专利名称：高脂血症的治疗药或预防药的制作方法
技术范围本发明涉及高脂血症的治疗药或预防药背景技术血液中的胆固醇、中性脂肪、磷脂和游离脂肪酸等脂质成分在血液中以水溶性的脂蛋白形式存在，脂蛋白根据其密度的不同可以分为极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等。机体内的脂蛋白代谢发生异常，这些脂质成分的血中浓度处于正常值以上的高浓度状态称为高脂血症。如果长期保持这种高脂血症的状态，胆固醇等就容易在动脉壁上沉积。而且根据许多研究和流行病学调查，高脂血症和心肌梗塞、心绞痛、脑梗塞等动脉硬化性疾病的发病、发展有明确的关系。所以，使这些脂质成分的血中浓度降低到正常浓度对于高脂血症的治疗很重要，此外，使其保持正常浓度对高脂血症的预防也很重要。
牛磺酸(氨基乙磺酸)是分子量为125.14、具很简单化学结构的含硫氨基酸，关于其药理作用，已知对包括脑神经系统、循环系统、肝胆系统在内的全身各器官系统有广泛的作用。在牛磺酸涉及胆固醇代谢的作用方面，已知它有通过利胆作用而发挥的降低血清胆固醇和抑制胆固醇性胆结石的作用。
γ-谷维醇，已知其具有抑制胆固醇吸收、改善脂蛋白代谢的作用。
目前，对于高脂血症的治疗，一般是先进行饮食疗法，只是在没有明显效果时才应用药物进行治疗。
作为目前的高脂血症治疗药，有多种具不同作用机制(抑制吸收、促进排泄和抑制合成等)的药物，但是其副作用却是个问题。作为其主要的副作用，有白细胞减少、肝肿大、胃肠障碍、性欲减退等各种症状。所以，人们希望有无副作用的高脂血症治疗药。
此外，从预防医学的观点出发，为预防高脂血症的发生，应使胆固醇、中性脂肪、磷脂和游离脂肪酸等脂质成分的血中浓度保持低水平，因此希望有无副作用、能够长期、安全服用的高脂血症预防药。
本方面的目的在于提供可以长期服用、安全的高脂血症治疗药和预防药。
发明的公开本发明者发现，在改善体内过剩的胆固醇等脂质成分的代谢方面，牛磺酸和γ-谷维醇同时给药的代谢改善作用要比牛磺酸或γ-谷维醇分别单独给药时的代谢改善作用强，基于这一认识，从而完成了本发明。
即，本发明高脂血症治疗药或预防药，其特征在于含有牛磺酸和γ-谷维醇作为有效成分。
本发明的高脂血症治疗药或预防药能够降低体内过剩的胆固醇、中性脂肪、磷脂和游离脂肪酸等脂质成分的血中浓度，还显示出改善脂蛋白代谢的作用，可用作为高脂血症的治疗药或预防药。特别是作为无副作用、能够长期安全服用的高脂血症预防药非常有用。
在本发明中，牛磺酸的有效给药量为健康成人每天100mg～6000mg，优选1000mg～3000mg。γ-谷维醇的有效给药量为健康成人每天1mg～6000mg，优选5mg～500mg。牛磺酸和γ-谷维醇的配比为牛磺酸∶γ-谷维醇=300∶1～30。
本发明的高脂血症治疗药或预防药可以根据需要，和其它已知的添加剂，例如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、抗氧化剂、包衣剂、着色剂、矫味剂、表面活性剂、增塑剂等混合，按通常的方法制成颗粒剂、散剂、胶囊剂、片剂、干糖浆剂、溶液剂等制剂。
本发明中的含有牛磺酸和γ-谷维醇为有效成分的制剂可以和潘特生(双泛酰硫乙胺)和烟酸等配合，制成对高脂血症的治疗和预防有效的制剂。
更进一步，还可根据需要加入1种或2种以上的维生素类、其它的生理活性物质、激素、营养成分、香料等。产业上的利用可能性本发明中的含有牛磺酸和γ-谷维醇为有效成分的制剂能够降低胆固醇、中性脂肪的血中浓度，还显示出改善脂蛋白代谢的作用，作为高脂血症的治疗药或预防药很有用。特别是作为无副作用、能够长期安全服用的高脂血症预防药非常有用。
实施发明的最佳形式下面就实施例和实验例对本发明进行具体的说明。实施例1牛磺酸3000mgγ-谷维醇 10mg糖粉 600mg气溶胶36mg阿斯巴甜精9mg低取代羟丙基纤维素54mg按常规方法将上述组分制成颗粒剂。实施例2牛磺酸3000mgγ-谷维醇 10mg维生素E 100mg糖粉 600mg气溶胶600mg阿斯巴甜精9mg低取代羟丙基纤维素54mg硬脂酸镁 24mg色素 微量香料 微量按常规方法将上述组分制成颗粒剂。实施例3牛磺酸3000mg潘特生 50mgγ-谷维醇 10mg糖粉 600mg气溶胶 36mg阿斯巴甜精 9mg低取代羟基丙基纤维素54mg按常规方法将上述组分制成颗粒剂。实施例4牛磺酸3000mgγ-谷维醇 10mg维生素E100mg维生素B110mg维生素B220mg维生素B610mg维生素C600mg烟酸10mg潘特生 50mg淀粉 600mg低取代羟丙基纤维素 12mg阿斯巴甜精 12mg硬脂酸镁24mg按常规方法将上述组分制成颗粒剂。实验例1对SHRSP(脑卒中易发大鼠)高脂肪负荷饮食的影响[实验动物]3月龄雄性SHRSP每组6只[实验分组]每天给予实施例1的颗粒剂的实施例1给药组、每天给予3000mg牛磺酸的牛磺酸给药组、每天给予300mgγ-谷维醇的γ-谷维醇给药组、不给药的高脂肪负荷饮食组。[饲料]各组分别给予高脂肪负荷饮食。高脂肪饮食是在正常饮食中负荷5％胆固醇、2％胆酸和20％牛油。这里所说的正常饮食有下述所示的组成。维生素混合物和矿物质混合物按Harper方法(《营养学杂志》J.Nutr.,67,109(1959))配制。正常饮食的组成酪蛋白 18.0％脂肪5.0％维生素混合物1.0％矿物质混合物4.0％氯化胆碱0.2％纤维素 9.6％蔗糖 62.2％合计 100.0％[实验方法]各组分别给予饲料饲养45天。饲食后，从尾静脉采血，测定血清胆固醇的浓度。饲养结束后，摘取肝脏，测定胆固醇浓度。
此外，摘取肠系膜动脉，除去周围的脂肪，用苏丹Ⅲ染色，在显微镜下测定脂肪沉积数，求出对肠系膜动脉的脂肪沉积抑制率。[结果]血清胆固醇浓度如表1所示。实施例1给药组和其它各组比较，可见血清胆固醇保持较低水平。按下式从肝脏的胆固醇浓度值求出肝脏的胆固醇抑制率。
肝脏的胆固醇浓度和肝脏的胆固醇抑制率如表2所示。实施例1给药组和其它各组比较，可见肝脏胆固醇浓度保持较低水平，显示出较高的脂肪沉积抑制率。
此外，脂肪沉积的判定分为四级，沉积数0～20作为1分，20～100作为2分，100～200作为3分，200以上作为4分，按此标准决定各个得分，求出各组的平均分，用下式求出各组肠系膜动脉的脂肪沉积抑制率。
各组脂肪沉积判定的平均分和对肠系膜动脉的脂肪沉积抑制率如表3所示。实施例1给药组和其它各组比较显示出较高的脂肪沉积抑制率。
表1
表2
<p>表3
实施例2对HepG2细胞脂质分泌的影响[实验分组]添加2.0mM牛磺酸和0.05mM γ-谷维醇的T+γ组、只添加2.0mM牛磺酸的T组、没有添加药物作为对照的C组。[实验方法]实施例2的实验方法用《当代治疗研究》CURRENTTHERAPEUTIC RESEARCH,Vol.58,No.8 787-795(1995)所示的方法。
1．实验培养基的调配和药物的添加方法把含有脂蛋白耗竭血清(LPDS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM(葡萄糖浓度为4500mg/ml))用作基本培养基。将牛磺酸用磷酸缓冲生理盐水(PBS)溶解，滤过除菌后，使之浓度为2.0mM，添加入基本培养基制成实验培养基。γ-谷维醇用二甲基亚砜(DMSO)溶解，使之浓度为0.05mM，添加入基本培养基。作为对照，使用以含有PBS(浓度1％)的培养基培养的细胞。
2．细胞的培养方法以及细胞和培养基的回收方法将HepG2细胞(ゥィスタ-研究所生产)在含有10％FCS、青霉素(100000单位/L)和链霉素(100mg/L)的DMEM(低葡萄糖，1500mg/L)中进行预培养。HepG2细胞的培养在37℃下、95％空气、5％二氧化碳中进行，培养基每2～3天更新一次。HepG2细胞到达汇合(コンフルェント)状态后，按下述方法进行传代培养。除去培养皿中的培养基，将HepG2细胞用0.25％胰蛋白酶液(含0.1％EDTA)迅速洗净后，加入适当量的胰蛋白酶液，在37℃下孵育约5分钟。然后加入适当量含10％FCS的培养基，终止胰蛋白酶的反应。将HepG2细胞均匀混悬，离心分离(1000rpm,5分钟)，回收HepG2细胞。将细胞分成2～3份后，用DMEM(含有l0％FCS)培养基进行培养。用细胞计计测细胞数目，将HepG2细胞(85×104个/皿)接种到3．5厘米的培养皿中，每皿用l毫升含高葡萄糖(4500mg/ml)的DMEM进行培养。当HepG2细胞到达汇合(コンフルェント)状态(约100×104个/皿)时，将培养基换成实验培养基，继续培养24小时。将HepG2细胞用PBS清洗1次后，加入1毫升的PBS，用淀帚(policeman)回收。还有，作为放射性脂质前体，在实验开始时往各皿中加入0.5μCi[3H]甘油或[14C]醋酸。
3．HepG2细胞内和培养基中脂质的提取方法细胞内和培养基中的脂质按Bligh&Dyer法提取。将回收的HepG2细胞溶解后，用超声波发生器(Sonifier 250,Bronson公司制造)粉碎，调制成细胞匀浆。取细胞匀浆的一部分装入带有螺帽的施皮茨(Spitz’s)管中，加入3ml甲醇和1.5ml氯仿，充分搅拌，在37℃下加热40分钟，接着加入1.5ml氯仿和1.6ml水，作成氯仿∶甲醇∶水=1∶1∶0.8的混合液，再进行离心分离(3000rpm,15分钟)。回收下层的氯仿，在氮气下浓缩后，用一定量的石油醚溶解，提取细胞内的脂质。此外，培养基中的脂质按相同操作进行提取。
4．脂质的分析方法提取出的脂质用0.25mm厚的硅胶G薄层色谱(TLC)进行分离，分成游离胆固醇、酯型胆固醇、甘油二酯和甘油三酯等部分。作为展开剂，用石油醚∶乙醚(シェスチルェ-テル)∶乙酸=82∶18∶1。展开结束后，用碘蒸气显色，检测脂质各部分。用TLC分离后，将薄层板上各部分的硅胶移入计测管，以闪烁醇(シンチゾ-ル)EX-H(同仁化学公司制造)溶解，用液体闪烁计数器(WALLAC 1410,Pharamacia公司制造)测定各部分的放射活性。阻尼(quenching)用背景值和硅胶校正。
5．细胞蛋白质的定量用细胞匀浆的一部分进行蛋白质的定量。蛋白质的定量按Lowry法进行。
6．统计分析将实验所得的数据用Duncan多元检验进行统计处理。[结果]以[14C]醋酸计的24小时后对HepG2细胞脂质培养基中标记脂质(总脂质、甘油三酯、甘油二酯)分泌的影响如表4所示。T+γ组和其它组相比表现出抑制标记脂质的分泌。
此外，以[3H]甘油计的24小时后对HepG2细胞脂质培养基中标记脂质(总脂质、甘油三酯、甘油二酯)分泌的影响如表5所示。T+γ组和其它组相比表现出抑制标记脂质的分泌。
表
权利要求
1．一种高脂血症的治疗药或预防药，其特征在于含有牛磺酸和γ-谷维醇作为有效成分。
2．牛磺酸和γ-谷维醇在制备高脂血症的治疗药或预防药中的应用。
3．一种高脂血症的治疗方法或预防方法，其特征在于使用含有牛磺酸和γ-谷维醇作为有效成分的制剂。
全文摘要
具有降低血中胆固醇、中性脂肪,和改善脂蛋白代谢作用的高脂血症治疗或预防药,含有牛磺酸和γ－谷维醇作为有效成分。
文档编号A61K31/215GK1219873SQ96180315
公开日1999年6月16日 申请日期1996年5月29日 优先权日1996年5月29日
发明者北岛秀明, 角田健司, 村上茂, 柳田晃良 申请人:大正制药株式会社