％。实施例2．加氢甾醇脂肪酸酯的制备小规模地制备加氢甾醇脂肪酸酯混合物。将由实施例1氢化过程获得的合并几个批次产物的6kg加氢甾醇在60℃下干燥过夜并用8.6kg低级芥酸菜子油甲酯混合物酯化。所用加氢甾醇混合物的甾醇组成为菜油甾醇0.4％，加氢菜油甾醇(+24β-甲基加氢胆甾醇)29.7％，豆甾醇0.1％，谷甾醇0.4％和加氢谷甾醇68.0％。混合物中的加氢甾醇含量为98.2％。酯化反应操作如下在反应容器内，将加氢甾醇与低级芥酸菜子油脂肪酸甲酯的混合物在90-120℃和5-15mmHg真空的条件下加热。干燥1小时后，加入21g乙醇钠并继续反应约2小时。在90℃加入30％(重量)水以破坏催化剂。相分离后，分出水相并洗涤2次。分出水相后，油相以200rpm的搅拌转速于95℃下真空干燥。在200rpm的搅拌转速下，用1.0％漂白粘土(TonsilOptimumFF,Südchemie,Germany)将加氢甾醇脂肪酸混合物轻微地在30mmHg和110℃下漂白20分钟。滤除漂白粘土，所得脂肪酸甲酯和加氢甾醇脂肪酸酯的混合物在除臭前即可以加入，或用真空蒸馏除去过量的甲酯。因此，将混合物除臭，得到无味的加氢甾醇脂肪酸酯混合物，该混合物本身可加入到不同的食品生产过程中。利用快速HPLC检测法，该酯化方法的转化率通常都高于99％，收率为95％。实施例3人造奶油产品的临床试验在Gerstenberg&amp;Agger3×57小规模的反应器内生产具有妥尔油型加氢甾醇脂肪酸酯和植物油型加氢甾醇脂肪酸酯的80％人造奶油。妥尔油加氢甾醇脂肪酸酯是来自于常规的产品-Benecol人造奶油(RaisionMargariiniFinland提供)。采用常规反式脂肪酸游离脂肪混合物(transfattyacidfreefatblend)(组成30％未氢化的酯交换的植物脂肪和70％液体LEAR油)，向其中加入加氢甾醇脂肪酸混合物。成品的加氢甾醇含量应为12g/100g产品，这种成品可在使用水平为25g/天时可提供3g加氢甾醇的日摄取量。成品按照下列配方制备<将所得人造奶油包装在250g的聚丙烯桶内，用铝箔封口。成品的味道和纹理与市售人造奶油相同。妥尔油加氢甾醇人造奶油中加氢甾醇含量为12.7g/100g产品，植物油型加氢甾醇人造奶油中加氢甾醇含量为12.6g/100g产品。两种产品的甾醇组成为<>文献目录美国专利说明书1EugsterC,Eugsterc,HaldemannW,RivaraG.“甾醇、它们的脂肪酸酯和糖苷；它们的制备方法；含有此类化合物的自发散剂以及在肿瘤治疗中的应用”(Sterols,theirfattyacidestersandglocosides；processesfortheirpreparation；spontaneouslydispersibleagentscontainingthesecompounds,andtheirusefortreatmentoftumors).1993.美国专利5,270,041.2MiettinenTA,VanhanenH,WesterI.“加氢甾醇脂肪酸酯在降血清胆甾醇水平中的应用”(Useofstanolfattyacidesterforreducingserumcholesterollevel).1996.美国专利5,502045.3StraubCD.“减少食物胆甾醇吸收的加氢甾醇、其制备方法和它们的用途”(Stanolstoreducecholesterolabsorptionfromfoodsandmethodsofpreparationandusethereof.)1993.美国专利5,244,887.4“具有降血胆甾醇特性的澄清烹饪沙拉油”(Clearcookingandsaladoilshavinghypocholesterolemicproperties.)1973.美国专利．3,751,569.其它专利说明书5BaltesJ,MerkleR.VerfahrenzurHerstellungeinesGemischesauspflanzlichenundtierischenlenbzw.FettenundFettsuresternestern.德国专利DE2248921.其它公开物6AmstrongMJ,CareyMC.“决定甾醇在胆汁盐胶束内的溶解性的热力学和分子因素”(Thermodynamicandmoleculardeterminantsofsterolsolubilitiesinbilesaltmicelles).类脂研究杂志(JLipidRes)1987；28:1144-1155.7AugustineRL,ReardonJr.EJ1969.“钯催化的胆甾醇氢化反应”(Thepalladiumcatalyzedhydrogenationofcholesterol.)有机制备和处理(OrgPrepandProced)1969；1:107-109.8BeckerM,StaabD,VonBergmannK.“用谷甾醇和加氢甾醇治疗儿童时期家族性高胆甾醇血症”(Treatmentofseverefamilialhypercholesterolemiainchildhoodwithsitosterolandsitostanol.)儿科学杂志(Jpediatr)1993；122:292-296.9CzubaykoF,BeumersB,LammsfussS,LtjohannD,vonBergmannK.“用于定量分析门诊病人粪便排泄物中中性和酸性甾醇的简化微量法”(Asimplifiedmicro-methodsforquantificationoffecalexcretionofneutralandacidicsterolsforoutpatientstudiesinhumans.)类脂研究杂志(JLipidRes)1991；32:1861-1867.10DayalB,TntGS,BattaAK,SpeckJ,KhachadurianAK,SheferS,SalenG.“血谷甾醇andxanthomatosis症患者中的5-α加氢甾醇鉴别甾类有机硼烷质子分解的立体化学”(Identificationof5-αstanolsinpatientswithsitosterolemiaandxanthomatosis:stereochemistryoftheprotonolysisofsteroidalorganoboranes.)类固醇(steroids)1982；40:233-243.11DuttaPC,AppelqvistL.“未氢化和氢化食用油和谷物类脂中的饱和甾醇(加氢甾醇)”(Saturatedsterols(stanols)inunhydrogenatedandhydrogenatedediblevegetableoilsandincereallipids.)食品与农业科学杂志(JSciFoodAgric)1996；71:383-391.12GrundySM,MokHYI.“低剂量植物甾醇对人体胆甾醇吸收的影响”(Effectsoflowdosephytosterolsoncholesterolabsorptioninman.)In:GretenH(Ed.)脂蛋白代谢(Lipoproteinmetabolism.)Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg,NewYork,1976:112-118.13GyllingH,MiettinenTA，通过饮食加氢谷甾醇降低的血清胆甾醇与胆甾醇的吸收及合成以及患Ⅱ型糖尿病患者LDL脱辅基蛋白B的减少的关系(SerumcholesterolloweringbydietarysitostanolisassociatedwithreducedabsorptionandsynthesisofcholesterolanddecreasedtransportofLDLapoproteinBinmenwithtypeⅡdiabetes.)In:GottoJrAM,ManciniM,RichterWO,SchwandtP(Eds.)冠心病预防中对严重血脂蛋白障碍症的治疗(Treatmentofseveredyslipoproteihemiainthepreventionofcoronaryheartdisease.)4thlntSympMunich1992,Karger,Basel,1993:57-59.14GyllingH,MiettinenTA.高胆甾醇血症NIDDM患者在加氢谷甾醇酯-人造奶油治疗前和治疗中的血清胆甾醇及胆甾醇水平以及脂蛋白的代谢(SerumcholesterolandcholesterolandlipoproteinmetabolisminhypercholesterolemicNIDDMpatientsbeforeandduringsitostanolester-margarinetreatment).Diabetologia1994；37:773-780.15GyllingH,SiimesMA,MiettinenTA.家族性高胆甾醇血症患儿的加氢谷甾醇酯人造奶油饮食疗法(Sitostanolestermargarineindietarytheatmentofchildrenwithfamilialhypercholesterolemia.)类脂研究杂志(JLipidRes)1995；36:1807-1912.16HassanAS,RamponeAJ胆甾醇及β-加氢谷甾醇在大鼠肠道及淋巴中的转运(Intestinalabsorptionandlymphatictransportofcholesterolandβ-sitostanolintherat).类脂研究杂志1979；20:646-653.17HeinemannT,LeissO,vonBergmannK.低剂量加氢谷甾醇对高胆甾醇血症患者血清胆甾醇的影响(Effectsoflow-dosesitostanolonserumcholesterolinpatientswithhypercholesterolemia.)动脉粥样硬化学(Atherosclerosis)1986；61:219-223.18HeinemannT,PietruckB,Kullack-UblickG,vonBergmannK.谷甾醇和加氢谷甾醇在抑制肠道胆甾醇吸收中的比较(Comparisonofsitosterolandsitostanoloninhibitionofintestinalcholesterolabsorption.)AgentsActions(Suppl)1988；26:117-122.19HeinemannT,Kullak-Ublick,G-A,pietruckB,vonBergmann、K.植物甾醇在抑制胆甾醇吸收中的作用机理(Mechanismofactionofplantsterolsoninhabitionofcholesterolabsorption.)欧洲临床药理学杂志(EurJClinPharmacol)1991；40:59-63.20HeinemannT,AxtmannG,vonBergmannK.不同植物甾醇对人体肠道胆甾醇吸收作用的比较(Comparisonofintestinalabsorptionofcholesterolwithdifferentplantsterolsinman.)欧洲临床试验学杂志(EurJClinInvest)1993；23:827-831.21IkedaI,SuganoM.β-谷甾醇和β-加氢谷甾醇在大鼠体内的吸收及代谢的比较(Comparisonofabsorptionandmetabolismofβ-sitosterolandβ-sitostanolinrats.)动脉粥样硬化学(Atherosclerosis)1978；30:227-237.22IkedaI,TanabeY,SuganoM.谷甾醇和加氢谷甾醇对胆甾醇胶束溶解性的影响(Effectsofsitosterolandsitostanolonmicellarsolubilityofcholesterol.)营养学和维生素学杂志(JNutrSciVitaminol)1989；35:361-369.23IkedaⅠ,KawasakiA,SamezimaK,SuganoM.β-加氢谷甾醇在兔体内的抗高血胆甾醇症活性(Antihypercholesterolemicactivityofβ-sitostanolinrabbits.)营养学和维生素学杂志(JNutrSciVitaminol)1981；27:243-251.24JandacekRJ,WebbMR,MattsonFH.水相对油相内的胆甾醇溶解性的影响(Effectofanaqueousphaseonthesolubilityofcholesterolinanoilphase.)类脂研究杂志1977；18:203-210.25LeesRS,LeesAM.谷甾醇疗法对血浆类酯和脂蛋白浓度的影响(Effectsofsitosteroltherapyonplasmalipidandlipoproteinconcentrations.)In:GretenH(Ed)脂蛋白代谢(Lipoproteinmetabolism).Springer-Verlag,Berlin,Heidelberg,NewYork,1976:119-124.26LeesAM,MokHYI,LeesRS,McCluskeyMA,GrundySM.作为降胆甾醇剂的植物甾醇对患高胆甾醇血症患者的临床试验和甾醇平衡的研究(Plantsterolsascholesterol-loweringagents:clinicaltrialsinpatientswithhypercholesterolemiaandstudiesofsterolbalance.)动脉粥样硬化学(Atherosclerosis)1977；28:325-338.27LingWH,JonesPJH.饮食植物甾醇简评植物甾醇代谢、优越性和副作用综述(Minireviewdietaryphytosterols:AreviewofMetabolism,benefitsandsideeffects.)生命科学(LifeScience)1995；57:195-206.28MattsonFH,GrundySM,CrouseJR植物甾醇对于人体胆甾醇吸收的最佳化作用(Optimizingtheeffectofplantsterolsoncholesterolabsorptioninman.)美国临床营养学杂志(AmJClinNutr)1982；35:697-700.29MiettinenTA,KoivistoP.高胆甾醇血症患者回肠旁路中的非胆甾醇甾醇及胆汁酸生成(Non-cholesterolsterolsandbileacidproductioninhypercholesterolaemicpatientswithilealbypass.)In:PaumgarterG,StiehlA,GerokW(Eds.).健康与疾病中的胆汁酸和浓度(Bileacidandconcentrationinhealthanddisease.)MTPPress,Boston1983:183-187.30MiettinenTA,VanhanenH.食物加氢谷甾醇与不同的E表型载脂蛋白内的胆甾醇吸收、合成及浓度的关系(Dietarysitostanolrelatedtoabsorption.synthesisandserumlevelofcholesterolindifferentapolipoproteinEphenotypes.)动脉粥样硬化学(Aterosclerosis)1994；105:217-226.31MiettinenTA,PuskaP,GyllingH,VanhanenH,VartiainenE.加氢谷甾醇酯人造奶油对中度高胆甾醇血症人群的降血清胆甾醇作用(Reductionofserumcholesterolwithsitostanol-estermargarineinamildlyhypercholesterolemicpopulation.)新英格兰医学杂志(NewEnglJMed)1995；333:1308-1312.32PollakOJ.植物甾醇对血清类脂和动脉粥样硬化的作用(Effectofplantsterolsonserumlipidsandatherosclerosis.)药学原理(PharmacTher)1985；31:177-208.33SalenG,AhrensJr.EH,GrundySM.β-加氢谷甾醇在人体中的代谢(Metabolismofβ-sitosterolinman.)临床研究杂志(JClinInvest)1970,49:952-967.营养学和维生素学杂志(JNutrSciVitaminol)1981；27:243-251.34SuganoM,KamoF,IkedaI,MoriokaH.植物加氢甾醇在大鼠体内中的降类脂活性(Lipid-loweringactivityofphytostanoisinrats.)动脉粥样硬化学(Atherosclerosis)1976；24:301-309.35SuganoM,MoriokaH,IkedaI.β-谷甾醇和β-加氢谷甾醇在大鼠体内的降血胆甾醇活性的比较(Acomparisonofhypocholesterolemicactivityofβ-sitosterolandβ-sitostanolinrats.)营养学杂志(JNutr)1977；107:2011-2019.36VanhanenHT,MiettinenTA，食物中不饱和的和饱和的植物甾醇对它们血清浓度的影响(Effectsofunsaturatedandsaturateddietaryplantsterolsontheirserumcontents.)临床化学学报(ClinChimActa)1992；205:97-107.37VanhanenHT,BlomqvistS,EnholmC,HyvnenM,JauhiainenM,TorstilaI,MiettinenTA.具有不同载脂蛋白E表型的患高胆甾醇血症对象在食物加氢谷甾醇酯疗法中的血清胆甾醇、胆甾醇前体和植物甾醇(Serumcholesterol,cholesterolprecursors,andplantsterolsinhypercholesterolemicsubjectswithdifferentapoEphenotypesduringdietarysitostanolestertreatment.)类脂研究杂志1993；34:1535-1544.38VanhanenHT,KajanderJ,LehtovirtaH,MiettinenTA.使用高剂量食物加氢谷甾醇酯的高胆甾醇血症对象中胆甾醇的血清水平、被吸收性、粪便排泄及合成(Serumlevels,absorptionefficiency,faecaleliminationandsynthesisofcholesterolduringincreasingdosesofdietarysitostanolestersinhypercholesterolaemicsubjects.)临床科学(ClinSci)1994；87:61-67.39TilvisRS,MiettinenTA.血清植物胆甾醇以及它们与胆甾醇吸收的关系(Serumplantsterolsandtheirrelationtocholesterolabsorption.)美国临床营养学杂志(AmJClinNutr)1986；43:92-97.权利要求1．一种用作降血清胆甾醇水平物质的植物加氢甾醇组合物，该组合物含有加氢谷甾醇，还含有至少10％通过植物加氢甾醇混合物氢化得到的加氢菜油甾醇。2．根据权利要求1的组合物，其中包括20-40％，优选25-35％的加氢菜油甾醇。3．根据权利要求1或2的组合物，其中包含50-80％的加氢谷甾醇。4．一种植物加氢甾醇脂肪酸酯的组合物，该组合物含有用作降血清胆甾醇水平物质的加氢谷甾醇脂肪酸酯，该组合物还含有至少10％的加氢菜油甾醇脂肪酸酯。5．根据权利要求4的组合物，其中含有20-40％，优选25-35％的，例如30％的加氢菜油甾醇脂肪酸酯。6．根据权利要求4或5的组合物，其中含有50-80％的加氢谷甾醇脂肪酸酯。7．权利要求1-6任一项所述组合物在降血清胆甾醇水平中的应用，所述应用中可采用组合物本身或将它们作为饮食的组成部分，例如在含脂肪食物中。8．一种含有植物加氢甾醇组合物的食物，其中包括可有效降低血清胆甾醇水平的加氢谷甾醇或其脂肪酸酯，该组合物还包括实际量的加氢菜油甾醇或其脂肪酸酯，并且加氢菜油甾醇或其脂肪酸酯与加氢谷甾醇或其脂肪酸酯的重量比为1∶9-4∶6。9．根据权利要求8的食物，其中该重量比为2∶8-3.5∶6.5。10．植物甾醇混合物作为原料在生产权利要求1-6、8和9任一项所述用于降低血清胆甾醇水平的组合物或食物中的应用，所述植物甾醇混合物除含有谷甾醇外还含有实际量的菜油甾醇。全文摘要本发明涉及一种加氢甾醇组合物，该组合物除含有作为主要成分的加氢谷甾醇外还含有至少10%实际量的加氢甾醇，该组合物在掺入到食用商品中时可有效降低血清胆甾醇水平。通过酯化作用，组合物尤其适用于食用脂肪、油和含脂肪食物中。文档编号A61K31/575GK1228025SQ96180406公开日1999年9月8日申请日期1996年9月2日优先权日1996年8月9日发明者I·维斯特,T·帕尔莫,T·迈特提恩,H·盖勒林申请人:拉伊西奥比尼考有限公司