乙型肝炎病毒表面抗原和含有这些抗原的杂种抗原的制作方法

专利名称：乙型肝炎病毒表面抗原和含有这些抗原的杂种抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及乙型肝炎病毒抗原和含有这些抗原的杂种抗原，以及利用DNA重组技术将上述抗原的编码基因克隆到酵母中。
A.乙型肝炎疫苗乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的和大范围内的有关键康的问题。感染可从急性或慢性阶段显示出来。在美国，急性肝炎病例的数量估计每年至少100，000例，死亡率达1-2%，取决于年龄及社会层次，在康的成人中，乙型肝炎病毒(HBV)慢性携带者的普遍程度在0.1-1.0%之间。在南美，MBV慢性携带者约为1-3%，在苏联和南欧，约为3-6%，而在亚洲和非洲则高于10%。
在发达国家中，存在着为有高度受传染危险的人们提供疫苗的需求，例如病人和医疗单位接触血液的全体人员、军人、慢性病毒携带者的配偶，到高HBV地方性流行区域去的旅游者，慢性病毒携带者的新生婴儿，同性恋者，娼妓和吸毒者。在第三世界国家中，也需要一种能够用于公众免疫的便宜的设备。公众免疫项目，不仅能够最大地影响急性肝炎的发病率和慢性肝炎病毒携带者的数量，而且还能够减少慢活性的肝炎和肝癌的发病率及死亡率。
从传染的病人身上分离出来的戴恩(Dane)颗粒，据信为乙型肝炎病毒颗粒，其直径约42nm。每一颗粒都是由一个以乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)构成的包膜，一种外壳(HBcAg)，一种由内源多聚酶和一个DNA基因组组成的。它的基因组是环状和双链的具有一个含有约200个碱基的单链区域。在体外，借助于内源多聚酶作用，能把单链区域补齐。较长的链含有约3200个碱基。
长期以来，由于人们知道很难在组织培养中繁殖病毒，并且认为人是唯一已知的寄主，所以制备HBV疫苗是困难的。然而在实验室中黑猩猩也可以被此病毒传染。
Valenzuela等人(Nature，298，347-350，1982)报导在酵母中使用一种表达载体进行了HBsAg的生物合成。载体中HBsAg编码序列是一个835碱基对(bP)的TaqⅠ-HpaⅠ片段，并且其启动子是酵母醇脱氢酶Ⅰ的启动子。几个早期简短报告提及到以前这方面的研究工作，这些是Valenzuela等人(Arch.Biol.Med.Exp.(Chile)，14(1)21-22，1981)报导了在酵母中把一个含有编码与HBsAg相似的蛋白的序列连接到酵母醇脱氢酶启动子区域的DNA片段进行表达;在〔Scrip.No.616.P14(Aug.12，1981)〕中的一个报导述及一个美国研究小组(包括P.Valenzuela和W.J.Rutter在内)已经宣布，从酵母中制备了“蛋白外壳包围的乙型肝炎病毒”;并且Zuckerman(Nature.295，98-99，1982)报导了W.J.Rutter已经报导了糖基化的HBsAg在酵母细胞中的表达。
据报导，HBV的抗原组成成份，如HBsAg已经通过插入一个含有该抗原的编码基因的重组DNA分子，从细菌中制备出来了。Burrell等人(Nature，279，Number.5708，43-47，1979)报导克隆于质粒PBR322中的HBVDNA序列在大肠杆菌(E.coli)HB101中得到表达。
Murray等人在欧洲专利申请公布，第13，828号，1980年(EuropeanPatentApplicationPublicationNumber13，828，1980)中公开了，在大肠杆菌HB101菌株中制备了一种能够为含有HBsAg的HBV抗原编码的重组载体。此载体是从戴恩颗粒(Dane)DNA和质粒PBR322制备出来的。作者指出，虽然在应用中做为范例只用大肠杆菌做寄主，但可使用的寄主还包括细菌，酵母，其它真菌，动物或植物细胞以及其它寄主。
Charnay等人(Nature，286，893-895，1980)报导了一种携带β-半乳糖苷酶基因HBsAg结构基因的融合体的噬菌体的构建。该噬菌体直接合成一种由HBsAg和β-半乳糖苷酶的抗原决定簇组成的融合蛋白。
Tiollais等人在英国专利申请No.2，034，323公开制备了一种含有HBVDNA的大肠杆菌噬菌体。融合的噬菌体一HBVDNA被转化到大肠杆菌C600菌株中。
在英国专利申请2，070，621号中公开了一种质粒是由部分HBsAg基因和启动子以及乳糖操纵子的Z基因组成的，并且可以被克隆到大肠杆菌中。
Rutter等人在欧洲专利申请公布No.20，251，1980公开了含有一种由质粒PBR322和HBVDNA的BanHⅠ酶切片段构成的一些重组载体可被用于转化大肠杆菌。另一种由HBVDNA的BamHⅠ酶切片段以及色氨酸操纵子的一部分组成的载体，也曾在大肠杆菌HB101菌株中得到表达。
Edman等人(Nature，291，Number5815，503-506，1981)描述了一些质粒的构建，在色氨酸操纵子调控区域的控制下，这些质粒在大肠杆菌中直接合成了一种β-内酰胺酶一HBsAg融合蛋白。
Pumpen等人(Gene，30，201-210，1984)公开了在大肠杆菌中合成了少量的HBsAg单体蛋白和一些融合蛋白。且用变性HBsAg单体诱导产生的抗体进行检测。
其它文献公开了HBVDNA插入到细菌中，包括Charnay等人(Prog.Med.Virol.27.88-92，1981);Mackay等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.78.No.7，4510-4514，1981);Fritsch等人(C.R.Acad.Sci..287.No.16，1453，1978);英国专利说明书2，034，323(DerwentNo.46874C)和Pasek等人(Nature.282，No.6，575，1979)。
HBVDNA还被克隆到哺乳动物细胞中，这些细胞包括人类，小鼠和人类癌细胞系。例如Dubois等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.，77.No.8，4549-4553，1980)报导了用含有HBV基因组质粒进行的小鼠细胞的转化和HBsAg的表达;Hirschman等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.，77.No.9，5507-5511，1980)报导由HBVDNA进行转化的HeLa细胞产生了一些类HBV的颗粒。
Funakoshi等人(Prog.Med.Virol.，27，163-167，1981)以及Maupas等人(Prog.Med.Virol.，27，185-201，1981)报导了使用来自人血液的HBsAg制备HBV疫苗的步骤。Funakoshi等人制备的疫苗含有40μg纯化的、福尔马林处理的HBsAg，磷酸盐，氯化钠，20mg甘露醇，且用0.1%的氢氧化铅作为佐剂。在以后的文献中Maupas等人报导一个剂量的疫苗是1ml纯化的、福尔马林处理的HBsAg含有2-10μg/ml的蛋白(Lowry方法)和0.1%氢氧化铝。Maupas等人的研究报导中使用的方案，即免疫一年以后，用注射器以一个月为间隔注射二次进行强化;一些作者们提出了一种以三个月为间隔注射二次浓缩的HBsAg的方案。
另外有关制备HBV疫苗的文献包括Maupas等人，Adamowicz等人;Funakoshi等人，分别在Maupas和Guesry，1981年编写的“乙型肝炎病毒INSERM专题讨论会No.18(Elseriver/North-HollandBiomedicalPress)中的第3，37和57页上。
酵母已经被用来作为某些其它非HBVDNA序列表达的寄主，例如Fraser等人在英国专利申请第2，068，969号中公开了在酵母中制备鸡卵清蛋白，(ScripNo.640，P.11Nov，4，1981)有一篇关于在酵母中制备了一种类型的干扰素的报导。在欧洲专利11，562(DerwentNo.38762C)中报导了含有2μ质粒中的ura酵母基因的杂种酵母质粒。
真正的乙型肝炎病毒表面抗原可以从被传染的个体的胞浆中发现，是一种大约22nm的颗粒，由两种已知为P24蛋白和它的糖基化衍生物GP28组成。此两蛋白认为是S蛋白密码序列的位于HBV基因组上的226个氨基酸密码序列来编码的。直接位于HBV基因组上的S蛋白密码序列前的全部163个氨基酸密码序列被划归为PreS密码序列。直接位于S蛋白密码序列前的PreS密码序列的55个氨基酸被划归为PreS2密码序列，而PreS密码序列剩下的108个氨基酸则划归为PreS1密码序列。PreS密码序列或任何较小区域都划归为HBsAg前体蛋白序列。
从整体上讲，应注意到对于某些HBV亚型(如，ayw)，完整的Pre S密码序列是163个密码子，而对于其它HBV亚型(如adw2)，完整的Pre S密码序列是174个密码子。在此两种情况下，Pre S区域是直接位于S蛋白密码序列前的55个密码子。
从戴思(Dane)颗粒表面和从HBV传染的病人血清中分离到的一些HBsAg颗粒表面上发现的多聚清蛋白偶联或受体位点是由PreS2密码序列编码的。虽然PreS2区域直接位于HBV基因组上的S蛋白密码区域前，但是PreS2区域不涉及HBsAg颗粒的装配。参看，例如Persing等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82，3440-3444，1985)。
Valenzuela等人(Nature，298，347-350，1982)公开了在含有S蛋白密码序列的载体转化的酵母细胞被裂解之后，发现了一些类似于HBsAg的颗粒，并得出结论HBsAg颗粒是在酵母中合成的。
Harford等人(DevelopmentsinBiologicalStandardization，54，125-139，1983)公开了用一种载体转化酵母细胞裂解之后，发现了一些类似于HBsAg的颗粒，此载体含有直接位于S蛋白密码序列前的PreS2密码序列的N-末端42个氨基酸直接前面的鸟氨酸甲酰基转移酶编码序列的18个氨基酸。
Laub等人(J.Virology.，48(1).271-280，1983)公开了包括PreS-S蛋白编码序列的大部分HBV基因组DNA的猴病毒40(SV40)的早期取代载体的构建，和由这载体转化的CV-1细胞(COS细胞)转化的SV40中此部分的表达。
Stibbe等人(J.Virology.46(2)，626-628，1983)公开了一些较小的被称做GP33和GP36的HBsAg多糖蛋白是由PreS2-S蛋白编码序列编码的。Stibbe等(Dev.Biol.Stand.，54，33-43，1983)公开了与几乎缺失GP33和GP36的那些HBsAg颗粒相比，含有大量GP33和GP36的HBsAg颗粒并没有导致较高的抗S蛋白抗体的滴度。
Heerman等人(J.Virol.52(2).396-402，1984)公开了S蛋白编码序列和PreS密码序列组成的全部389个氨基酸编码序列是为多肽-P39编码的，而P39是以在HBV颗粒和病毒表面抗原丝中的其糖基化的形式GP42和与多肽P24，GP27，GP33和GP36相关的其它的HBV表面抗原形式被发现的。
Neurath等人(Science，224，392-394，1984)公开了具有PreS2密码序列的26氨基末端氨基酸序列的多肽作用为免疫原，并且假设，由免疫原诱发产生的抗体可以被用来进行特征实验。
Michel等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81.7708-7712，1984)公开了HBsAg的生物合成，而HBsAg具有由携带PreS2-S蛋白编码序列质粒进行转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中人血清多聚清蛋白的接受子。
Persing等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82.3440-3444，1985)公开了用PreS2-S蛋白编码序列转化的小鼠L细胞产生三种与多肽(24，000，27，000，和35，000道尔顿)相关的HBsAg。而这三种HBsAg都可以被列为直径22nm，偶联到聚合的人血清清蛋白(HSA)上的复杂免疫反应的HBsAg颗粒类型中。经受了PreS2区域接近3′末端移码突变的PreS2-S蛋白编码序列转化的小鼠L细胞，只能产生能被列为不能偶联HBA的22nm直径免疫反应HBsAg颗粒类型中的24，000和27，000道尔顿的多肽。Persing等人得出结论PreS2-S蛋白密码序列为35，000道尔顿多肽编码，而认为HBsAg的HSA偶联活性需要PreS2蛋白，而对于HBsAg颗粒的装配和分泌是不需的。还认为HBsAg的主要多肽(如24，000道尔顿)并不是由PreS2-S蛋白编码序列所编码的前体物(如27，000和35，000道尔顿肽类)的剪切初步衍生而来的。
Milich等人(Science，228，1195-1199，1985)公开了由含有Pre S2-S蛋白密码序列的质粒转染的中国仓鼠卵巢细胞制备的含有Pre S2和HBsAg的包括HBV颗粒的疫苗，与只含有HBsAg的疫苗相比，对于某一种小鼠能够避免不反应性的发生。而且认为，由Pre S2-S蛋白密码序列的33，000道尔顿多肽的NH2-末端的26个氨基酸残基代表了Pre S2区域上的抗体优先偶联位点。
Michel等人“疫苗86”(Vaccines86)见Brown等人主编，冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory(1986)，359-363。讨论了含有PreS区域表达产物的乙型肝炎病毒表面抗原颗粒在CHO细胞中的生物合成。
Neurath等人(Nature，315，154-156，1985)公开了PreS2区域为被肝细胞特异识别区域的HBV外壳上的蛋白编码;PreS2-S蛋白密码序列为HBV颗粒中的一种蛋白编码;与编码PreS蛋白基因相关的合成的肽是致免疫的，并得出结论，HBV疫苗应含有PreS因子。
Valenuzela等人(Biotechnology，3.317-320，1985)公开了用这种密码序列进行转化的酵母中完整PreS2-S蛋白密码序列的表达;还公开了在这种酵母细胞中合成了一种含有HBsAg和PreS2的颗粒，此颗粒的电子显微镜学和沉积作用的性质与只含有HBsAg的颗粒非常相似。还提出PreS2区域不影响形成类似于22nmHBsAg颗粒的那一种颗粒的能力。Valenzuela等人还公开了已经假设，通过偶联多聚清蛋白到其多聚清蛋白受体上，而受体又依次偶联到肝细胞上而使HBV基因进入肝细胞，这样病毒得到内在化(internalized)，并且HBV的多聚清蛋白受体是由PreS2区域编码的。Valenzuela得出结论含有PreS2的疫苗将会诱导抗体的产生，另外通过常规机制使HBV失活，此抗体能够影响病毒进入肝细胞的途径。
TakedaChemicalInd.KK在欧洲专利申请公布号171.908-A中声称，在酵母中进行了非糖基化的乙型肝炎病毒表面抗原P31蛋白的生产。
Chiron公司，欧洲专利申请公布号0，174，444A2提出一种从酵母中制备一些含有P31蛋白的HBsAg颗粒的方法。
下述表Ⅰ对已知的PreS2区域的氨基酸序列与发明题目中的HBVPreS2区域氨基酸序列进行了比较表1HBV的不同血清型PreS2区域的氨基酸序列比较HBVPreS2编码区域亚型-55-50-40-30-20-100参考adwMQWNSTAFHQALQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVNPAPNIASHISSSSARTGDP编码序列adwTLI1adwLLII2adw-I3adwKI4adrTLVTTPIFSAP5adrTLVTTPISAP6aywTTVLTTPLIFSIAL7adywHTTVTTTPIFSIAL8
氨基酸缩写符号AspD天冬氨酸IleI异亮氨酸ThrT苏氨酸LeuL亮氨酸SerS丝氨酸TyrY酪氨酸GluE谷氨酸PheF苯丙氨酸ProP脯氨酸HisH组氨酸GlyG甘氨酸LysK赖氨酸AlaA丙氨酸ArgR精氨酸CysC半胱氨酸TrpW色氨酸ValV缬氨酸GlnQ谷氨酰胺MetM甲硫氨酸AsnN门冬酰胺参考文献1.Valenzuelaetal.，InAnimalVirusGenetics(Field，JaenischandFoxeds)p.57-70，AcademicPress，NewYork(1980).
2.Chowetal.，FourthAnnualCongressforRecom-binantDNAResearch，SanDiego，USA，1984.
3.Fujisawaetal.，Nucl.AcidsRes.，11，4601-4610(1983).
4.Loetal.，BiochemBiophys.Res.Com.，2，382-388(1986).
5.Fujisawaetal.，citedabove.
6.Onoetal.，Nucl.AcidRes.，11，1747-1757(1983).
7.Galibertetal.，Nature，281，646-650(1979).
8.Paseketal.，Nature，282，575-579(1979).
B.疟疾疫苗最近大量研究提出在一个被疟原虫(Plasmodium)的某一种的子孢子阶段侵染的敏感寄主中的保护免疫可以通过此寄主产生的抗体传递到某一子孢子的环状体蛋白(CS蛋白)。
几种类型的疟原虫的子孢子蛋白已被克隆出来，并且其中一些已通过重组DNA技术表达出来。
Nusserzweig等人(U.S.专利4，466，917)公开了一种子孢子多肽，鉴定为P-44蛋白，克隆到大肠杆菌中并表达。
Sharma等人(Science，228，879-882，1985)公开了在酵母中通过使用含有酵母醇脱氨酶I基因的5′调节区域代替诺氏疟原虫(Plasmodiumknowlesi)cs基因序列的5′上游区域的表达载体表达了诺氏疟原虫的一部分cs蛋白。
纽约大学PCT申请公布号WO84-02922-A发表了为诺氏疟原虫环状体蛋白重复单位编码的一部分编码序列的克隆及β-内酰胺酶和β-半乳糖苷酶融合体在大肠杆菌中的表达。
Kemp等人，PCT专利申请公布号WO84-02917-A公开了来源于恶性疟原虫的血液生长阶段的cs蛋白的编码序列克隆到大肠杆菌中并表达。
Dame等人(Science，225，593，1984)公开了恶性疟原虫cs蛋白克隆到大肠杆菌中并表达，此蛋白质被描述为含有分子量近44，000的有约412个氨基酸的蛋白质。它由41个四肽的串联重复组成。合成的那种结合于单克隆抗体上的重复区域的7-，11-和15-残基肽能抗cs蛋白。
Ellis等人(Nature，302，536-538，1983)公开了在大肠杆菌中β-内酰胺酶与诺氏疟原虫cs蛋白融合的表达。
Enea等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，7520-7524，1984)公开了在一种疟原虫(P.cynomolgi)cs蛋白中的类似的重复单位结构，cs蛋白克隆到大肠杆菌中并表达，并公开了它的编码序列。
Ballou等人(Science，228，996-999，1985)公开了结合到牛血清蛋白(BSA)或产生抗体的甲状腺球蛋白上的恶性疟原虫cs蛋白重复区域的合成多肽，可以在小鼠及兔子体内产生应答。并推断出抗疟疾寄生虫子孢子阶段的疫苗能使用结合到载体蛋白的cs蛋白重复区域的合成肽来完善。
Weber等人(MolecularandBacterialParasitology，15，350-316，1985)公开了把恶性疟原虫(P.galciparum)的巴西菌株的克隆了的cs蛋白基因作为一种探针通过核酸杂交来分析其他17株恶性疟原虫的结构，并推断cs蛋白基因是高度保守的，用cs蛋白的疟疾疫苗的发展不会由于菌系的变化而复杂化。
Arnot等人(Science，230，815-818，1985)公开了间日疟原虫(P.vivax)的cs蛋白的克隆，并且公开了其全部编码序列，并推断间日疟原虫的cs蛋白编码序列和诺氏疟原虫的cs基因同源，但和恶性疟原虫不同源。
Sharma等人(Science，229，779-782，1985)公开了诺氏疟原虫的Nuri菌株的cs基因编码区域的全部核苷酸序列。
Young等人(Science，228，958-962，1985)公开了具有潜在应用于人类疟疾疫苗的恶性疟原虫cs蛋白在大肠杆菌中的表达。
Walter和ElizaHall医学研究所PCT专利申请公布号WO84/02917，1984公开了人工构建的多核苷酸序列大体上与所有或一部分恶性疟原虫mRNA或基因组DNA相对应;对应这种序列的肽和它的生产方法;在含有这种肽的脯乳动物中为刺激抗恶性疟原虫这一抗原的免疫反应的组分。
Mazier等人(Science，231，156-159，1986)指出在用恶性疟原虫环状体蛋白的几种重组和合成肽免疫了的老鼠中产生的抗体由于在人肝细胞培养系中的保护活性而受到评价，并发现此抗体显示出对抵御寄生虫在三个阶段有保护效果子孢子吸附到肝细胞表面，进入，以及以后向胞内发展。
c.多价疫苗Valenzuela等人(Biotechnology，3，323-327，1985)公开了把由PreS2编码序列所编码的HBsAg多聚白蛋白受体用作一种工具来制备多价疫苗。Valenzuela等人也公开了由酵母中表达杂交体HSV-1gD-PreS2-S蛋白编码序列制备杂种HBsAg一疱疹单式1病毒糖蛋白D(HSV-1gD)粒子。
Valenzuela，在“使用重组DNA技术乙型肝炎亚基疫苗”文中，5月15日，在BostonMassachussetts召开的Bio-Expo-5-会议，报导用如以上所述的HBsAg-HSV-1gD粒子这样的杂种，有一个出现在其表面的外部免疫源上的HBsAg免疫优势的问题。
Chiron公司，欧洲专利申请公布号0，125，261声称含有融于一个或多个寡肽的乙型肝炎表面抗原至少一个主要部分的杂交粒子，在那里杂交多肽能在细胞寄主内形成粒子，有至少一个寡肽的至少一个抗原决定簇出现。
蛋白质能够经过翻译后的修饰，使其中一些蛋白深深地受到影响，即影响蛋白质的构象和功能。在人体中寡糖链的存在衍生出PreS1-PreS2-S和PreS2-S蛋白(Heermanetal，inJ.Virol.，52，396-402，1984;StibbeandGerlichinVirology，123，436-442，1982;StibbeandGerlichinJ.Virol.，46，626-628，1983)，可能PreS1-PreS2-S蛋白上的豆蔻酸(Persingetal.，Abstractsofpaperspresentedatthe1986meetingonMolecularBiologyofHepatitisBviruses，August28-31，1986，ColdSpringHarborLaboratory)的存在能影响粒子的形成及粒子中蛋白质的构象以及这些粒子的抗原性和免疫原性。
酵母(Saccharomycescerevisiae)也具有类似于高等真核细胞的蛋白质糖基化(Ballou，“TheMolecularBiologyoftheYeastSacch-aromyces，MetabolismandGeneExpression”;Strathern，JonesandBroachEd.，ColdSpringHarborLaboratory(1982)，P.335-360)和脂肪酸酰化作用(TowlerandGlaslerinProc.Natl.Acad.Sci.，83，2812-2816，1986)的酶作用能力。
已经发现，在酵母中表达的病毒表面糖蛋白被糖基化了，Jabbar等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，82，2019-2023，1985)指出流感病毒血细胞凝集素基因在酵母中的表达导致了糖基化的血细胞凝集素蛋白。Wen和Schlesinger(Proc.Natl.Acad.Sci.，83，3639-3643，1986)指出Sindbis和疱状口炎病毒糖蛋白在酵母中以糖基化形式表达这些病毒蛋白。Fujisawa等人(Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses，Auguest 28-31，1986，Cold Spring Harbor Laboratory，P.62)指出Pre S2-S基因在酵母中的表达导致了Pre S2-S蛋白两个糖基化形式的合成。Kniskern等人(Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Modern Approaches to New Vaccines，Including Prevention of AIDS，September 9-14，1986，Cold Spring Harbor Laboratory，P.89)指出Pre S1-Pre S2-S基因在酵母中的表达导致了45KD和39KD的两个Pre S1-Pre S2-S蛋白的合成。Persing等人(Abstracts of papers presented at the 1986 meeting on Molecular Biology of Hepatitis B viruses，August 28-31，1986，Cold Spring Harbor Laboratory，P.19)指出用3H豆蔻酸标记的表达Pre S1-Pre S2-S，Pre S2-S和S蛋白的COS7细胞导致在Pre S1-Pre S2-S蛋白上存在标记。
在酵母中表达并在粒子中重新组装的融合蛋白可以用普通的方案纯化Aerosil的吸附作用和解吸附作用(1)→CaCl沉淀作用(2)→苯基琼脂糖或苯基硼化-琼脂糖的吸附作用和解吸附作用(3)→CsCl梯度离心或DEAE-离子交换色谱。
在EP申请公布0204680号中描述了第一步，在EP申请公布0199698号中描述了第3步。至于苯基琼脂糖也提到了。第(1)步和第(3)步的特殊联合可以完成快速的污染物清除。(排除达90%蛋白质，碳水化合物和50%的脂类)。这种新的联合使下一步色谱更好地发挥作用成为可能。
在融合蛋白被糖基化的例子中，苯基硼化物(PBA)被用作为一种亲和吸附剂。在pH9.0微，硼化物基团同糖基化了的侧链上的潜在顺-二醇基团共价化合。PBA凝胶偶尔被用于可溶糖蛋白的纯化但不用于镶嵌于脂双层的糖蛋白的粒子的纯化(See，Cook，etal.，AnalyticalBiochemistry，149，349-353，1985;Middle，etal.，BiochemicalJournal，209，771-779，1983;Cook，etal.，BiochimicaetBiophysicaActa，828，205-212，1985;Maestasane，etal.，JournalofChromatography，189，225-231，1980)。由于粒子上的多配住体连接位点，可使用非常低PB-配位体浓度的PBA凝胶，例如含硼化物(boronate)的PBA凝胶＜10ug/ml凝胶，最好是5ug硼化物/ml凝胶。具有非常低硼化物含量的苯基硼化物凝胶的可用作含有镶嵌糖蛋白粒子的亲和层析。
本发明涉及和含有一步步融于乙型肝炎病毒PreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域的功能DNA编码序列的重组DNA分子。这里所用的术语“编码序列”或“编码区域”也包括任何它的功能衍生物。术语“功能衍生物”是指在适当的地方，不干扰粒子形成和/或在希望保留的地方保护免疫原性的有氨基酸改变的编码序列。这种功能衍生物可以用常规位点特异诱变来制备，如用Botstein等人的方法(Science，229，1193-1201，1985)。这种DNA分子也含有一个来源于酵母arg基因的调节区域就更好。
本发明涉及含有有效地连结于调节区域的重组DNA分子的重组载体。在这个DNA分子中含有一步步融合于HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域的功能DNA编码序列。此处用的术语“调节区域”指的是含有启动子区域和编码序列的转录和翻译所必需的其他序列的DNA序列。
本发明也涉及用重组载体转化的真核寄主细胞。在所谓的载体中含有有效地连接于调节区域的DNA分子，在所谓的DNA分子中含有一步步融合于HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域功能DNA编码序列。这项发明也和制备这种含有用重组载体转化真核寄主细胞的转化寄主细胞的方法有关。
本发明也涉及制备含有HBsAg蛋白的杂种粒子的方法。这个HBsAg蛋白含有和/或代表一个功能DNA编码序列所编码的多肽，也包括在适当的培养基中培养用重组载体转化的真核寄主细胞和从细胞裂解产物或寄主培养液的提取液中分离粒子。在所谓的载体中含有有效地连接于调节区域的DNA分子，在DNA分子中含有一步步融于HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域的功能DNA编码序列。
本发明也涉及含有乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)粒子的杂种致免疫粒子。HBsAg粒子含有和/或代表一个功能DNA编码序列所编码的肽。
本发明也涉及含有这种杂种粒子的免疫保护量的疫苗。
本发明也涉及含有杂种粒子及多价吸附剂(polysorbate)的胶团，和含有这种胶团的免疫保护量的疫苗。
术语“功能DNA编码序列”是指一段DNA编码序列，它在一步步融合于DNAPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域时，不涉及，也不干扰HBsAg粒子的组装。
较好的功能DNA编码序列包括，但并不限制于(a)整个HBVPreS蛋白编码序列，或它的致免疫衍生物，比如，不限制于，PreS2，PreS1或PreS1-SPreS2蛋白编码序列;和(b)其他的致免疫编码序列列，诸如疟原虫的环状体蛋白编码序列，或任何它的致免疫衍生物，HIV的包膜基因编码序列，或任何它的致免疫衍生物，特别是C7肽，肽121或Dreesman肽编码序列或它的一个致免疫衍生物。
本发明也涉及编码以下氨基酸序列的HBVPreS1蛋白编码区域-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIleProCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGly
AGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAla或涉及HBVPreS2蛋白编码区域，或涉及在它的PreS2部分中为以下氨基酸编码的HBVPreS2-S蛋白编码区域-55-50Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp--40-30Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser--20Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser--10Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn;a也涉及含有这种有效连接于调节区域的PreS1，PreS2或PreS2-S蛋白编码区域的重组DNA载体;同含有这种载体的转化寄主细胞;同这种含有用此载体转化寄主细胞的转化细胞的制备过程;同这种编码区域编码的蛋白质;同制备这种蛋白质的过程;同含有这种蛋白质免疫保护量的疫苗;同这种PreS2-S蛋白编码区域编码的粒子;同准备这种粒子的过程;同含有这种粒子免疫保护量的疫苗，和含有这种粒子和多价吸附剂的胶团，以及含有这种胶团免疫保护量的疫苗。
本发明也涉及重组DNA载体有关，这种重组DNA载体含有整个PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列，或它的有效连结于调节区域的致免疫衍生物，与用这种载体转化的酵母寄主细胞;与制备含有用这种载体转化的酵母寄主细胞的转化的寄主的方法;与制备蛋白的方法，这个蛋白是由PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或由PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列，或由它的致免疫衍生物编码的;与用这种方法制备的蛋白质有关;与含有这种免疫保护量的蛋白质的疫苗有关;与含有多肽的粒子有关，这种粒子是由PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列或它的致免疫衍生物所编码的;与它的制备方法，含有这种粒子的免疫保护量的疫苗，含有这种粒子和多价吸附剂的胶团以及含有这种胶团免疫保护量的疫苗有关。
本发明也同PreS1-PreS2蛋白编码序列或者是它的PreS1-PreS2部分含有以下氨基酸序列的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列有关PRE-S1区域-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAsp
TGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIleProCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAla
Pre-S2区域-55ATGCAGTGGAATTCCACTGCCTTCCACCAAMetGlnTrpAsnSerThrAlaPheHisGlnGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGAlaLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGATyrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTThrValAsnProAlaProAsnIleAlaSerCACATATCGTCAAGCTCCGCGAGGACTGGGHisIleSerSerSerSerAlaArgThrGlyGACCCTGTGACGAACAspProValThrAsn
这项发明也同含有新的有效连接于表达控制序列的PreS1-PreS2或PreS1-PreS2-S蛋白编码序列的重组载体有关，同用此载体转化的寄主细胞有关;同制备含有用载体转化寄主细胞的转化的寄主的方法有关;与制备PreS1-PreS2或PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或它的致免疫衍生物所编码的蛋白质的方法有关;与用这种方法制备的蛋白质有关;与含有这种免疫保护量的蛋白质的疫苗有关;与含有PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或它的致免疫衍生物所编码的多肽的粒子有关;与它的制备方法，含有这种粒子的免疫保护量的疫苗，与含有这种粒子和多价吸着物的胶团有关。
以下描述了用在这个申请中的氨基酸缩写符号Asp天冬氨酸Ile异亮氨酸Thr苏氨酸Leu亮氨酸Ser丝氨酸Tyr酪氨酸Glu谷氨酸Phe苯丙氨酸Pro脯氨酸His组氨酸Gly甘氨酸Lys赖氨酸Ala丙氨酸Arg精氨酸Cys半胱氨酸Trp色氨酸Val缬氨酸Gln谷氨酰胺Met甲硫氨酸Asn门冬酰胺附图简要说明

图1是pRIT10601的限制性内切核酸酶图谱。
图1A是说明制备pRIT12662的流程图。
图1B是乙型肝炎病毒包膜区域的图解限制图谱。
图2是pRIT10616的限制性内切核酸酶图谱。
图2A列出了克隆λMPf1的图解限制图和序列分析策略。
图2B说明了质粒pRIT12893的结构。
图3是pMC200的限制性内切核酸酶图谱。
图3Aa、图3Ab、图3Ac、图3Ad、图3Ae、图3Af列出了恶性疟原虫的环状体蛋白基因的核苷酸序列。
图3B说明了质粒pRIT12897的结构。
图4是插入于质粒pMC200的酵母DNA的一部分3300bpHindⅢ核苷酸序列。在pMC200中一部分含有HincⅡ，BgⅢ和EcoRⅠ位点。
图4Aa、图4Ab列出了pRIT12792的含有PreS1-PreS2DNA编码序列。
图4B说明了质粒pRIT12899的结构。
图5是说明制备pRIT10671和pRIT10673的流程图。
图5A说明了质粒pRITX的结构。
图6是说明制备pRIT10749的流程图。
图7是说明制备pRIT10761和pRIT10764的流程图。
图8a、图8b、图8c是说明制备pRIT10167(例1)，pRIT10518和pRIT10162(例3);pRIT10157，pRIT10677和pRIT10909(例4);pRIT10911(例5);pRIT10679，pRIT10903，pRIT10914(例6);pRIT12211，pRIT12209和pRIT12230(例7);以及pRIT12288和pRIT12322(例8)的流程图。
图9是pRIT10172的限制性内切核酸酶图谱。
图10是pRIT12290的限制性内切核酸酶图谱。
图11是阐明它的一部分来源于pRIT12230和pRIT12288和pRIT12322的限制性内切核酸酶酶切图谱。
图12a、图12b是说明制备pRIT12571;pRIT12573;pRIT12572和pRIT12574的流程图。
图13是pRIT12309的限制性内切核酸酶图谱。
图14是说明制备pRIT12314和pRIT12544的流程图。
图15是说明制备pRIT12658的流程图。
图16是pRIT12662的限制性内切核酸酶图谱。
图17是说明制备pRIT12660的流程图。
图18是说明制备pRIT12845(a，b，c，d，e，f)的流程图。
HBsAg在酵母中的表达这里所用的“调节区域”是指含有一个为编码序列的转录和翻译所必需的或期望的DNA序列。这种调节区一般是处于5′端与要表达的编码序列相连。较好的是，含有转录终止信号酵母DNA的更远区域其位置紧接于要表达的3′编码区域，所以对转录终止有作用。
这里所用的“HBsAg”是指含有HBV基因组的S蛋白编码序列所编码的蛋白质的抗源。这个HBsAg，其结构类似于真正的HBsAg或者实质上有同真正的HBsAg一样的编码抗原决定簇的相同S蛋白编码序列，也就是说，它能促进特异地辨认真正的HBsAg和同真正的HBsAg反应的免疫反应，或者是它可被抗-HBsAg抗体所特异辨认。
HBsAg编码序列可以从感染了的人血清中的戴思(Dane)粒子提取出的DNA而分离得到。这种DNA是通过用DNA多聚酶，内源多聚酶更好，填齐单链区域，然后用限制性内切核酸酶消化而制得的。内切核酸酶的选择部分取决于特殊的戴恩粒子。比如，adw血清型的某种戴恩粒子的HBVDNA的HBsAg编码序列可以从一个单独的BamHⅠ酶解片段上分离得到;ayw血清的某种戴恩粒子的HBVDNA的HBsAg编码序列可以从HhaⅠ酶解片段分离得到。同样血清型的戴恩粒子的HBVDNA也显示了限制性位点的不同类型。
制备此发明中所用的DNA片段的DNA的限制性，制备此发明中所用的重组DNA分子的这种片段的的连接性以及插入到微生物中都是应用已知的技术诸如发表在前面和后面的标出的参考文献中的技术来进行的。选择避免DNA和酶变性的条件。比如，pH用缓冲液保持在7.0到11.0之间，温度保持在60℃以下。限制性最好在约30到40℃之间的温度进行，连接最好在0到10℃之间进行。在进行此发明中使用的限制内切酶和连段序列，它是一个或者保持或者提高天然序列的保护性致免疫活性的自然发生序列的衍生物或修饰的部位(version)。这种致免疫衍生物可以用常规的技术来制备。这里所用的术语“PreS2，PreS1，或整个PreS1-PreS2-S蛋白编码序列”包括它的任何致免疫衍生物。
术语“疟原虫的环状体蛋白”是指疟原虫子孢子上的免疫优势表面抗原或它的致免疫衍生物。有用的环状蛋白它包括，但不限制于那些来源于恶性疟原虫，间日疟原虫，卵园疟原虫(P.ovale)和四日疟原虫(P.malariae)的蛋白。恶性疟原虫、间日疟原虫、卵园疟原虫和四日疟原虫侵染人类。
在Science，225，593-599(1984)Dame等人报导了恶性疟原虫的cs蛋白编码序列。在Science，230，815-818(1985)上Arnot等人报导了间日疟原虫的cs蛋白编码序列。在Science，229，779-782(1985)上Sharma等人报导了诺氏疟原虫的cs蛋白编码序列。在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7520-7524(1984)上Enea等人报导了P.cynomolgi的cs蛋白编码序列。疟原虫的其他种的cs蛋白编码序列已为人所知(见上面提到的参考书)和/或可用常规的技术获得。
如这里所用的，术语“csp”或“cs蛋白”将包括疟原虫天然的、全长度环状体蛋白以及它的任何致免疫衍生物。术语疟原虫环状体蛋白的“致免疫衍生物”是指(a)保留保护致免疫活性的疟原虫环状蛋白的衍生物或(b)来源于保留保护致免疫活性的疟原虫环状体蛋白的修饰了的编码序列的蛋白质。这种致免疫衍生物可以用常规的技术来制备。一些恶性疟原虫的cs蛋白编码序列的致免疫合成衍生物在Ballou等人的文章中透露出来，Science，228，996-999(1985)。也可参看，Mazier等人.，Science，231，156-159(1986)。
疟原虫的各个种的cs编码序列是已知的并可用已知的技术来制备或分离。〔参看，如Colman等人，WO84-02922-A(恶性疟原虫cs蛋白)和来的氨基酸残基。
本发明的一个实施例是HBsAg，编码序列和HBsAg前体(Pre S-S)蛋白的42密码子在从arg3启动子所翻译的酵母OCT蛋白编码序列的第18个氨基酸之后一步步地融合。这样构想给适当的S-蛋白的226个氨基酸与含有包括另外的60N-末端氨基酸的HBsAg蛋白的杂种粒子。
一个典型的调节区域是从为鸟氨酸甲酰氨基转移酶(OCT)编码的酵母arg3基因中所得到的。arg3调节区域受特殊的和一般的调节机制二者的支配。据Crabeel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第78卷，6026页(1981)，报导，arg3调节区域已在质粒pYeura arg3上被克隆到大肠杆菌中。精氨酸生物合成途径被去阻遏的啤酒酵母(S.cerevisiae)株系，如1c 1697d株系，是较好的寄主。与DC5株系相比，使用这种株系导致源于arg3启动子的增强表达。其他有用的调节区域的例子包括了那些来源于糖酵解途径酵母基因的调节区域，如为烯醇化酶、醛缩酶、磷酸甘油酸激酶和3-磷酸-甘油醛脱氢酶编码的调节区域;酵母乙醇脱氢酶基因;以及，一般来说，涉及分解代谢中的基因，如精氨酸酶基因。
把融合了的DNA片段克隆到酵母中的较好的载体是质粒YEp13。它可在大肠杆菌和啤酒酵母两者中复制并保存。因此，被认为是一种穿梭载体。几种其他酵母载体也为人所知并可得到。HBsAg和调节区域可被连续地或自发地插入到酵母载体中。用含有在酵母中发挥作用的自主复制序列(复制子)的质粒载体的转化一般将会导致产生象质粒一样的此发明DNA分子的染色体外保留。这种复制子的得到需要技巧。用不含有在酵母中发挥作用的复制子的质粒载体的转化会导致产生DNA分子掺入到染色体DNA中。
根据此发明，促进保护免受HBV对人入侵的疲苗含有酵母所产生的HBsAg，用已知的技术可以制备合适的载体。希望使用一种佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝。这样生产出来的HBsAg也能与其他免疫原结合来制备接酶可以从市场上买到并应按产品的要求使用。TDNA连接酶是较好的连接酶。
各种片段和最后的结构可以按照常规的方法连接起来。在很多情况下，基因被分离出来，作限制性酶切图谱并测定序列。这样，人们可选择感性趣的的序列，如HBsAg序列，通过基因的限制性酶切，选用以后必需的操作步骤，如用Bal31进行酶切，体外诱变，引物修复，或类似的方法，从而提供期望大小，包括期望序列，且具有适当的末端的片段。衔接物和连接物可以用于连接序列，以及代替丢失序列，此处使用的限制酶切位点在感兴趣的区域内部。切开的各种片段可以通过电泳，电洗脱，与其他序列连接，克隆，重分离和其他操作进行纯化。
感兴趣的结构基团控制转录的调节区域的使用，如HBsAg序列，可能使寄主细胞达到生长高密度，但结构基因，如HBsAg基因，不表达或低水平的表达，然后再改变环境条件，如营养，温度等来诱导表达。
例如，含有GAL4调节区域，酵母细胞可以在有甘油-乳酸混合物的营养丰富的介质中生长到高浓度，如在对数中期或后期，然后转变碳源为半乳糖。另一个例子是，PHO5调节，人们可以在大约7mM KH2PO4的高岭酸盐浓度中生长细胞，然后使细胞重悬于缺乏磷酸盐的介质中得到恢复，以影响去阻遏和表达。由于温度敏感性，可使细胞在25℃到37℃间生长，然后改变温度约到5℃到20℃至合适。寄主细胞应该含有同所使用的调节区域相联系的调节系统。
把HBsAg序列融于调节区域可以通过使用中间载体来完成，或者是，HBsAg序列可以直接插入到含有调节区域的载体中。载体是可以携带并保持发明的DNA片段包括如噬菌体和质粒的DNA。例如，Charnay等人，Nature，第286卷，第893-895页(1980)和Tiollais，英国专利申请2，034，323公开了噬菌体中克隆DNA片段的技术。认为HBsAg序列与调节区域有关更好，这样，通过HBsAg序列表达合成的HBsAg就可免除外组合疫苗。HBV或组合疫苗可以例如通过皮下的、静脉内的或肌内途径来使用。这项发明的DNA片段和由此而产生的HBsAg也能够通过DNA杂交技术和各种免疫测定作为生物样品中HBV测定的探针。
含有逐步融合于HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域的功能DNA编码序列的DNA分子的表达本发明也同含有逐步融合于HBV Pre S2-S蛋白编码序列的一部分Pre S2区域的功能DNA编码序列的重组DNA分子有关。这里所用的术语“编码序列”或“编码区域”也含有它的功能衍生物。“功能衍生物”这个术语是指在希望的地方不妨碍粒子的形成和/或保持其免疫原性的涉及氨基酸改变的编码序列。这些功能衍生物可以通过常规的点特异诱变来制备。Botstein等人，Science，229，1193-1201(1985)首先使用了点特异突变技术。这种融合可以发生在Pre S2区域的N-末端或者在Pre S2区域内的一些点上。可以有四种类型的融合，即在整个Pre S2区域的5′-末端，在Pre S2区域内的一些位置上，这样Pre S2 DNA位于功能DNA编码序列的两侧，或在Pre S2区域截短部分的5′-末端上，或是在S-蛋白编码区域的5′-末端，这样融合不含有Pre S2 DNA。各种Pre S2-S蛋白编码序列已为人所知，并可以用已知的技术来制备或分离。〔参看，此文所指的参考书，上述〕。这项发明的一个体现是ARG3调节区域和酵母OCT蛋白的18个氨基酸一步步融合到截短的Pre S2-S蛋白编码序列，以致融合了的序列含有Pre S2-S蛋白编码序列和完整的S蛋白编码序列的42个密码子。较好的功能DNA编码序列包括疟原虫的环状体蛋白编码序列，或它的致免疫衍生物，HIV的包膜基因编码序列或任何它的致免疫衍生物，特别是C7肽，肽121或Dreesman肽编码序列或它的致免疫衍生物。例如，一个较好功能DNA编码序列是后来连结于Pre S2-S蛋白编码序列的截短的Pre S2区域的C-末端42个密码子的Pre S2编码序列的开头的13个N-末端密码子。术语“致免疫衍生物”是指一Dame等人.，Science，225，593(1984)(恶性疟原虫cs蛋白)〕。含有cs编码序列的DNA分子，或任何其它一步步融合到HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域的功能DNA编码序列都能用常规的技术来构建。如用把cs编码序列或任何其他功能DNA编码序列一步步连接到在PreS2-S蛋白编码序列的55个氨基酸PreS2编码区域内的任何密码子上。
较好的是，足够的PreS2编码序列保留到cs编码序列或任何其他功能DNA编码序列的连接之后，以保证cs蛋白或任何其他功能DNA编码序列蛋白的最适出现，即应该保留足够的PreS2区域，这样，编码多肽的PreS2区域作为功能DNA蛋白编码序列产物和HBsAg粒子表面之间的桥而起作用。据报导，PreS2编码序列的26个氨基末端氨基酸代表了在PreS2区域上的一个占优势的抗体结合位点。〔参见，如Milich等人，Science，228，1195-1199(1985)〕。因此，如果想要制备一个含有和/或代表PreS2抗原决定簇和cs二者，或其他功能编码序列抗原决定簇的杂种粒子，最好把cs编码序列或其他功能DNA编码区域插入到在使含有和/或代表PreS2抗原决定簇和cs二者，或其他功能DNA编码序列抗原决定簇的杂交粒子的制备成为可能的PreS2编码区域中的一个位点上。
此发明的重组载体包括有效连接于调节区域的有关发明的重组DNA分子(即一个功能DNA编码序列一步步融合到HBVPreS2-S蛋白编码序列的一部分PreS2区域)。这种载体另外也许也包含一个在酵母中行使功能的复制子。术语“复制子”是指保持功能稳定的DNA最小区域，并且是染色体外的在用此载体转化的寄主酵母有机体中的重组载体。这种复制子的得到需要技巧。术语“调节区域”是指调节想要表达的编码序列的调节转录和翻译的DNA区域。这种调节区域的得到需要技巧。这种载体可以用常规的技术来制备，如把这项发明的DNA分子逐步逐步地插入到已经含有复制子和调节区域的载体上，通过这种方式DNA分子有效地连接到这样的调节区域上。较好的是，DNA分子连接到能够在酵母的酵母属(Saccharomyces)中表达的载体上。
本发明也和用这种重组载体中转化的酵母寄主细胞，同制备这种含有用此发明的重组载体转化酵母寄主细胞的转化寄主的方法有关。这种转化用常规技术如以上已经描述了的技术来进行。较好的酵母细胞包括那些属于酵母属的酵母，特别是那些属于啤酒酵母种和卡氏酵母(Saccharomycescarlsbergensis)种的酵母。
本发明也与制备含有HBsAg蛋白的杂种粒子的方法有关。这个HBsAg含有和/或呈现了功能DNA编码序列产物。在这个方法中包括在适当的培养介质中培养此发明的转化酵母寄主细胞，并从细胞裂解产物或这个寄主培养物提取液中分离粒子。术语“呈现”或“含有和/或呈现”是指功能DNA编码序列蛋白包含于含有HBsAg蛋白的杂种粒子中。通过这种方式，可使对功能DNA编码序列蛋白的免疫反应的产生成为可能。当需要使的时候，虽然不一定是必要的时候，功能DNA编码序列蛋白的出现并不干扰HBsAg抗原决定簇的致免疫活性，因此，形成了二价疫苗。大多数转好的功能DNA编码序列蛋白出现在HBsAg粒子上，以这样一种方式，或是功能DNA编码序列蛋白的抗原决定簇或是功能DNA编码序列蛋白和HBsAg抗原决定簇二者的最大量均能适量地暴露。“适当的培养介质”是指能使转化寄主生存下来，并也能使这种寄主表达载体的杂种功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列蛋白质产物的介质。载体在恢复量中转化。最好操作者有一定技巧，使用适当的培养基取决于所用的寄主细胞。将此发明中的杂种粒子从细胞裂解产物或此寄主培养物的提取液中的分离是用常规的蛋白质分离技术来进行的。
本发明也和含有此发明杂种粒子的疫苗有关，这个疫苗将含有此发明杂种粒子的免疫保护蛋白质的量，并用常规的技术制备。“免疫保护”是指此发明足够的杂种粒子有助于得到没有严重的付作用而具有对想要被保护的因素的足够的保护抗体反应。再者，此发明的疫苗含有此发明的胶团，即胶团含有此发明的粒子和多价吸附剂。这种胶团组成的多价吸附剂的最佳量是每100μg蛋白5-50μg多价吸附剂。此胶团可以用欧洲专利申请公布号0199698所报导的方法来制备。
在本发明的疫苗中，本发明杂种粒子的水溶液在生理pH缓冲液中直接使用更好。粒子可以选择性地同任何各种已知的佐剂搀和或吸收。这些佐剂除了氢氧化铝外还包括有其他物质。
疫苗准备一般在“疫苗的新动向与发展”上有叙述。由Voller等人编著，Park大学出版社，Baltimore，Maryland，美国，1978。
出现在每种疫苗剂量中目前发明杂种粒子的量被选作诱导免疫保护反应而在经典疫苗中无大的付作用的量。这个量变化由使用特殊的免疫原和疫苗以及是否用佐剂辅助来决定。一般来说，期望每个剂量含有1-1000μg蛋白质，1-200μg更好。特殊疫苗的最适量可以用包括受试者抗体效价观察和其他反应的标准研究来决定。按照一个最初的疫苗接种，受试者最好在大约四周内接受一次强化，之后只要感染的危险存在多长，每六个月就接受重复的强化。
本发明中对杂种粒子的免疫反应可通过佐剂的使用来提高，如(但不限制于)氢氧化铝(明矾)。
本发明杂种粒子的举例说明，为恶性疟原虫环状蛋白(cs)重复抗原决定簇编码的64个密码子DNA序列和8个密码子cs编码序列〔见Dame等人，Science，225，593-599(1984)〕分别被一步步插入到在含有复制子、PreS2-S蛋白编码序列和适当的调节区域的酵母表达载体中的一部分PreS2编码序列中。两个表达载体，即一个含有64个密码子cs序列，另一个含有8个密码子cs序列，每个都被插入到酵母寄主细胞中，分析这种转化细胞的提取液来看在同一分子上的HBsAg抗原决定簇和cs抗原决定簇是否存在。
使用cs特异的5个单克隆抗体和抗原来源于酵母的纯化HBsAg的一个单克隆抗体，从免疫吸印分析得到的结果表明37，000千道尔顿(Kd)杂种蛋白是从用含有同PreS2-S蛋白编码序列一步步融合的64个密码子cs编码序列的载体转化的酵母的裂解产物中获得的，30，000Kd杂种蛋白是从用含有同PreS2-S蛋白编码序列一步步融合的8个密码子cs编码序列的载体转化的酵母的裂解产物中获得的。这些蛋白装配到HBsAg粒子状结构是通过CsCl和蔗糖梯度分析，高压液相层析(HPLC)和电子显微镜检术来显示的。在这种粒子外部cs抗原决定簇的出现是通过cs抗原决定簇对ELISA分析中cs特异抗体的接受能力来显示的。在这种粒子外部HBsAg抗原决定簇的出现是通过放射免疫分析(AUSTIAⅡ，Abbott)或ELISA分析(Enzygnost-HBsAg，Behringwerke)来显示的。
新的PreS2和PreS2-S蛋白编码序列本发明的新的HBVPreS2和PreS2-S蛋白编码序列来源于从质粒pRIT10616分离出来的HBVadw亚型。这里所用的术语“编码序列”或“编码区域”也包含它的功能衍生物。术语“功能衍生物”是指在合适的地方有氨基酸改变但并不干扰粒子的形成并且(或者)在此其保留是满意的地方保持免疫原性的编码序列。这个功能衍生物可以采用常规的位点特异突变来制备，如用Botstein等人的方法，Science，229，1193-1201(1985)。这种PreS2和PreS2-S蛋白编码序列可以用常规的重组DNA步骤来恢复。这种常规的重组DNA步骤来源于Budapest条约存放在在美国典型菌种保藏所，Rockville，Maryland，1982年6月2日，登记号ATCC38131，的质粒pRIT10616。这个新的蛋白编码序列的PreS2区域为以下氨基酸序列-55-50Met-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp--40-30Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-
-20Ser-Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile--10Ser-Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn.
这个区域也可通过常规的合成寡核苷酸的合成来获得。这项发明的PreS2-S编码序列的较好的功能衍生物是一个第45位的丙氨酸(GCT)在那里通过点特异突变改成苏氨酸(ACT)。与此发明的未修饰编码序列相比较，这个功能衍生物通过转化的啤酒酵母导致了大两倍水平的表达。
这项发明的重组载体含有有效地连接于调节区域的有关发明的PreS2或PreS2-S蛋白编码序列。这种载体可能另外也含有取决于选用物和/或所使用的寄主的复制子。术语“复制子”是指在用这种载体转化的真核或原核生物寄主中的重组载体的保持功能稳定的染色体外DNA最小区域。这种复制子的得到需要技巧。术语“调节区域”是指含有启动子区域和编码序列转录所必需的其他序列的DNA序列。这种调节区域的得到需要技巧。这样一种载体可以用常规的技术来制备，如把这项发明的PreS2或PreS2-S蛋白编码序列一步步插入到已经含有复制子和调节区域的载体上，通过这种方式DNA分子有效地连接到调节区域上。最好是DNA分子连接到能够在酵母如酵母属中表达的载体上。
这项发明也和用这种重组载体转化的寄主细胞和制备这种转化寄主的方法有关。这种转化用常规技术进行。寄主细胞可以是真核的或原核的。最适的寄主细胞是真核细胞，特别是酵母细胞并包括那些属于酵母属的酵母，特别是那些属于啤酒酵母和卡氏酵母种的酵母。
本发明也和本发明的PreS2或PreS2-S蛋白编码序列所编码的蛋白质的制备有关。在这个方法中包括在适当的培养基中培养此发明的转化寄主细胞，和从寄主细胞培养液或从细胞裂解产物中分离蛋白，此分离取决于寄主细胞分泌这种蛋白质的能力。“适当的培养基”是指在恢一量中能使这项发明的转化细胞生存下来并也能使寄主表达这项发明的PreS2或PreS2-S蛋白编码序列的培养基。有经验的人会知道，使用适当的培养基将依使用的寄主细胞而定。把这项发明的PreS2-S蛋白从这寄主的培养裂解产物或寄主的培养液中分离出来是用常规蛋白质分离技术来进行的。用此发明的方法制备的蛋白质可以依寄主细胞糖基化能力来糖基化。如果想要得到一个去糖基化的蛋白质，这项发明的蛋白质应该通过使用无糖基化作用的寄主细胞或者通过在进行这项发明的过程之前的蛋白质的编码序列上采用常规位点的特异突变，如用Botstein等人的方法，Science，229，1193-1201(1985)来进行制备。
本发明也同含有些发明的PreS2或PreS2-S蛋白的免疫保护量的疫苗有关。这种疫苗可以用常规的技术来制备。
本发明也同制备含有包含此发明的PreS2-S蛋白编码序列所编码的蛋白质的HBsAg蛋白的杂种粒子的方法有关，这个方法包括在适当的培养基中培养此发明的转化真核寄主细胞，并从寄主细胞培养液或从细胞裂解产物或这种寄主培养液的提取液中分离粒子，此分离取决于转化寄主细胞分泌这种粒子的能力。“适当的培养基”是指能使此发明的转化细胞生存下来并能使寄主从粒子形式和恢复量表达此发明的PreS2-S蛋白编码序列的培养基。有经验的人会知道，使用适当的培养基依所使用的寄主细胞而定。此发明的杂交粒子从培养液裂解产物或寄主培养液中分离出来是用常规的分离技术进行的。
本发明也会和含有此发明的杂种粒子的疫苗有关。这种疫苗含有此发明的杂种粒子的免疫保护量并用常规技术来制备。最好是此发明的疫苗包括此发明的胶团，即胶团含有此发明的粒子和多价吸附剂。这种粒子构成的多价吸附剂的最适量是每100μg蛋白质5-50μg多价吸附剂。胶团可用欧洲专利申请公布第0199698号上发表的方法来制备。
在此发明的疫苗中，此发明的PreS2-S蛋白或杂种粒子的水溶液可以直接使用，最好在生理pH缓冲液中。蛋白质或粒了可以选择性地同各种已知的佐剂一起搀合或吸收。这种佐剂包括氢氧化铝及其他。
疫苗制备一般在“疫苗的新动向与发展”(NewTrendsDevelop-mentinVaccines)上有叙述。此书由Voller等人编著，UniversityPark出版社出版，Baltimore，Maryland，美国，1978。对脂质体的包裹作用(Encapsulation)也有叙述，例如，Fullerton，美国专利4，235，877。对蛋白质连到大分子上也有描述。例如，Likhite，美国专利4，372，945和Armor等人，美国专利4，474，757。
本发明中的每个疫苗剂量中PreS2-S蛋白或杂种粒子的量被选定为诱导那种免疫保护反应而在经典疫苗中又没有大的付作用的量。这个量依所用的特异免疫原和疫苗是否用佐剂辅佐而变化。一般来说，希望每个剂量含1-1000μg蛋白质，最好是1-200μg。特殊疫苗的最适量能用包括受试者抗体效价的观察和其他反应的标准研究来决定。按照一个最初的疫苗接种，受试者最好在大约四用内接受一次强化，之后只要感染的危险存在多长，每六个月就接受重复的强化。
对PreS2-S蛋白或此发明的杂种粒子的免疫反应通过使用佐剂，如矾，但不限制于矾，来提高。
新的PreS1蛋白编码序列此发明的新的HBVPreS1蛋白编码序列来源于从质粒pRIT10616中分离出的HBVadw亚型。这里所用的术语“编码序列”或“编码区域”包括它的任何功能衍生物。术语“功能衍生物”是指那种不干扰粒子形成和/或保留免疫原性的包含氨基酸改变的编码序列。这种功能衍生物能用常规位点特异突变来制备，如Botstein等人的方法，Science，229-1193-1201(1985)。这种PreS1蛋白编码序列能用常规重组DNA程序来恢复，这种程序来源于按照Budapest条约寄存在美国典型菌种保藏所，Rockville，Maryland，1982年6月2日，登记号ATCC38131的质粒pRIT10616，PreS1区域为以下氨基酸序列编码-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIlePro
CCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAla这种区域也可以用常规的合成寡聚核苷酸的合成而获得。
此发明的重组载体包含有效连接于调节区域的有关发明的PreS1蛋白编码序列，另外也可能包含取决于选用物和/或使用的寄主的复制了。术语“复制子”是指在用载体转化了的真核或原核生物寄主中的重组载体的保持功能正常的染色体外DNA最小区域。这种复制子的得到需要技巧。术语“调节区域”是指含有启动子区域和编码序列转录必需的其他序列的DNA序列。这个调节区域的得到需要技巧。这种载体可用常规技术如用把此发明的PreS1蛋白编码序列一步步插入到已经含有复制子和调节区域的载体中来制备。通过这种途径，DNA分子有效地连接到调节区域上。最好是DNA.分子连接到能在如酵母属的酵母菌中表达的载体上。
本发明也同用重组载体转化的寄主细胞有关，同制备转化寄主的方法有关。这种转化是用常规技术来进行的。寄主细胞可以是真核的或原核的。较好的寄主细胞是真核细胞，特别是酵母细胞，包括那些属于酵母属的细胞，特别是那些属于啤酒酵母和卡氏酵母种的细胞。
本发明也同制备此发明的PreS1蛋白编码序列所编码的蛋白质的方法有关，这个方法包括在适当的培养基中培养此发明的转化寄主细胞，和从寄主细胞培养液或从细胞裂解产物或这种寄主培养液的提取液中分离蛋白质，此分离依转化寄主细胞分泌这种蛋白质的能力而变。“适当的培养基”是指能使此发明的转化寄主生存下来并在恢复量条件下能使此寄主表达此发明PreS1蛋白编码序列的培养基。有经验的人会知道，使用适当的培养介质依使用的寄主细胞而定。此发明的PreS1蛋白的从培养液裂解产物或此寄主的培养液中分离出来是用常规的分离技术来进行的。用此发明的方法制备的蛋白质依寄主细胞的糖基化能力可以被糖基化。如果想要一个脱糖基化的蛋白质，这项发明的蛋白质应该使用无糖基化作用的寄主细胞或用在本发明的过程进行之前在蛋白质编码序列上的常规位点进行特异突变。位点特异突变是用如Botstein等人的方法，Science，229，1193-1201(1985)来进行的。
本发明也和含有此发明的PreS1蛋白的疫苗有关。这种疫苗含有此发明PreS1蛋白的免疫保护量并用常规技术制备。
在发明的疫苗中，此发明的PreS1蛋白的水溶液可以直接使用，在生理pH缓冲最好。PreS1蛋白可以选择性地同任何各种已知的佐剂混合或吸收。这种佐剂包括氢氧化铝及其他。
疫苗制备一般在《疫苗的新动间与发展》上有叙述，此书由Voller等人编著，UniversityPark出版社出版，Baltimore，Maryland，美国，1978。在脂质体中的包裹作用有叙述，例如Fullerton，美国专利，4，235，877。蛋白质连接到大分子上也有报导，例如Likhite，美国专利4，372，945和Armor等人，美国专利4，474，757。
出现在每个疫苗剂量中的本发明的PreS1蛋白的量被选作为诱导免疫保护反应而在经典疫苗中没有大的付作用的量。这个量将依所用的特殊免疫原和疫苗是否用佐剂辅佐而变。一般来说，希望每个剂量包含1-1000μg的蛋白质，最好是1-200μg。特殊疫苗的最适量可以通过包括受试者抗体效价观察和其他反应的标准研究来查明。按照一个最初疫苗接种，受试者将最好在大约四周内再接受一次疫苗强化，继而只要感染的危险存在多长，每六个月就接受一次重复强化。对此发明的PreS1蛋白的免疫反应使用佐剂，如矾，但不限制于矾来提高。
新的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列这项发明也同其PreS1-PreS2部分含有以下氨基酸序列的HBVPreS1-PreS2-S蛋白编码序列有关PreS1区域-163ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGMetGlyThrAsnLeuSerValProAsnProLeuGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGlyPhePheProAspHisGlnLeuAspProGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATAlaPheGlyAlaAsnSerAsnAsnProAspTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGTrpAspPheAsnProIleLysAspHisTrpCCAGCAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCAProAlaAlaAsnGlnValGlyValGlyAlaTTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCPheGlyProGlyLeuThrProProHisGlyGGTATTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGlyIleLeuGlyTrpSerProGlnAlaGlnGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTGlyIleLeuThrThrValSerThrIlePro
CCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAProProAlaSerThrAsnArgGlnSerGlyAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAArgGlnProThrProIleSerProProLeuAGAGACAGTCATCCTCAGGCCArgAspSerHisProGlnAlaPRE-S2区-55ATGCAGTGGAATTCCACTGCCTTCCACCAAMetGlnTrpAsnSerThrAlaPheHisGlnGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGAlaLeuGlnAspProArgValArgGlyLeuTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGATyrPheProAlaGlyGlySerSerSerGlyACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTThrValAsnProAlaProAsnIleAlaSerCACATATCGTCAAGCTCCGCGAGGACTGGGHisIleSerSerSerSerAlaArgThrGlyGACCCTGTGACGAACAspProValThrAsn
此发明的新的HBVPreS1-PrS2-S蛋白编码序列来源于从以上所述的质粒pRIT10616中分离出来的HBVadw亚型，可以从美国菌种保藏所，Rockville，Maryland，登记号ATCC38131，上获得。术语“编码序列”或编码区域也包括任何一种从它来的功能衍生物(或叫功能推衍)。“功能推衍”是指一段具有氨基酸变化的编码序列，这些变化，在适当的地方，并不干扰粒子的形成，或者说，这些变化在可能出现免疫原性的地方可保持该免疫原性。这种“功能推衍”可通过常规的特异性位点突变方法，如Botstein等的方法，《科学》，229，1193-1201，(1985)。
由此方法而得的重组载体含有与一调节区域相连的人工操作产生的PreS1-PreS2-S蛋白质编码序列。此外，这种载体也可能包含一个依赖于选择性的和(或)依赖于要使用的寄主的复制子。“复制子”是指维持其功能稳定的一段最小的区域，在染色体外，这种重组载体位于以它进行转化的真核寄主或原核生物体内。这种复制子在此方法中已闻名遐迩。“调节区域”是这样一段DNA顺序，它含有一个启动区域和为一段编码序列的转录必需的其他顺序，而这一段编码序列则调节一个结构基因编码序列的转录。这种调节区域也是众所周知的。这种载体可由一般的方法得到，如把在噬菌体中获得的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列嵌入已具有复制子和调节区域的载体中，使得通过人工操作将DNA分子与这个调节区域相连。DNA分子优先缚于能在酵母，如酵母属中表达的载体上。
本发明也与寄主细胞经这种重组载体进行转化有关，还涉及到获得这种转化寄主的方法。用常规方法即可进行上述转化。寄主细胞可以是真核或原核的。经选择的宿主细胞为真核细胞，尤其是酵母及包括属于酵母属的细胞，特别是其中属于啤酒酵母和卡氏酵母。
该发明还涉及到制备由PreS1-PreS2-S蛋白质编码序列所编码的蛋白质的方法，此方法包括在合适的培养基上培养转化了的宿主细胞，从宿主细胞培养液或细胞溶化产物中分离蛋白质，或者，依赖宿主细胞可分泌蛋白质的能力，从宿主培养物中提取该蛋白质。上述的“合适的培养基”是这样的培养基，它能使本发明转化后的宿主存活，也能使这一宿主以可取得的量表达PreS1-PreS2-S蛋白质编码序列的产物。在熟练工作人员的工作中可以看到，将采用的合适的培养基会依赖于要使用的宿主细胞。用常规的蛋白质分离技术可从培养溶化物或宿主培养液分离得PreS1-PreS2-S蛋白质。以此法制备的蛋白质，可能会由于宿主细胞的糖基化作用而带有糖基。如果需要去糖基的蛋白质，就要利用无糖基化作用的宿主细胞来制备，或者，在进行这种发明方法之前，采用常规的蛋白质编码序列上特异性点突变方法，如(Botsteinet.al.Science，229，1193-1201，(1985))。通过一个转化了的酵母或哺乳动物宿主细胞，PreS1-PreS2-S编码序列将表达为糖基化蛋白质。通过一个转化了的酵母宿主细胞，PreS1-PreS2-S编码序列将表达为N-肉豆蔻酸蛋白。
本发明还涉及到含有大量PreS1-PreS2-S蛋白质的免疫保护性疫苗。这种疫苗可用一般技术获得。
本发明也涉及了制备含有HBsAg蛋白的杂种粒子的方法，HBsAg蛋白包含了由PreS1-PreS2-S蛋白编码序列编码的蛋白质，这种发明中也包括了在合适的培养基中培养转化了的真核寄主细胞，从寄主细胞培养液或细胞溶化产物中分离这种蛋白质颗粒，或者根据转化了的宿主细胞可分泌蛋白质的能力提取这种蛋白质的培养基。所谓“适合的培养基”即是使转化后的宿主存活，使宿主以颗粒形式、以补偿量表达PreS1-PreS2-S蛋白编码序列的培养基。应注意，在此法中，所用的培养基将依赖于使用的宿主细胞。用一般的分离技术从培养的溶化物或寄主培养液中分离蛋白质颗粒。
本发明亦涉及到该发明的含有杂种粒子的一种疫苗。这种疫苗包含有大量免疫保护的杂种粒子，这些粒子可由一般的技术制备。更好的是，该发明得到的疫苗具有一种胶团，即，含有此发明所得的粒子和多价吸附剂的胶团。胶团中多价吸附剂的选择量为每100μg蛋白质中含5-50μg多价吸附剂。制备胶团的方法在欧洲专利申请公布No.0199698中有叙述。
本发明制备的疫苗中，PreS1-PreS2-S蛋白质或杂种粒子的水溶液可选择在生理pH缓冲条件下直接使用。另一方法是，这种蛋白质或粒子可被众多已知的佐剂之一吸收或与其混合。这些佐剂包括氢氧化铝就其他许多物质。
疫苗制备方法的描述常见于“疫苗的新动向与发展”中，此书由Voller等主编，UniversityPark出版社，美国马里兰州巴尔的摩，1987年出版。例如，包裹在脂质体内就是由Fullerton描述的，美国专利4，372，945，又如，Likhite和Armor等揭示了蛋白质与大分子物质的结合，美国专利4，372，945和4，474，757。
存在于每一疫苗剂量中的以现有发明制得的PreS1-PreS2-S蛋白或杂种粒子的数量，被选来用在典型疫苗诱导产生免疫保护性，而无明显的、相反的副作用的剂量数量。随着所用的特异性抗原之不同以及疫苗是否加有佐剂，这一数量可以改变。一般期望的是每一疫苗剂量含有1-1000μg蛋白质，最好是1-200μg。要确定一种特定的疫苗产生的最佳蛋白质数量可通过标准方法，包括抗体效价的观察，以及观察其他的反应。在初始接种后，有选择性地增大接受试验者在约四周内的剂量，这之后，只要传染的可能性存在，就要接着每6个月重复增加剂量。
利用佐剂，如明矾，但不限于矾，可提高对于PreS1-PreS2-S蛋白或杂种粒子的免疫反应。
酵母中PreS1-PreS2-S蛋白的表达本发明也关系到一个重组DNA载体，它含有人工操作与一段表达控制顺序相连的整个PreS1-PreS2-S蛋白质编码序列。这里所说的“编码序列”或“编码区域”也包括由此产生的任何功能推衍。“功能推衍”是指一段具有氨基酸变化的编码序列，这些变化在适当地方，不干扰颗粒的形成，或者说，这些变化在可能有免疫原性的地方，保持其免疫原性。用常规的特异性点突变法，如Botstein等的方法。(Science，229，1193-1201(1985))，可制备这种功能推衍。此外，这种载体还可能含有一个复制子，这个复制子是选择依赖性或宿主依赖性。可喜的是，由此发明可得到我们将使用的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列。
“复制子”是可以稳定地维持其功能的最小的DNA区域，在染色体外，这种重组载体通过该发明所得的载体在寄主酵母体内进行转化。这些复制子已众所周知。所谓“调节区域”是指任何一段DNA序列，它含有一个启动区域和其他为转录一段密码序列所必需的序列，而这一段密码序列了调又调节一个结构基因序列的转录。这些调节区域也已是人所周知的。用一般的技术可制备这种载体，如把噬菌体中的一段PreS1-PreS2-S蛋白编码序列嵌入到一个已含有复制子和调节区域的载体中，以使DNA分子与这个调节区域相连。人们选择的是能在酵母的酵母属中表达的载体和DNA分子连接。最好载体中包含的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列正是上述的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列。这些载体在插入功能DNA编码序列的过程中也十分有用，这段DNA的插入使该载体内含的结果PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列，得到表达。因此，这一发明方法也关系列一个重组DNA分子，它含有一段在噬菌体中与PreS1-PreS2-S蛋白编码序列的PreS1区域融合的功能DNA编码序列，从而使这段功能DNA序列要么构成PreS1区域的一个插入区，要么取代部分PreS1区域，可能还要取代PreS2-S区域的一部分，所以，这一发明也涉及含有这种重组DNA分子的载体。例如，见下述实例21A。所谓“功能DNA编码序列”是指一段DNA编码序列，当它在噬菌体中与PreS1-PreS2-S蛋白编码序列中PreS1区域融合时，并不涉及，也不妨碍HBsAg粒子的装配。经选择的功能DNA顺序包括(但不限于)这些疟原虫或任何免疫原性衍生的环孢体编码序列，HIV或任何免疫原性衍生的包膜基因编码序列，尤其是象后面要举出的C7肽、肽121或Dreesmas肽的编码序列，或来自其他感兴趣的病毒中肽的编码序列，特别是来自其他宿主中的为外壳蛋白或表面蛋白编码的序列。
本发明也涉及到用这种重组载体转化酵母宿主细胞和制备这种转化宿主的方法。常规技术即可进行这一转化。选用的酵母细胞也包括酵母菌属，特别是属于啤酒酵母种的。
该发明还关系列一种由PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列所编码的蛋白质的制备，在这发明中，包括了在一种适当的培养基上培养转化后的宿主细胞，从宿主细胞培养液或细胞溶化物中分离该蛋白质，或者根据宿主细胞能分泌该蛋白质的性质来提取这种蛋白质。所谓的“适当的培养基”是指它能使转化后的宿主生长，也能使宿主表达一段PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或以可取得的量表达PreS1-功能DNA编码序列一PreS2-S蛋白编码序列的产物。应意识到，用这种技术，采用的适当的培养基应依赖于将使用的宿主。用普通的蛋白质分离技术即可从细胞溶化物或寄主培养液中分离PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA编码序列一PreS2-S蛋白。由此发明方法制备的蛋白质，由于其宿主细胞的糖基化作用，可能是带糖基的。如果需要去糖基的蛋白质，就应这样制备用一种糖基化作用失效的宿主细胞，或在进行前述步骤前，在蛋白质编码序列上采用一般的特异性点突变方法，如Botstein等《科学》上的方法(Botsteinetal.Science，229，1193-1201(1985))。
此发明还涉及一种疫苗，它含有由该发明生产出的大量免疫保护性的PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白。由一般的技术可制得该疫苗。
本发明也与制备一种杂种粒子的方法有关，这种粒子含有由PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列所编码的蛋白质，该法中包括在合适的培养基上培养转化后的酵母宿主细胞，从宿主细胞培养液或细胞溶化物中分离粒子，或根据转化后的宿主细胞能分泌这种粒子的性质来提取它。所谓“适合的培养基”是指转化后的宿主能生长的培养基，它也能使PreS1-PreS2-S蛋白编码序列或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白编码序列以粒子形式，以可提取的量表达。应注意，采用这些方法之一时，所用的合适的培养基要依赖于使用的宿主细胞。用一般的分离技术即可从培养的溶化物或宿主培养液中分离得粒子。
本发明还与含有粒子的一种疫苗有关。这种疫苗含有大量具免疫保护性的粒子，这种粒子可由常规技术制得。更好的是，这种疫苗含有胶团，即包括粒子和多价吸附剂的胶团。选择的多价吸附剂在这种胶团中含量为每100μg蛋白质有5-50μg多价吸附剂。胶团的制备法可见欧洲专利申请公布No.0199698。
在该发明中的疫苗里，PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白或粒子的水溶液，可在选择的生理pH缓冲条件下直接使用。另一方法是，众多已知的佐剂中，任何一种都可吸附或与蛋白质粒了混合，这些佐剂包括氢氧化铝及其他物质。
疫苗的制备方法见“疫苗的新动向与发展”中，由Voller等主编，1978年，美国马里兰州巴尔的摩，UniversityPark出版社出版。例如脂质体的包膜见于美国专利4，235，877，Fullerton著述，蛋白质与大分子的结合，见于美国专利4，372，945，Likhite著述，美国专利4，474，757，Armor著述。
每一疫苗剂量中PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白的含量被选定为在典型疫苗中不出现明显的、相反的副作用，而又诱导免疫保护应答的蛋白含量。由于采用的特异性免疫原不同以及疫苗中是否加入佐剂，这一蛋白含量也将随之而变。一般地，人们希望每一疫苗剂量中含1-1000μg蛋白质，1-200μg更好。对一种特定的疫苗，可用标准方法来确定上述最佳含量，这些方法包括对接受试验者的抗原效价及其他反应的观察。起始接种后，在大约四周内要有选择性地加强接受试验者的疫苗剂量，只要感染的可能性还存在，这之后每六个月还要重复地加强疫苗剂量。
使用佐剂，如明矾(但不限于此)，可增强对PreS1-PreS2-S蛋白或PreS1-功能DNA编码序列-PreS2-S蛋白或粒子的免疫应答。
实例以下为此发明的实例，它是解释性的，但不限于此。
所有百分比为重量百分比，所用温度采用摄氏温标。
DNA操作处理中使用的酶由BethesdaResearch实验室、NewEnglandBiolabs和/或Boehringer得来，按提供者的说明操作使用。
酵母生长培养基选择培养基YNB(不含氨基酸的)酵母氮源(Difco实验室)，0.675%(W/V)，含2%(W/V)葡萄糖。
YEPD培养基1%(W/V)酵母浸汁，2%(W/V)胨，2%(W/V)葡萄糖。
DNA重组方法在《分子克隆》(“MollecularCloning”)中有叙述，T.Maniatis等，冷泉港实验室(1982)ColdSpringHarborLab.(1982)。
PMSF苯甲基氟化磺酰。
以下为可能用到的缩略语PBS磷酸盐缓冲液(每升)(pH7.4)8.0克NaCl
0.2克KCl1.15克Na2HPO40.2克KH2PO40.1克CaCl20.1克MgCl2·6H2OBSA牛血清清蛋白(A4378·Sigma)X-gal5-溴-4-氯吲哚-β-D-半乳吡喃糖苷密苏里州，圣路易斯Sigma化学公司生产的商业用品。
L-肉汤(每升)10克胰蛋白胨5克NaCl5克酵母浸汁1毫升0.1M MgSO4灭菌后加入无菌硫胺素(1mg/ml)5毫升。
要制成固体培养基，则每升中再加15克琼脂。
实例1质粒pRIT10167的构建起始物是一段含有长度为2.1KbHindⅢ的酵母DNA片段的质粒p6Y，这段DNA编码克隆pBR322上的TOB3基因。Bolivar等对pBR322已有描述(Gene，2，95-113，1977)。p6Y质粒由Musti等构建和特征化，从NationalInstituteofHealth的M.Rosenberg博士处得到该质粒。HindⅢ片段再次克隆到一个pBR322衍生物上，在该衍生物中，EcoRⅠ位点被破坏而得到质粒pRIT10164(非本质性的变动)。以下的操作都是为了制造出一个位于TDH3编码顺序的ATG密码中碱基G处的BamHⅠ位点，还要得到一段具有TDH3启动子活性的HindⅢ-BamHⅠDNA片段，此片段上的活性完整，不为操作过程而变化。如上述方法制得的pRIT10164DNA，经两次CsCl-溴乙锭密度梯度离心纯化，基本原理由Kahn等描述(MethodsinEnzymology，68，268，1979)。用75个单位的核酸内切酶XbaⅠ完全消化150μgpRIT10164DNA，用酚-醚提取，以乙醇沉淀，然后，以1μg/μl的浓度再悬浮于0.01M的二吡喃硫胺素-HCl缓冲液中。
用核酸酶Bal 31消化经上述XbaⅠ处理的20μg DNA样品，可以切除ATG密码与XbaⅠ位点之间的61对DNA碱基对。Bal 31的消化作用在如下条件进行30℃，1-3分钟，在含600mM NaCl，12mM CaCl2，12mM MgCl2，1mM EDTA，20mM二吡喃硫胺素-HCl，pH3.1的缓冲液中进行，在200μl的反应终体积内，每20μg DNA用1个单位的Bal 31核酸酶。
加入EGTA(乙二醇双乙胺醚-N，N′-四乙酸)，使其终浓度为20mM，以中止酶反应，样品用等体积的酚、醚提取，用乙醇沉淀。每一DNA样品又悬浮于20μl10mM，pH7.5的二吡喃硫胺素-HCl缓冲液中。
Bal31的酶解程度可这样测定用核酸内切酶HpaⅠ消化约2.5μg每一DNA样品，将HpaⅠ-XbaⅠ片段的大小与来源于pRIT10164的335bp长的HpaⅠ-XbaⅠ片段作一比较。人们发现用Bal31进行的2分钟酶解可切掉pRIT10164的XbaⅠ-HpaⅠ片段上约41-88个核苷酸。
上述结果表明从XbaⅠ朝向ATP密码的另一端也有相同数目的碱基对被切除。5μg经2分钟Bal 31酶解后回收的DNA用核酸内切酶BamHⅠ消化，以酚提取，用乙醇沉降回收。在三磷酸脱氧核糖核苷酸存在下，用5个单位的T4多聚酶处理这个DNA使BamHⅠ及任何Bal 31的单股端填满并使之末端补齐，然后用酚提取，以乙醇沉降回收。用5个单位的T4DNA连接酶处理2.3μg这种DNA，其中一半的连接混合物用于转化大肠杆菌K12菌株MM294的感受态细胞，这种感受态细胞按照Cohen等方法制备(proc.Natl.Acad.Sci.69，2110，1972)。把1毫升转化后的大肠杆菌菌体稀释在含200μg/ml氨苄青霉素的350ml L-肉汤中，整个质粒DNA从最终培养物中提纯。
80μg上述质粒DNA，它含有大量经Bal31去除约40-80个碱基对的质粒分子，先后进行如下酶解每75个单位的核酸内切酶HindⅢ消化，用96个单位的核酸内切酶BamHⅠ从那些质粒上释放DNA片段，即那些经上述处理后又重产生BamHⅠ位点的质粒，也就是说，在Bal31消化的G残基末端。这个DNA酶解物在1%制备琼脂凝胶上电泳走带，将需要的HindⅢ-BamHⅠ片段从凝胶上割上，根据片段大小1100-1000bp，将其切成两段，一段代表1070bpDNA，另一段为1030bp的DNA。两段琼脂凝胶经冷冻和解冻循环，再以高速离心沉淀琼脂，即可回收DNA。上述的上清液通过一个微孔GVMillex过滤器过滤，经两次乙醇沉降回收DNA，再把DNA悬浮于20μl0.01MpH7.5的二吡喃硫胺素-HCl缓冲液中。
琼脂凝胶电泳分析方法，与pRIT10164DNA的HindⅢ和XbaⅠ酶解物的比较，与入噬菌体DNA的HindⅢ和EcoRⅠ酶解片段的比较，都表明得到了两个独特的HindⅢ-BamHⅠ片段的类群，估计一个大小为1070bp，一个大小为1030bp(与长度为1120bp、来源于pRIT10164的亲本HindⅢ-XbaⅠ片段相比)。约100ng的长为1030bpHindⅢ-BamHⅠ片段的类群与200ng质粒pUC9连接，后者已经核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶解、经碱性磷酸酶处理(见Shine，U.S.PatentNo.4，264，731)，连接的混合物用于转化大肠杆菌菌株JM103的感受态细胞，该细胞经选择为氨苄青霉素抗性的。进行有效的大肠杆菌菌株JM103的转化可根据Cohen等在前面举出的方法。
pUC9载体质粒和受体大肠杆菌菌株JM103均已由Vieira和Messing在“基因”(Gene，19，259，1982)中描述过，从J.Messing(Univ.ofMinnesota)处获得。pUC9载体作为商品可从Amersham(Buckinghamshire，UnitedKingdom)和Pharmacia(Uppsala，Sweden)得到，大肠杆菌菌株JM103可从J.Messing(univ.ofMinnesota)得到。另一种具有大肠杆菌JM103特征的大肠杆菌菌株，即JM101，可从美国典型菌种保藏所(AmericanTpyeCultureCollection)，Rockville，Maryland)登记号ATCC33876获得，它也能作为宿主用。在含有X-gal的培养基上，从98个试验菌落里大约可得到每毫升400个氨苄青霉素抗性菌落。95个菌落为白色，表明在载体的HindⅢ和BamHⅠ位点之间成功地插入了一个外来DNA片段。
在生长培养基中加入壮观霉素(150μg/ml)以放大质粒，然后，通过一个小样操作步骤BirnboimandDoly，Nucl.Acid.Res.，7，1513，1979)，就可制备来源于单个转化菌落的质粒。
重组质粒经核酸内切酶AVaⅡ和BamHⅠ双重酶解后，在7.5%丙烯酰胺凝胶上分析，与含有pRIT10164的启动子-N-末端区域的AvaⅡXbaⅠ片段相比较，还与pBR322DNA的HpaⅡ酶解片段比较。与pRIT10164相比时，在检验的36个质粒中，有35个里面存在一个AvaⅡ-BamHⅠ片段，相当于20-90个被切除的碱基对。选择三种代表切掉了80个碱基对(pRIT10166)、50个碱基对(pRIT10167-表8)和45个碱基对(pRIT10165)的质粒进行更深入的研究。质粒DNA由CsCl-溴乙锭密度梯度离心制备，25μg每种质粒DNA都用EcoRⅠ酶解。EcoRⅠ酶解末端用r-32P-ATP标记，方法为采用Maxam和Gilbert的化学修饰法(Methods in Enzymology，65，499，1980)，变换激酶作用和每一质粒的HindⅢ-EcoRⅠ片段上的核苷酸序列。在每个重组质粒中pUC9载体部分标记和排列EcoRⅠ位点是确定邻近BamHⅠ位点周围序列的简便方法，这一位点标志着TDH3DNA片段上的切除末端。这一序列分析表明，在质粒pRIT10166中，位于ATG密码以上25个碱基对的5′一端非翻译区域内的G残基处，又产生了BamHⅠ位点;在pRIT10165中，BamHⅠ位点处于第三个密码的第二个碱基处;在pRIT10167中，BamHⅠ位点处于ATG密码的G残基处。
因此，在pRIT10167上构建的TDH3DNA的HindⅢ-BamHⅠ片段含有所有TDH3启动子活性所必需的序列，这一序列并未改变。
实例2载体pRIT10172的构建照实例1的方法制得的1050bpHindⅢ-BamHⅠ TDH 3 DNA插入段(来自pRIT10167)，再克隆于穿梭载体YEP 13上，Broach等描述(Gene，8，121，1979)，是在载体的2微米长DNA部分的HindⅢ位点与BamHⅠ位点间克隆的，从而得到重组质粒pRIT12159。然后，用核酸内切酶XbaⅠ和BamHⅠ消化pRIT12159 DNA，得到的1650bp片段代替与之相似的含arg3启动子的XbaⅠ-BamHⅠ片段，而连结到质粒pRIT10774上。质粒pRIT10774由Cabezon等描述(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.，81，6594-6598，1986)，它包含有YEP 13复制子，已用体外方法从此复制子上切掉了天然载体的BamHⅠ和XhoⅠ位点，也含有包括arg3启动子区域的一段1470bpHindⅢ-BamHⅠ插入段，还含有一段包括arg3转录终止区域的1150bpBamHⅠ-HindⅢ片段。由于TDH3启动子插入段代替了pRIT10774上的arg3启动子插入段，从而使得到的质粒pRIT10174含有一个单独的BamHⅠ位点，这一位点位于TDH3启动子插入段的ATG密码处，同时，在1150bpBamHⅠ-HindⅢarg3DNA片段上，它为转录终止预先提供了功能信号。因此，外来DNA可在此位点被克隆。此外，这两个DNA插入段被HindⅢ位点包围。就使得表达独立部分(盒)可以移动，它作为一个2200bpHindⅢ片段，能插入其他载体中。图9是pRIT10172的一个限制性核酸内切酶的裂解图。
实例3pRIT12290的构建照实例1的方法从-pRIT10167(图8)制得的1050bpHindⅢ-EcoRⅠ片段，它含有HindⅢ-BamHⅠ TDH3启动子片段和pUC9多连接物中的BamHⅠ-SmaⅠ-EcoRⅠ部分，再被克隆于pBR322诱导质粒的HindⅢ和EcoRⅠ位点之间，而这一质粒已通过加入T4DNA多聚酶和再连接作用去除了BamHⅠ位点之后的部分。最终得到的重组质粒被定名为pRIT12176。
按下面的实例4(b)的方法制得的pRIT10158(图8)质粒DNA，用核酸内切酶EcoRⅠ消化，用T4DNA多聚酶处理，从而可填补EcoRⅠ单链延伸部分。这一制备物用核酸内切酶ClaⅠ进一步消化。pRIT10158 DNA的深入酶解样品以核酸内切酶ClaⅠ和HindⅢ消化，用制备琼脂凝胶电泳和洗脱就可得到一个具有arg3基因转录末端区域的1150bp Cla HaeⅢ片段。这一片段与经EcoRⅠ、T4DNA多聚酶、ClaⅠ处理的pRIT10158 DNA连结，连结混合物用于转化大肠杆菌(E.Coli)菌株MM294的感受细胞，用前述的Cohen等(Cohen等(Cohen et al)方法，使之成为氨苄青霉素抗性。从转化后的菌落里，可分离到一个定为pRIT10162的质粒，在这一质粒中，ClaⅠ-HaeⅢ arg3转录终止片段被插入pRIT10158的ClaⅠ和已插入的EcoRⅠ位点之间，同时，在这质粒上重建了EcoRⅠ位点。图8是一张说明pRIT10162制备的流程图。pRIT10162的质粒DNA用核酸内切酶EcoRⅠ和PstⅠ消化，与pRIT12176的质粒DNA(用上述方法制备，也以核酸内切酶EcoRⅠ和PstⅠ消化(混合)，连接起来的混合物用于转化大肠杆菌K12菌株MM294的感受态细胞以得到氨苄青霉素抗性菌，如上举出的Cohen等的方法。从这一转化过程的菌落里可得到一个pRIT12208质粒，在此质粒中，来自pRIT10162的一个1930bp EcoRⅠ-PstⅠ的小片段已经连接在来自pRIT12176的一个4630bp EcoRⅠ-PstⅠ的大片段上，而且，arg3转录终止区域就与TDH3启动子并列排置在这个质粒中。arg3和TDH 3 DNA区域可以作为一个单个的2200bp片段被核酸内切酶HindⅢ从pRIT12208上酶切下来。考虑到载体的序列，为了得到另一方向的这一片段把pRIT12208的2200bp HindⅢ片段再克隆到一个pBR322衍生质粒的HindⅢ位点上，在此衍生质粒中，已通过加入T4DNA多聚酶和再连接作用分别切除了天然的EcoRⅠ和BamHⅠ位点。得到的这个质粒定为pRIT12290，它与pRIT12208相比，在载体序列的相反方向插入了2200bp的HindⅢ片段。图10为pRIT12290的一个限制性核酸内切酶的酶解图。在pRIT12208和pRIT12290载体中，TDH3启动子和arg3转录终止片段被专一性的BamHⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ的限制性位点分开，这些位点对于克隆具有密码序列的DNA片段十分有用，启动子和转录终止区域作为转移到其他载体上去的一个独立部分(盒)，可以一起从一个2000bpHindⅢ片段上切下来。
BamHⅠ位点尤其有用，因为它位于TDH3基因的ATG密码处，可以用于TDH3启动子和其他基因的融合，从而能在酵母中表达其他基因(如下面的实例)。用核酸内切酶HindⅢ消化酵母穿梭载体上的插入段，或者用其他限制性内切酶在插入段的侧面限制性位点上酶切，就能以盒或独立单位的形式从pRIT12208或pRIT12290衍生物上得到这种融合体。
实例4质粒pRIT10677，pRIT10909和pRIT10158的构建a)pRIT10677从pRIT10616(Harfordetal.，Dev.Biol.Standard，54，125-130，1983)上切下一段已克隆的HBVDNA的1372bpBamHⅠ片段，这一片段再与经核酸内切酶BamHⅠ消化过的pBR327DNA混合并连接。这一BamHⅠ片段具有一部分HBs抗原前体区域，以及HBs抗原编码序列和3′一端非编码序列。从连接混合物中，可以选到一个pRIT10677质粒，在该质粒中，HBVBamHⅠ片段插入载体的BamHⅠ位点，其插入方向正是为了使HBVDNA中的XbaⅠ位点邻接于pBR327载体的SaLⅠ位点。图8是说明pRIT10677制备的流程图。
b)pRIT10909来自质粒pMC200〔从美国典型菌种保藏所获得，登记号为ATCC39131，无限制〕的3300bpHindⅢ片段(Crabed M et al描述，EMBO J.，2，205-212，1983)，再被克隆到pBR322衍生质粒上，在这一质粒中，通过加入T4DNA多聚酶和再连接作用已切除了天然的EcoRⅠ位点。选出得到的重组质粒pRIT10158(图8)，在此重组质粒中，HindⅢarg3基因插入段具有arg3基因的区域，这一区域又相邻于修饰过的pBR322载体上的ClaⅠ位点。由pRIT10158可获得一个1150bp的ClaⅠ-HaeⅢ片段，它带有arg基因的转录终止区域。这个1150bp的片段又与经内切酶ClaⅠ和HpaⅠ消化过的质粒pRIT10677连接(如上述a)部分中制备法)，使得在HBsAg密码区以下的HpaⅠ位点处的arg3终止区域可被融合。最终的质粒是pRIT10909。图8是一张说明pRIT10909制备法的流程图。图3是pMC200的限制性核酸内切酶和酶解图。
实例5质粒pRIT10911及pRIT10912的构建pRIT10167(实例1)上的BamHⅠ位点以及HBsAg基因前体区域中的天然BamHⅠ位点(HBsAg基因来自克隆在pRIT10616上的adw血清型HBV病毒-Harford et al.，Dev.Biol.Standard，54，125-130，1983)都位于同一翻译阅读框内，使得提供ATP密码的TDH启动子片段与HBsAg前体序列的42个密码融合，而这段序列又位于HBsAg编码顺序自身的226个密码之前。这一融合的HBV DNA片段来自质粒pRIT10909(见上面实例4，b))，该质粒含有一个编码部分HBsAg前体区域的935bp BamHⅠ HpaⅠ插入段，还含有完整的HBsAg编码顺序以及已被融合的128bp的3′非翻译DNA。在HpaⅠ位点之下，有一个来自pRIT10158的1150bp HaeⅢ-ClaⅢDNA片段，具有arg3转录终止区域。RIT10158已在上面实例4，B部分描述。从pRIT10909上切下2085bp的EcoRⅠ-BamHⅠ片段，再插入pRIT10167的EcoRⅠ和BamHⅠ位点之间(方法在A例中描述)，从而构建出质粒pRIT10911。来自pRIT10911(含酵母DNA转录信号和HBsAg编码序列)的3135bpHindⅢ片段则插入YEP13穿梭载体上，从而得到质粒pRIT10912。图8为说明pRIT10911制备方法的流程图。
实例6质粒pRIT10903和pRIT10914构建从一段至少编码了成熟HBsAg密码序列N末端部分的DNA片段的5′末端，去掉其多余的核苷酸，是下述构建工作的目的，从而可在第二个密码的第一个碱基处造出一个6个碱基对的限制性位点。然后，将得到的片段与启动子片段融合，在得到的片段上，其起始密码处带有6个碱基对的限制性位点，用录豆或S1核酸酶切去单链延伸部分，选出连接所需要的钝末端。如Rosenberg等述，“酶学方法”(MethodsinEnzymology，101C，123(1983))。
来自pRIT10616编码HBsAg基因的HBV DNA上1225bp FunDⅡ片段(见Harford et al.(1983)Devel.Biol.Standard.，54，125-130)，从该质粒上切下，与人工合成的八聚体EcoRⅠ连接体相连，然后再克隆到载体pACYC184的EcoRⅠ位点上，得到pRIT10679(图8)。载体pACYC184从S.Cohen处得到，Chang A.C.Y.和Cohen S.(1978)描述过，“细菌学杂志”(J.Bacteriol.，134，1141-1156)。pACYC184也可从美国典型菌种保藏所登记号ATCC37033)获得。从这个EcoRⅠ(FunDⅡ)片段，可得到一个125bp的EcoRⅠ-XbaⅠ片段，这一片段包括HBsAg前体的C-端区域、HBsAg的ATG密码以及90bp的HBsAg编码序列。这一125bp的EcoRⅠ-XbaⅠ片段被插入pRIT10158的EcoRⅠ和XbaⅠ位点。(见上面实例4(b))。得到的质粒pRIT10903含有一个单个的EcoRⅠ位点，这一位点处于arg3DNA和HBV DNA的连接处，该质粒还含有一个单个的XhoⅠ位点，这位点在arg启动子区域内。图8是一个说明pRIT10903制备法的流程图。
用CsCl-溴乙锭密度梯度离心制备pRIT10903质粒DNA，用80单位的EcoRⅠ核酸内切酶消化150μg这个质粒，用酚提取，乙醇沉降，再悬于pH7.51μg/μl的10mM二吡喃硫胺素-HCl缓冲液中。DNA分为3个50μg样品，在30℃下以核酸酶Bal31温育50、75和90秒。每一反应混合物含有实例1举出的同样的反应缓冲液，还含50μgEcoRⅠ酶解过的pRIT10903DNA以及2.5个单位的Bal31核酸酶，最终体积为500μl。加入终浓度为20mM的EGTA终止反应，在冰上冷却，用等体积的酚提取，乙醇沉淀。每个Bal31处理过的DNA样品溶入50μl100mM二吡喃硫胺素-HCl缓冲液中，用核酸内切酶BstEⅡ消化2.5μgDNA，在7.5%丙烯酰胺凝胶上与经EcoRⅠ和BstⅡ核酸内切酶处理而释放出一个285bp片段的pRIT10903相比较。可以发现，在30℃下用Bal31核酸酶处理75秒能从这个EcoRⅠBstEⅡ片段上减少10-60碱基对，得到一系列不连续的带，代表切除DNA上的10、30、45及60个碱基对。从FunDⅡ原始位点切去29个碱基对将会去掉所有的HBsAg前体DNA和HBsAgATG密码。
5μg被Bal31处理75秒的pRIT10903DNA再用8个单位的核酸酶XhoⅠ消化，以酚提取，用乙醇沉淀。这个DNA再在三磷酸脱氧核苷酸存在下与5个单位的TDNA多聚酶温育，以便补上XhoⅠ和Bal31的末端，再以酚提取，以乙醇沉淀。然后把得到的DNA在16℃下与5个单个TDNA连接酶温育16小时，混合物用于转化大肠杆菌K12株系MM294的感受态细胞，以得到氨苄青霉素抗生菌，接上面举出的Cohen等的方法。平板培养后，可获得2000个氨苄青霉素抗性群落/毫升。用小样方法(见上面举出的Birnboinetal.)从47个单个菌落制备质粒，发现其中有23个保留了一个XhoⅠ位点，说明在原始XhoⅠ位点上的插入成功了，同时也成功地连接在一个以G残基为末端的3′端。这23个质粒进一步用核酸内切酶XhoⅠ和XbaⅠ消化，以便能在与pRIT10903的原始EcoRⅠ-XbaⅠ片段比较时，确定限制性小片段的大小。
一些质粒的确定，要切去25-40个碱基对。质粒pRIT10914，估计含有95-1000个碱基对的XhoⅠXbaⅠ片段，被选来进行深入研究。图8是说明pRIT10914制备法的流程图。这一质粒的DNA由CsCl-溴乙锭密度梯度离心法纯化，取25μg这种DNA，用140个单位的核酸内切酶XbaⅠ消化。
XbaⅠ末端被换成r-32P-ATP标记物，以15个单位的核酸内切酶HindⅢ酶解标记过的DNA。765bp的HindⅢ-XbaⅠ小片段用丙烯酰胺凝胶电泳和电洗脱分离出来，再用乙醇沉淀。用Maxam和Gilbert的化学修饰法(上面已举出)从标记的XbaⅠ末端排序，即可确定XhoⅠ位点处及其附近的核苷酸序列。排序数据表明XhoⅠ位点在HBsAg编码序列第二个密码的第一个碱基处。
XhoⅠCTCGAGAACHBsAg核苷酸因此，在切除了单链末端后，这一片段非常适合于与pRIT10167(实例1)上的TDH3启动子片段的BamHⅠ延伸部分融合。
实例7质粒pRIT12211、pRIT12209、pRIT12230及pRIT12265的构建实例1制备的质粒pRIT10911，被用作进一步操作的骨架。为了引入需要的限制性位点，用核酸内切酶BamHⅠ和XbaⅠ消化这个质粒，切下的片段被质粒pRIT10158(实例4)的一个2275bpBamHⅠ-XbaⅠ片段所代替。由此操作得到质粒pRIT12211，在此质粒中，HindⅢ-BamHⅠ TDH3启动子片段与BamHⅠ-XbaⅠ片段相邻，而后者又含有一个XhoⅠ位点，这一位点之后为一个XbaⅠ-HindⅢ片段，此片段又包括了HBsAg编码序列的C-末端区域和128bp的3′非编码DNA(该DNA已与1150bp arg3转录终止区域融合)。图8为一说明pRIT12211制备的流程图。用核酸内切酶XhoⅠ和XbaⅠ酶解质粒pRIT12211，可切去一个1600bp的片段，这一片段被经修饰过的HBsAg DNA(来自pRIT10914)上的94bp XhoⅠ XbaⅠ片段代替，如实例5所述方法。经XhoⅠ和XbaⅠ酶解过的pRIT10914 DNA先在丙烯酰胺凝胶上电泳纯化，然后电洗脱适当的凝胶块，用乙醇沉淀，即件的94bp的片段。
由于引入94bp片段(见图8)而得到的质粒pRIT12209，经CsCl-溴乙锭密度梯度离心，再用90个单个的内切酶BamHⅠ和60个单位的内切酶XhoⅠ消化50μg pRIT12209 DNA，就可切掉TDH3启动子和HBsAg编码区域间990bp的外来DNA，然后用酚提取，用乙醇沉淀。16μg的这种DNA在30℃下与20个单位的绿豆核酸酶(PL Bio-Chemicals)温育30分钟(总体积为125μl)。温育用缓冲液为30mM乙酸钠(pH4.6)、250mM NaCl、1mM ZnCl2和%5甘油。加入使终浓度达到0.2%的十二烷基硫酸钠以终止反应，用等体积的酚提取，再用乙醇沉降。经绿豆核酸酶处理的0.5μg的该等分样品在16℃下与2个单位的T4DNA连接酶温育16小时，再用2个单位的核酸内切酶BamHⅠ酶解以破坏任何残留的载体分子。得到的这一混合物用于转化大肠杆菌K12株系MM294的感受态细胞以选择氨苄青霉素抗性菌，根据上面的Cohen等方法，从转化混合物中可回收约2000个氨苄青霉素抗性菌落/毫升，采用小样方法(按上举出的Birnboin等方法)，从上述24个转化体的扩大培养中可制备质粒。
经核酸内切酶HindⅢ消化后，24个质粒中有16个释放出大小为2700bp(载体pUC9)和3000bp的两个DNA带。3000bp带正是HBsAg编码序列和arg末端区域与TDH3启动子片段融合所期望的长度的带。
四个候选质粒用于进一步的研究。每一质粒DNA用核酸内切酶XbaⅠ消化，用交换激活作用标记上r-32P-ATP，再用核酸内切酶HindⅢ消化，用丙烯酰胺凝胶电泳和电洗脱分离标记过的1190bpHindⅢ-XbaⅠ片段，再以乙醇沉淀。每个片段的顺序用上面举出的Maxam及Gilbert化学修饰法确定。发现有2个质粒具有正确的ATGGAGAAC序列，这一序列使TDH3启动子区域与HBsAg基因理想地融合。上述质粒之一，即质粒pRIT12230，被用于进一步操作。图8是说明pRIT12230制备法的流程图。将质粒pRIT12230的DNA用核酸内切酶HindⅢ消化，含有与TDH3启动子融合的HBsAg编码序列的3000bp片段被连接在穿梭载体YEP13上。用Ito等的转化方法(J.Bact.，153，163，(1983))将得到的质粒pRIT12265转化到酵母株系DC5上(MATa，Leu2-3，LeU2-112，his3，can1-11)〔从J.Broach(StateUniversityofN.Y.StonyBrook)处得到〕，这一菌株也可从美国典型菌种保藏所获得，登记号ATCC20630)。
实例8质粒pRIT12288、pRIT12322的构建质粒pRIT12230(实例7)上的结构包括128bp非编码HBVDNA，这个DNA位于HBsAg结构基因终止密码的3′下端。
要切除这段128bp的DNA，就需用核酸内切酶AccⅠ和EcoRⅠ来消化约25μG的pRIT12230，照实例1方法。pRIT12230含有一个单个的AccⅠ位点，这一位点在S-基因编码序列处，即TAA终止密码前7个核苷酸处。酶解后的DNA在1%琼脂凝胶上电泳，较大的4200bp片段通过电洗脱凝胶和用乙醇沉淀回收得到。
合成具有如下序列的12个和14个核苷酸链的人工DNA连接体分子以插入在pRIT12330的AccⅠ和EcoRⅠ位点之间5′ATACATTTAACG3′12个核苷酸3′TGTAAATTGCTTAA5′14个核苷酸这样就会恢复正确的C-末端HBsAg密码、TAA终止密码，同时，为了增加转录终止片段，还提供了一个在TDH3启动子或HBsAg编码序列的其他位置所没有EcoRⅠ位点。
100微微克分子合成的12个核苷酸单链与100微微克分子合成的14个核苷酸单链混合一起，终体积达到10-20μl，在70℃下加热15分钟，3小时后缓慢恢复到室温，使两条链沿其互补序列退火。退火后的混合物中加入约0.15微微克分子(400ng)pRIT12230的4200bp AccⅠ-EcoRⅠ片段，还加入10倍浓度的连接缓冲液以及2个单位的T4DNA连接酶。
这一混合物在16℃温育4小时，再加入2个单个的TDNA连接酶，再置冰上过夜。连接后的混合物用于转化菌株MM294的感受态细胞以得到氨苄青霉素抗性菌，照Cohen等方法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，69，2110，1972)。用Birnboim和Doly(Nucl.Acids.Res.，7，1513，1979)的快速方法从12个或更多的单个菌落制备质粒，用限制性核酸内切酶分析法来检验。带有AccⅠ插入EcoRⅠ连接体片段的质粒，在用AccⅠ或EcoRⅠ酶解时，会显示出一个4200bp的DNA带。用Maxam和Gilbert的化学修饰法(MethodsinEnzymology，65，499，1980)从EcoRⅠ或AccⅠ位点进行DNA序列分析，就可检验连接体插入该质粒的正确性。
为了得到一个转录终止片段，就得用EcoRⅠ内切酶和碱性磷酸酯酶(ShineJ.U.S.Patent4，264，731)处理带有AccⅠ-EcoRⅠ连接体插入段的质粒(前面所述)。pRIT10162的2650bpHindⅢ片段(实例3制得)再被克隆到pBR327载体质粒的HindⅢ位点上，构成质粒pRIT12288。pBR327已由Soberon等描述(Gene.，9，287-305，1980)，可以用下述实例10、b部分的方法从质粒pRIT12309制得，pRIT12309可从美国典型菌种保藏所，登记号ATCC67187(AmericanTypeCultureCollection)获得。图8为表明pRIT12288构建过程的流程图。
pRIT12288上的HindⅢ片段与arg3转录终止区域邻接，这一区域具有约一半的pBR327上的EcoRⅠ和ClaⅠ限制性位点。从pRIT12288得到一个1180bp的EcoRⅠ片段，它带有arg3转录终止区域。这一片段与经EcoRⅠ消化、碱性磷酸酯酶处理的pRIT12230衍生物(如上所述)连接，还要检验由连接混合物得来的质粒中1180bp EcoRⅠ片段的插入情况和方向性。用内切酶HindⅢ消化质粒可得知插入段的方向性，如果是所需要的方向，就会释放出2880和2720bp的片段。
在构建的质粒pRIT12322中，AccⅠ-EcoRⅠ连接体取代了128bp不需要的HBVDNA，在此质粒上，来自pRIT12288的1180bpEcoRⅠ片段以理想的方向性存在，即位于HBsAg编码序列以下。从pRIT12322上可切下一个2900bp的HindⅢ片段，该片段具有合成HBsAg的独立表达部分，包括THD3启动子，HBsAg编码序列以及arg转录终止区域。图8是表示pRIT12322构建方法的流程图。见图11，是pRIT12232的限制性核酸内切酶解图。表明了上面哪些部分来自pRIT12288和pRIT12230。
实例9质粒pRIT12329的构建如上述实例8，pRIT12322含有一个2900bp的HindⅢ片段，该片段具有来自TDH3启动子的为HBsAg表达必需的所有信号。这一段独立部分连接在一个穿梭载体中用来引入酵母细胞里。用核酸内切酶HindⅢ和碱性磷酸酯酶消化穿梭载体YEP13的DNA，这个DNA用工作HindⅢ片段(来自pRIT12322)插入的受体。(pRIT12322的制备在实例8中已述)由此分离出质粒pRIT12329，它具有YEP13复制子和2900bp的HindⅢ独立片段(实例8描述)。
实例10为杂种抗原HBsAg-CS在酵母中表达的质粒载体构建A.质粒pRIT12573和pRIT12574的构建从WalterReedArmyInstituteofResearch获得质粒WR301。它是一段长2.3Kb的EcoRⅠ片段插入载体pUC8构成的，它上面的这一段来自λmPf1(Dame等，Science，225，593-599，1984)，λmPf1编码恶性疟原虫的完整的环状体蛋白质基因。图2A表明了克隆λmPf1的限制性系列图和排序方式。图中限制性酶切位点的位置由序列分析和酶解方法来确定和证实A，AvaⅡ;Ac，AccⅠ;B，BstnⅠ;D，DraⅠ;Dd，DdeⅠ;F，FokⅠ;N，NdeⅠ;R，RsaⅠ;S，StuⅠ;T，TthⅢ;Tq，TaqⅠ;X，XhoⅡ。箭头表示确定出的原点、方向以及序列的范围。cs蛋白质编码基因用一条粗线表示。图3A显示恶性疟原虫来源的cs蛋白基因的核苷酸序列。λmPf1中的cs蛋白基因的核苷酸序列也表示出来了。载体pUC8由Vieria等描述(Gene，19，259，1982)。pUC8作为商品可从Amersham和Pharmacia得到。带有cs蛋白编码序列(除去开始的52bp)、(图12)来自质粒WR201的一个1215bp的StuⅠ-RsaⅠ片段经电洗脱，从7.5%聚丙烯酰胺电泳凝胶上纯化出来。这一片段再经Sau3A酶解产生较小的片段，这些小片段包括为cs蛋白的16个重复四肽编码的192bpSau3A片段，三个相同的为cs蛋白2个重复四肽编码的24bpSau3A片段。
质粒pRIT10911(实例5方法制备)是带有一个3136bp的HindⅢ盒的pUC9衍生物，它含有一个1050bpHindⅢ-BamHⅠ酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH3)启动子片段(提供ATG)，这一片段在BamHⅠ位点与HBV DNA的一个935bp BamHⅠ-HpaⅠ片段融合，而后者又编码Pre-S2区域C-端的42个氨基酸以及3′一非编码DNA的128bp和S基因(血清型adw)的226个氨基酸。S基因处于带有arg3转录终止子的1150bp酵母DNA片段旁边。pUC9已被Vieria等描述(Gene，19，259-268，1982)。位于ATG起始密码处的pRIT10911 BamHⅠ位点与恶性疟原虫的cs重复性抗原决定簇上Sau3A位点处于同一位段。质粒pRIT10911的DNA经核酸内切酶BamHⅠ消化和碱性磷酸酯酶处理后，用酚提取，乙醇沉降回收。取0.2μg这种DNA与0.2μg经Sau3A消化的StuⅠ-RsaⅠ cs基因片段(如上法制备)混合，用T4DNA连接酶处理，连接混合物用于转化大肠杆菌K12株系MM294的感受态细胞(Cohen et al.Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，69，2110，1972)。在生长培养基内加入壮观霉素(300μg/ml)使质粒扩增，然后采用一种小样方法(Birnboim et al.Nucleic Acids Research，7，1513，1979)从单个的转化群落中得到32个质粒。重组质粒经核酸内切酶BamHⅠ和XbaⅠ的两次酶切后，在7.5%丙烯酰胺电泳凝胶上分析，与pRIT10911(含Pre S2区域前体的初始42个氨基酸编码序列和HBsAg区域起始部分)的219bp BamHⅠ-XbaⅠ片段，也与HaeⅢ酶切过的φX174DNA片段比较。
在这32个质粒中，一个重组质粒显示出有一个411bpBamHⅠXbaⅠ片段，这一段相当于正确取向的192bpSau3A插入段，它被定为pRIT12572。另一重组质粒表明具在一个243bp的BamHⅠ-XbaⅠ片段，它相当于正确取向的24bpSau3A插入段，被定为pRIT12571。图12为说明pRIT12571和pRIT12572制备法的流程图。
pRIT12572和pRIT12571的HindⅢ片段，它含有TDH3启动子，cs-HBsAg杂种编码序列以及arg3终止区域，它们被克隆到YEP13上，分别得到质粒pRIT12574和pRIT12573(图12)。YEp13由Broach等描述(Gene，8，121-133，1979)。图12为说明pRIT12573和pRIT12574制备的流程图。
通过转化乙酸锂处理过的细胞(Itoetal.J.Bacteriol.153，163-168，1983)、选择亮氨酸非依赖型、可将质粒pRIT10912、pRIT12574和pRIT12573引入啤酒酵母株系DC-5(a，Leu2-3，Leu2-112，his3can1-11)和啤酒酵母株系10S44C(pep4-3，Leu2-3，Leu2-112)中，这些菌株来自M.Crabeel(CeriaInstitute，Anderlecht，Belgium)(见Cabezon，T.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6594-6598，1984)。酵母菌株DC5按1982年6月2日“布达佩斯条约”(BudapestTreaty)规定存放于美国典型菌种保藏所，登记号ATCC20819。酵母菌株10S44C根据1986年8月18日“布达佩斯条约”规定存放于美国典型菌种保藏所，登记号ATCC20819。可以预言，所期望的pRIT12573杂种蛋白质含277个氨基酸，对pRIT12574来说，杂种蛋白质含有333个氨基酸。
在上面得到的载体上加入或扩大cs抗原决定簇区也同样可能。例如，在质粒pRIT12572和pRIT12571上，多出的cs蛋白DNASau3A片段，如192bp或24bp的Sau3A片段，可以下法连接到BamHⅠ位点上用核酸内切酶BamHⅠ和碱性磷酸酯酶处理pRIT12572或pRIT12571的质粒DNA。质粒WR201(如上法制得)的1215bpStuⅠ-RsaⅠ片段经核酸内切酶Sau3A消化后，释放出带有重复四肽的192bp和24bp的片段。这些片段再与经BamHⅠ和碱性磷酸酯酶处理过的pRIT12572或pRIT12571载体混合，再用TDNA连接酶处理得到的混合物，用常规方法转化到大肠杆菌K12细胞中，选择氨苄青霉素抗性菌。从转化后的菌落得到的质粒用核酸内切酶消化以检查BamHⅠ-XbaⅠ片段的大小，与经同样酶解的pRIT12572或pRIT12571的DNA比较，尤其要与pRIT12572和pRIT12571中的411bp和243bp的BamHⅠ-XbaⅠ片段比较，它们带有cs重复段和部分PreS2-S编码序列之间的融合物。这些片段上增加192bp或24bp说明一个重复四肽插入了pRIT12572和pRIT12571上的BamHⅠ位点。这些质粒上存在着一个BamHⅠ位点，表明192bp或24bpSau3A片段以正确方向插入，在ATG密码处融合。若需要进一步引入编码cs重复四肽的192bp或24bpSau3A片段，在杂种粒子上延长cs四肽区域，也可以重复上述步骤。正如前面所述，来自pRIT12572或pRIT12571(带有表达独立部分或盒)这种衍生物的HindⅢ片段，可被切下来，插入YEp13或其他合适的酵母克隆载体中，用常规技术引入酵母细胞。
(B)pRIT12309、pRIT12314的结构，含有酵母中完整的2微米DNA序列的表达穿梭载体pRIT12377的构建质粒pRIT12309含有来自酵母、克隆于质粒载体pBR327的EcoRⅠ位点上的完整的6318bp2微米长DNA序列。这一段6318bp2微米长的DNA序列来自质粒pCV19(该质粒从J.Broach，PrincetonUniversity，NJ.获得)。1986年8月18日，质粒pRIT12309被存放在美国典型菌种保藏所的大肠杆菌K12MM924菌株中，这是根据布达佩斯条约的规定，这个菌的登记号为ATCC67187。图13是pRIT12309的核酸限制内切酶图。在这个分子上有两个EcoRⅠ位点，通过其中的一个插入2μDNA序列的pBR327，以阻断2μA编码区，结果杂种分子pRIT12309对A基因功能无效，这就是所谓的FLP功能。关于2μ结构和功能参看下列文献。(TheMolecularBiologyoftheyeastSaccharomycesLifecycleandInheritancePP.445-470.StrathernJ.N.，JonesE.W.andBroachJ.R.(Eds)，ColdSpringHarborLaboratory，NewYork，1981)。
Soberon等(Gene，9，287-305，1980)描述了质粒pBR327，并从F.Bolivar(DepartmentofMolecularBiology，NationalUniversityofMexico，Mexico20DF)那里得到了这个质粒。对熟悉这项工作的人来说用任何一种常规的方法都可以从存放在美国典型菌种保藏所的大肠杆菌K12即ATCC67187菌株制备pRIT12309质粒DNA，再从质粒pRIT12309复原pBR327。方法如下用EcoRⅠ核酸限制性内切酶消化这种DNA，再用联结混合物将DNA消化物和转化感受细胞大肠杆菌K12细肠联结，使其抗氨卡青霉素或四环素。有相当数量的转化体菌落将含有质粒，在质粒中只有pRIT12309的pBR327部份，而不具有任何2μDNA片段。
从质粒pRIT12290(实例3中描述过)得到一个2850bp ClaⅠ-SalⅠ片段，该片段含有TDH3-arg3表达盒和侧翼pBR322顺序，将该片段再克隆到Cla和Sal位点之间的pRIT12309载体上。将得到的质粒pRIT12314用SalⅠ核酸限制性内切酶消化，并与来自含有酵母Leu2基因的YEp13的2218bp SalⅠ-XhoⅠ片段联结。图14是制备pRIT12314的程序表。YEp13可以从美国典型菌种保藏所得到，其登记号为ATCC37115。用联结混合物转化JA221菌株的感受细胞，JA221菌株的感受细胞是用Cohen等的方法(见上述)制备的，转化使之不需要亮氨酸，但抗氨卡青霉素。
JA221菌株可以公开买到，也可以从M.Rosenberg，SmithKline和FrenchLaboratoriesInc.Philadelphia得到，也可以从美国典型菌种保藏所得到，其登记号为ATCC33875。
质粒pRIT12544是从这个转化作用中形成的一个菌落得到的，在转化中有一段2218bpSalⅠ-XhoⅠLEU2基因片段被插入质粒pRIT12314的SalⅠ位点上。这种插入倾向于在靠近TDH3-arg表达盒一侧创造一个SalⅠ位点。质粒pRIT12544是一种大肠杆菌-酵母穿梭载体。这种载体具有单一的BamHⅠ和SmaⅠ位点，这些位点位于TDH3启动区和arg3转录末端区之间，这里很适合插入DNA编码序列以完成它们从启动区开始的表达。图14是制备pRIT12544的程序表。
(c)质粒pRIT12658的构建按照实例10、A部份所描述的方法制备YEp13的衍生物，pRIT12574的一段3328bp HindⅢ片段，再克隆到pBR322ΔBamHⅠ质粒上(由于T4DNA多聚酶的填入而破坏了BamHⅠ位点)，得到质粒pRIT12608，在这个质粒中BamHⅠ位点位于cs-HBsAg编码序列的ATG启始编码上，这一点是独特的(图15)。从含有cs-HBsAg编码顺序，arg3转录末端区和侧翼pBR322序列的pRIT12608质粒得一段2550bp BamHⅠ SalⅠ片段，再克隆到质粒pRIT12544(图15)的BamHⅠ-SalⅠ位点，如上所述，给出质粒pRIT12658(图15)。在TDH3启动子的控制下，这一交换就将cs-HBsAg编码序列放到一个完整的2μ酵母穿梭载体上了。图15是制备质粒pRIT12658的程序表。
实例11酵母中杂种蛋白的合成根据Ito等(J.Bacteriol.，153，163-168，1983)的方法，用质粒pRIT10912(实例5)，pRIT12573(实例10)，pRIT12574(实例10)，或pRIT12658(实例10)，或质粒pRIT12329(实例9)和pRIT10172(实例2)分别转化啤酒酵母(S.cerevisiae)DC5或10S44C菌株，并在缺少亮氨酸的液体培养基中(YNB或YNB+80μg/ml组氨酸)培养，在对数生长期中期收集细胞。用离心法收集1-2ml培养物中的细胞，并将其悬浮于含有20%甘氨酸，4%SDS，6M尿素和10%2-巯基乙醇的0.125MTris-HCl(pH6.8)缓冲液50μl中，于100℃温育5分钟后，样品一分为二。按照Laemmli(Nature，227，680，1971)的方法将二份样品去电泳，分离胶12.5%，堆积胶5%。
用蛋白免疫吸印技术鉴定HBsAg和cs蛋白序列(See.Burnette，Anal.Biochem.，112，195-203，1981;Gershoni and Palade，Anal.Biochem.，131 1-15，1983;Towbin and Gordon，J.Immunol.Methods，72，313-340 1984)。当电泳吸印蛋白于硝酸纤维素滤膜上(Schleicher and Schüll，0.45μ)(Towbin et al.，Proc.Natl.Acad，Sci.，U.S.A.，76 4350-4354，1979)，滤膜在使用前要预先在含3%明胶的PBS中温育，37℃，1小时，然后用含0.1%吐温20的PBS洗5次，每次5分钟。将滤膜的一半在室温下与含有五种抗cs蛋白的单克隆抗体混合物在含1%明胶的PBS中处理一小时(Dame et al.，Science，225，593-599，1984)。另一半与抗HBsAg，HepYTAS12的单克隆抗体在含1%明胶的PBS中处理。HepYTAS12是一种抗体，抗纯的酵母衍生物HBsAg，HBsAg直接抗还原的或变性的抗性抗原决定簇。用含有0.1%吐温20的PBS洗滤纸片(filter sheets)5次，每次5分钟。然后放于含有第二次生物素化的羊抗鼠抗体(Amersham)和1%明胶的PBS中，在室温下温育一小时。再用含0.1%吐温20的PBS洗5次，每次5分钟。再在室就下与链亲合剂-生物素化的辣根过氧化酶(HRP)复合物(Amersham)温育30分钟。滤纸片再用含0.1%吐温20洗3次，每次5分钟。最后，放于含有30μlH2O2和HRP显色剂(含4-氯萘酚(BioRad)，30mg/10ml甲醇)的50ml PBS中温育。抗原的分子量是通过预先染色的蛋白标计，卵清蛋白，α-胰凝乳蛋白酶朊，β-乳球蛋白，溶菌酶和细胞色素C(BRL)来估算的。
用pRIT12573转化的酵母菌株DC5和10S44C都能产生一种抗原，它能同抗-cs和抗-HBsAg的抗体反应，其分子量大约是30000Kd。用pRIT12574或pRIT12658转化的两个酵母菌株DC5和10S44C产生一种抗原，它能同抗-cs和抗-HBsAg的抗体反应，其分子量为37000Kd。有些低分子量抗原也被指示出来，这表明杂种蛋白有些降解。含有质粒但不具有任何cs和HBsAg顺序(pRIT10172)的对照细胞不表现任何反应。含有质粒，但只具有HBsAg顺序(pRIT12329或pRIT10912)的对照细胞仅对抗-HBsAg抗体有反应。
这些结果表明，用含有cs编码序列同相位融合到PreS2-HBsAg编码序列中的质粒转化酵母，则酵母细胞中就能合成一种杂种蛋白，它含有cs和HBsAg顺序，并具有所希望的分子量。
此外，对pRIT12573和pRIT12574来说在抗-HBsAg反应中带的强度大体一样;但在抗-cs反应中，pRIT12574的强度要比pRIT12573的强度高的多。这说明在pRIT12574和pRIT12573中，HBsAg序列是等量的，而前者中cs蛋白的重复抗原决定簇序列要比后者多。
实例12代表CSP抗原决定簇的杂种颗粒的合成含有pRIT10172(实例2)，或pRIT12329(实例9)，pRIT12573(实例10)或pRIT12574(实例10)的啤酒酵母菌株DC5或10S44C，在选择培养基(200ml YNB或80μg/ml组氨酸)中培养至对数期末期。离心法收集细胞，并悬浮于含0.5%吐温20，1mM PMSF(苯基甲基磺酰基氟化物)，2.5%异丙醇的50mM磷酸钠缓冲液10ml中。用弗氏细胞压(French Press)破碎细胞两次，压力为20000psi(1.38×108Pa)，将细胞悬液离心30000xg，30分钟。用Lowery等的方法(J.Biol.Chem.，193，265-275，1951)，以牛血清蛋白作标准，测定上清液(粗细胞提取物)中的蛋白总浓度。用放射免疫测定盒(AUSRIAⅡ)(该产品可以从Abbott Laboratories，North Chicago，Illinois买到)或ELISA盒(Enzygnost-HBsAg micro)(该产品可以从Behringwerke，Marburg，W.Germany买到)测定HBsAg的存在。在用ELISA盒测定时，可以测定HBsAg颗粒中的cs顺序的免疫反应能力。用含有0.2%BSA的PBS稀释样品至适合的浓度，使其结合到(室温过夜)固相抗-HBsAg(Enzygnost Kit)上。将固定的HBsAg颗粒在37℃下与抗-cs蛋白的五种单克隆抗体混合物(作为第一抗体)的1/10000稀释液(用含0.1%BSA的PBS稀释)温育一小时，(Dame etal.，Science，225，593-599，1984)。然后同作为第二抗体的生物素化的羊抗鼠Ig(Amersham)的1/500稀释液(用含0.1%BSA的PBS稀释)在37℃温育一小时。用稀释1/1000倍(含0.1%BSA的PBS)的链亲合素-生物素化辣根过氧化酶复合物(Amersham)和色原(来自EnzygnostKit)在37℃温育30分钟检查结果。在温育期间用酶诊断盒(EnzygnostKit)的洗脱液洗盘(trays)四次。用TitertekMultiskan(Dynarech)计，在波长510nM下测定颜色的变化。
粗细胞提取物中蛋白的浓度和AUSRIA活性(表二)的测定表明pRIT12573和pRIT12329对HBsAg的表达水平是相同的。然而pRIT12574的AUSRIA活性大约低10倍。这些提取物的免疫吸印分析表明在上述三种情况下与蛋白质合成有关的HBsAg的量是相同的。
表二粗细胞提取物的AUSRIA活性HBsAgHBsAg蛋白(RIA)ng/mg质粒基因(mg/ml)(ng/ml)蛋白pRIT10172-5.600pRIT12329S3.357001730pRIT12573cs(24bp)PreS2-S3.640001110pRIT12574cs(192bp)PreS2-S2.8450160ELISA分析表明，在pRIT12573和pRIT12574的提取物中(表Ⅲ)具有能够表达HBsAg和cs抗原决定簇的结构;并且在pRIT12574提取物和pRIT12573提取物的反应中，前者比后者含有更多的cs和HBsAg抗原决定簇。
表Ⅲ固着于固定化抗-HBsAg抗体上的抗原中的HBsAg和cs抗原决定簇粗细胞提取物ELISA(HBsAg)ELISA(cs)来源稀释OD510nMOD510nM10S44C(pRIT10172)100X0.0000.06510S44C(pRIT12329)100X0.5800.054200X0.3410.041400X0.1880.05610S44C(pRIT12573)100X1.2981.596200X1.0801.299400X0.7020.898800X0.3360.5601600X0.1550.3233200X0.0750.18910S44C(pRIT12574)100X0.6621.678200X0.3701.506400X0.1831.130800X0.0790.7981600X0.0440.4493200X0.0610.205为了测定RIA和ELISA正结构的性质，取1.0ml粗细胞提取物在pH7.4的50mM磷酸缓冲液中与1.5MCsCl混合，用BackmanSW50.1转头离心，40000xg，40小时。用上述的RIA和ELISA方法，测定离心收集物中的HBsAg和cs抗体结合活性。结果表明在pRIT12573和pRIT12574的梯度中，HBsAg和cs抗原的活性是相平衡的。它们的梯度密度(rho＝1.20g/cm3)比pRIT12329(rho＝1.18g/cm3)的略高一点。
梯度分布的免疫吸印分析肯定了RIA/ELISA结果。HBsAg和/或cs序列只存在于RIA/ELISA分析中起反应的那些部分里。
这些结果指出，通过pRIT12573和pRIT12574表达而生成的杂种蛋白聚集在颗粒之中，就像上述酵母中合成的22nMHBsAg颗粒。而通过pRIT12573和pRIT12574表达而产生的颗粒确将cs序列暴露在它们的表面，所以它们能同抗-cs抗体起反应。在RIA实验中，在使用pRIT12574的情况下，这些cs序列部分地阻断了HBsAg的a因子(AUSRIA活性的主要起作用部分)的通路。
实例13A.杂种颗粒的提纯化按实例10的方法，从含有pRIT12574的酵母菌株10S44C制备粗细胞提取物，并用聚乙二醇(PEG)400沉淀，使其澄清，再用具有阻隔100000道尔顿装置的AMICONDC超过滤。
根据文献的报道，可以用于进一步纯化杂种颗粒的方法有，CsCl离心，羟基磷灰石色层析，和凝胶过滤等。
经用HPLCTSK-3000柱(LKB)分析，从含有pRIT12574酵母细胞提取物制备的纯物质有一个主要峰，它具有HBsAg和cs两种抗原活性。用银染色法(Wrayetal.，Anal.Biochem.，118，197-203，1981)做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(Laemmli，Nature，227，680，1971)，显示出一个主要带，估计分子量(MW)为37000kD。用醋酸双氧铀负染色后进行电镜观察，其结果表明颗粒的大小和形状与酵母衍生的HBsAg相当。
B.杂种颗粒的纯化将洗净的酵母细胞混合于等重的50mM磷酸钠提取缓冲液(pH8.1)中，缓冲液中补加4mMTitriplexⅢ1%吐温20，4MMPMSF和10%异丙醇，用细胞磨(DynoMill)破碎细胞制备提取物。
离心11000xg，90分钟去掉细胞碎片。用1N醋酸将500ml离心的粗提取物调至pH7.2，并加10克胶状硅(Aerosil 380，Degussa)于4℃振荡过夜。然后将悬浮离心3500g，一小时，将离心沉淀物在15分钟内用150ml的0.15M NaCl加2mM PMSF和5mM EDTA液洗三次。将最终的Aerosil沉淀物用含有2%吐温的25ml 10mM焦磷酸缓冲液(pH4.5)洗脱三小时。向吸附物中滴加1M CaCl2，直使CaCl2终浓度为30mM，并将pH调至7.0。溶液于4℃过夜，再离心6500g，15分钟。上清液于4℃对2×51 10mM Tris/HCl(pH7.1)缓冲液透析，最后用透析液稀释4倍。
向稀释的抗原溶液中加30mM CaCl2和1M NaCl，并调pH至7.1，然后过150ml的苯基-琼脂糖FF柱，(该柱用相同的CaCl2/NaCl Tris缓冲液平衡过)，流速为30cm/小时。用平衡缓冲液洗柱，直至OD280nM吸收值降至零。最后再用含6M尿素的10mM Tris/HCl pH9.0缓冲液洗脱，其流速同上。
另一种方法是将透析后稀释四倍的抗原溶液补加20%的(NH4)2SO4(pH7.0)，并且过150ml的苯基琼脂糖FF柱，(柱子用含20%(NH)SO的10mM Tris/HCl(pH7.0)缓冲液平衡过)，流速30cm/小时。用平衡缓冲液洗柱后，再用10mM Tris/HCl)pH7.1缓冲液洗脱，其流速同上。
收集抗原阳性部分，并进行CsCl梯度离心，于4℃，245000xg，65小时。离心一次或二次。纯的杂种cs-HBsAg颗粒的梯度密度为1.23gr/cm3。
实例14杂种颗粒的免疫原性按实例13的方法，从含有pRIT12574的啤酒酵母10S44C菌株制备纯的杂种颗粒，将杂种颗粒直接接种实验动物或者加佐剂氢氧化铝再接种实验动物(Youngetal.，Science228，958-962，1985)。
对C57B1/6鼠(6-8周)，豚鼠和兔子于0，21，和49天进行皮下和腹膜内免疫，并于7，28，56，84天取血。将血放于4℃过夜，凝固，分离出血清并放于-70℃直至使用。
将兔子分成两组，每组2个，每次免疫时使其接受10μg杂种cs-HBsAg蛋白，其量为1ml，其中有一组加佐剂氢气化铝，另一组不加。用两个兔子做对照组，用10μgHeptavaxB(MerckSharpe&Dohme)免疫，接种方式同上。鼠和豚鼠，5个动物一组，每次免疫时分别接受1μg和5μg杂种蛋白，其量为0.5ml。用没有免疫的动物作对照。
为了测定抗体效应，每组鼠的血清放在一起测定，而豚鼠和兔子的血清单个进行分析。用以重组cs蛋白R32tet32作抗原的ELISA分析方法测定抗cs-抗体的效价(See，Youngetal.，Scinece，228958-962，1985)。用AUSAB盒(AbbottLaboratories)和WHO的参考标准测定抗-HBsAg的效价。
豚鼠和鼠对HBsAg都不产生可估量的抗体效价，不管怎样反复强化免疫。相反，这两种动物产生抗-cs抗体，其效价随强化剂量的增加而增大。在ELISA分析中，用稀释1600倍的鼠血清和释稀9000倍的豚鼠血清得到的吸收值为1.0。吸附氢氧化铝没有使杂种颗粒的免疫原性加强。
相反，兔子对cs和HBsAg都产生抗体。在抗-cs的ELISA分析中，当吸收值为1.0时，交互效价在800-3200之间。吸附氢氧化铝的杂种颗粒的抗HBsAg效价在4000-20000muI/ml之间，而用Heptavax免疫的兔子给出的效价是105-106MUI/ml。吸附氢氧化铝的杂种颗粒提高了免疫效应。
在环状体沉淀素反应以及在体外抑制肝胞瘤的子孢子侵染中，鼠、豚鼠和兔子的血清都有强烈的反应(Youngetal.，Science，228，958-962，1985)，(见表Ⅳ)。这两种反应是指示一种保护性免疫效应。
表Ⅳ环状体沉淀素(CSP)反应力和HePG2-A16肝细胞瘤子孢子侵染抑制百分数(%ISI)动物CSP一周后第三次强化(4+2+0)%ISI收集鼠血清149291%兔＃36223096%豚鼠＃11072410100%括号中的数字表示CSP反应力的程度，0-表示CSP反应力为零2+-在子孢子的表面有颗粒沉淀。
4+-从子孢子末端形成线状物。
实例15疫苗制备下面以这项发明的一种疫苗为例，说明疫苗的制备方法将溶于缓冲液中的本发明颗粒边搅拌边加到用同样缓冲液配制的3%氢氧化铝水溶液中(10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH6.8;过滤灭菌)，使多肽的终浓度为100μg/ml，铝离子(Al3+)终浓度为0.5mg/ml。pH保持在6.8。混合物于0℃左右放置过夜。然后加入乙基汞硫代水杨酸钠至终浓度0.005%。检测pH值，调至pH6.8。
虽然前面对这项发明和其申请的所有具体内容进行了充分地说明，但应该懂得此发明不仅仅限于那些详述的具体内容，相反，它还包括全部在下列权利要求范围内对其所进行的改进和修饰。
用酵母生产PreS2-S蛋白和PreS1-PreS2-S蛋白实例将本发明的PreS2-S蛋白编码区插到一种酵母表达载体上，然后转化到酵母细胞中，发现其能合成类似真正22nMHBsAg的蛋白颗粒，表面裸露着糖基化PreS2蛋白。以前还没有人确切地报道过酵母在用HBV基因组的任何一部分转化后能表达出糖基化产物。
下面的例子是关于除含乙型肝炎表面抗原S蛋白外还含PreS2区的蛋白，其糖基化形式在酵母中的表达。该蛋白可从酵母细胞中提取纯化出，呈颗粒状，用作人疫苗。酵母细胞表达的PreS1-PreS2-S蛋白也是糖基化的，并且也可以蛋白颗粒的形式从细胞中提取纯化出来，用作抗乙型肝炎病毒疫苗。
关于糖基化，下列几点应予说明1.例25，26和27分别涉及刀豆或蛋白A的结合，衣霉素对EndoH的作用和敏感性。每个例子都证明33Kd的PreS2-S类蛋白是糖基化的。因此，糖基化已用三种不同方法得到了证明。
2.这些试剂大体上有如下特点a)刀豆球蛋白A优先与甘露糖残基结合。
b)衣霉素抑制所有与天冬酰胺形成N-糖苷键的糖基化反应。
c)糖苷内切酶H切掉与天冬酰胺相连的含大量甘露糖的寡聚糖，留下一个与天冬酰胺相连的N-乙酰葡糖胺残基。
3.综合例25，26，27和上述结果，可以推断，在PreS2-S蛋白(受衣霉素抑制，对EndoH敏感)的33Kd类蛋白上存在一个以N-端相连的寡聚糖链，该糖链主要由甘露糖(对EndoH敏感)组成。用衣霉素处理和EndoH消化，观察到分子量改变(约3000)，表明寡聚糖结构由大约10个糖残基组成。其大小与酵母核心糖基化物差不多。因此PreS2-S蛋白的三个可糖基化位点，可能只有一个被糖基化。
4.例28和29所述纯化方法中都有一个利用糖蛋白上的糖残基进行亲和层析的步骤。
5.苯基硼酸盐对1，2-顺式二元醇基团(空间位置同方向的二个相邻OH基团)有特异性。
6.晶体琼脂糖对葡萄糖/甘露糖有特异性。
实例16pRIT12662的构建-一种带有PreS2-S表达系统的大肠杆菌载体(图16)。
对前述实例3法所得pRIT12290质粒，用插入一个BamHⅠ-EcoRⅠ合成连接物片段的方法，进行修饰，该连接物编码TDH3启动子和ARG3终止区两个片段间的PreS2区N-末端氨基酸。修饰方法如下质粒pRIT12290用BamHⅠ和EcoRⅠ酶消化，然后用碱性磷酸酶脱磷酸。200Pmoles(微微摩尔)脱磷酸连接物GlnTrpBamHⅠ5′GATCCAGTGG3′EcoRⅠ3′GTCACCTTAA5′用1单位T4连接酶与0.1Pmoles的BamHⅠ-EcoRⅠ脱磷酸质粒pRIT12290相连接，然后用于转化大肠杆菌MM294菌株，使其对氨苄青霉素产生抗性。鉴别出含期望质粒的转化子，将其保留，该质粒带有插在BamHⅠ和EcoRⅠ位点间的合成连接物。此质粒定为pRIT12621。以pRIT12621为起始物，下面几步为，为了将ATG密码放在与Pre S2区第二个密码同相位置，先除去4个多余的碱基对(BamHⅠ位点中心)，然后将带有Pre S2编码区其余部分和完整S编码区的EcoRⅠ片段插到pRIT12621的EcoRⅠ位点上，完成整个Pre S2-S编码区的构建。
此阶段的DNA操作，包括后面要进行的质粒pRIT12621的线性化，缺失和再环化，都不需要通过用中间质粒转化进行扩增就可完成。步骤如下30微微摩尔(120μg)的pRIT12621DNA用120单位BamHⅠ线性化。用酚抽提除去限制性内切酶，用乙醇沉淀出质粒，再溶于适宜的缓冲液中，用280单位的绿豆核酸酶消化BamHⅠ单链端。核酸酶用酚抽提除去，再用乙醇沉淀出质粒。将这样处理过的质粒再溶于连接缓冲液中，用10单位T4连接酶再环化。将含环化质粒的制品进行酚处理，乙醇沉淀，再溶于适宜的缓冲液中，用EcoRⅠ酶消化。经酚除去EcoRⅠ内切酶和乙醇沉淀后，将0.05pmoles(0.2μg)的DNA再溶于连接缓冲液中，与0.4Pmoles(0.2μg)含838个碱基对的EcoRⅠ片段连接，该片段从pRIT12581分离得到，带有Pre S2-S蛋白的整个C-末端编码区。一种和pRIT12581基本相似的质粒可按如下方法构建。载体pUC9(Amersham和Pharmacia有售)用EcoRⅠ内切酶消化后，用碱性磷酸酶(Shine，U.S.Patent 4，264，731)消化。质粒pRIT10616(ATCC39131)用EcoRⅠ和AccⅠ限制性内切酶消化。带有Pre S2-S部分编码区、有826bp的EcoRⅠ-AccⅠ片段通过丙烯酰胺凝胶制备电泳和电洗脱法回收。用约0.4Pmoles(0.2μg)所得片段与10 Pmoles按前述实例8方法退火粘接得到的下列12bp合成连接物混合，混合物用T4连接酶处理后，再用限制性内切酶EcoRⅠ消化。
IleTyrStop5′ATACATTTAACG3′AccⅠEcoRⅠ3′TGTAAATTGCTTAA5′在此处理过的混合物中加入0.2μg经EcoRⅠ消化和碱性磷酸酶处理过的pUC9载体，载体制备方法如前所述。将混合物用T4DNA连接酶处理后，用常规方法转化大肠杆菌K12感受态细胞，使其对氨苄青霉素具抗性。检测转化子形成的菌落是否存在这种质粒，该质粒由2650bp的pUC9载体和838bp的EcoRⅠ片段组成，该片段则由826bp的EcoRⅠ-AccⅠPreS2-S片段和12bp的AccⅠ-EcoRⅠ合成接头组成。这样检测出的质粒，其结构是否正确，可用Maxam和Gilbert的化学修饰法(MethodsinEnzymology，65.499，1980)测基因序列验证。序列分析最好从pUC9多聚接头单一旁侧限制内切点开始。
用含前面处理所得pRTI2621质粒DNA和pRIT12581质粒的838bp的EcoRⅠ片段的混合物，按前引Cohen等人方法转化大肠杆菌MM294菌株。找出EcoRⅠ片段取向正确的质粒转化体，该质粒定为pRIT12662(见图1A和图16)。图1A是制备pRIT12662的操作过程图解。图16是pRIT12662的限制性内切酶图谱。用Maxam和Gilbert的化学修饰法(MethodsinEnzymology，65，499，1980)对pRIT12662的PreS2区进行序列分析，以核实编码区在N-末端读码是否如下MetGlnTrpAsnSerAAACAAACAAAATGCAGTGGAATTCCpTDH3preS2-ScodingregionDNA操作熟练者会懂得，通过适当的体外载体DNA操作，pRIT12662载体也可用来在PreS2区引入下一步DNA的功能序列。PreS2编码序列具有内切酶EcoRⅠ，PstⅠ和BamHⅠ的限制性内切点。这些位点中的任何一个都可用于引入编码所需肽链的DNA功能序列，与PreS2区发生同相位融合。这一融合将是这种类型PreS2-引入序列-PreS2-S。这些限制性切点也可经体外操作创造出其它载体，为DNA功能序列的插入提供其它位点或读码。比如用Botstein等人方法(Science，229，1193-1201，1985)就可做到这一点。
实例17pRIT12377和一种表达PreS2-S蛋白的酵母质粒pRIT12660的构建按例10(B)所述方法获得质粒pRIT12309，用SalⅠ内切酶消化，与带有酵母LEU2基因、2218bp大小的XhoⅠ-SalⅠ片段连接，该片段通过消化YEp13，再用丙烯胺凝胶电泳纯化获得。按前述Cohen等人的方法，用经连接的混合物转化大肠杆菌K12菌株JA221细胞，并使其带有氨苄青霉素抗性和亮氨酸自养双重标记。菌杜JA221从M.Rosenberg，SmithKline和French实验室(Philadelphia，Pennsylvania，U.S.A.)得到，可向美国典型菌种保藏所，登记号33875。从一个转化体菌落细胞中检测出一种质粒pRIT12377，其含插在pRIT12309质粒的SalⅠ位点上的一个2218bp大小的LEU2XhoⅠ-SalⅠ片段。
片段在载体上的取向，使得在载体上pBR327部分的AvaⅠ侧又产生了一个SalⅠ位点。pRIT12377是一种大肠杆菌-酵母菌的穿梭载体，它在这二种生物中都具有必要的选择、复制和保持功能。从pRIT12662(实例16)得到的含3050个碱基对的HindⅢ片断、含Pre S2-S表达体系，用丙烯酰胺凝胶电泳纯化后，经T4聚合酶处理，再连接到已用BamHⅠ酶切开的pRIT12377质粒上，然后用T4聚合酶修复。这一制品用来转化大肠杆菌MM294菌株，使其对氨苄青霉素产生抗性，方法按前述Cohen等人的方法。这样得到一种带有pRIT12660质粒的大肠杆菌转化体。图17是制备pRIT12660的操作过程图解。
pRIT12660质粒用于转化两种酿酒酵母菌株，即DC4cir菌株和10S44Ccir°菌株，转化方法按Hinnen等人方法(Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.79，2157-2161，1987)。
遵照1986年8月18日布达佩斯条约，这二个菌株DC5cir°和10S44Ccir都保存在美国典型菌种保藏所，菌株登记号分别为ATCC20820和ATCC20818。
实例18pRIT12662质粒的PreS2区用Maxam和Gilbert化学修饰法(Proc.Natl.Acad.Sci.，74，560-564，1977)对pRIT12662质粒的PreS2区进行序列分析。当与另一种adw2血清型(Valenzuetaetal.，1980-表Ⅰ第11页)病毒比较时发现有4个碱基对发生了改变，导致三种氨基酸的变化。在位置45，丙氨酸残基取代了苏氨酸残基;在位置34，苯丙氨酸残基取代了亮氨酸残基;在位置11，丝氨酸取代了异亮氨酸残基。这最后一个残基的变化影响了迄今为止在所有血清型中都不会变化的一个残基(Loetal.，Biochem.Biophys，Res.Com.，2，382-388，1986)。
实例19携带聚合人血清清蛋白(PHSA)受体的颗粒的合成带有pRIT12660或pRIT12363的酵母菌株DC5 cir°或10S44C cir°培养在选择性培养基〔200ml YNB+80μg/ml组氨酸(DC5 cir°)或YNB(10S44C cir°)〕中培养至对数期(pRIT12363除无肝炎衍生基因外，与pRIT12660完全相同;pRIT12363只带有S基因)。细胞经离心收集后再悬浮于pH8.0、50mM磷酸钠溶液中，其中含0.5%吐温-20(聚乙烯月桂山梨聚糖单酯)，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟化物)和2.5%异丙醇。用弗氏细胞压在20000psi(1.38×108Pa)压力下，压榨细胞两次，使其破碎。悬液于30000xg离心30分钟。上清液(细胞粗抽提物)中总蛋白浓度用Lowry等人方法(J.Biol.Chem.193，265-275，1951)测定，以牛血清清蛋白为测定标准。用放射免疫测定仪(AUSRIAⅡ)测定HBsAg相关物质的存在，这种装置可从Abbott实验室买到。结果(表Ⅴ)表明pRIT12660指导合成与HBsAg颗粒在抗原上相关的物质。在酵母菌株DC5 cir°和10S44C cir°中，该物质的表达水平，按AUSRIA活力计算，大体相同。
在测定聚人血清清蛋白(pHSA)(Pontissoetal.，J.VirolMethods，6，151-159，1983)受体的放射免疫测定中，带有pRIT12660的细胞的抽提物反应阳性，而带有pRIT12363的细胞，其抽提物反应为阴性。在上述条件下测定聚牛血清清蛋白，无反应。
将带有pRIT12660质粒的细胞抽提物进行CsCl平衡离心，表明AUSRIA阳性物质的离心带在rho＝1.20g/cm3左右，和血清或酵母HBsAg衍生颗粒相同。在此梯度部分回收的物质，pHSA试验阳性。
前面提到的结果表明，带有pRIT12660的酵母细胞合成了一种HBsAg相关蛋白，它们聚集成类似血清中22nm颗粒的结构，表面暴露出一个pHSA受体。
表ⅤA细胞粗抽提物中AUSRIA活力蛋白HBsAg相关抗HBsAg相关抗菌株质粒mg/ml原性ng/ml原性ng/ml蛋白DC5cir°pRIT1266013.47522DC5cir°pRIT1266012.6755510S44Ccir°pRIT1266010.8655610S44Ccir°pRIT126609.56631实例20在用pRIT12660转化的酵母细胞中发现有4种S-相关蛋白得到了表达为了分析带pRIT12660质粒细胞表达的HBsAg相关蛋白的单聚体，在三角瓶或发酵罐中用选择性培养基培养细胞至对数期，离心收集细胞。
在压紧的细胞(0.1克)中先加入20μl40mMPMSF异丙醇溶液，然后加入200μl聚丙烯酰胺凝胶电泳样品缓冲液(0.125MTris-HCl，pH6.8，含20%甘油，4%SDS，6M尿素和10%的2-巯基乙醇)。将样品振荡混匀，分成2-20μl等分试样，用样品缓冲液进一步稀释至终体积40μl，于100℃温育5分钟，然后按Laemmli方法(Nature，227，680，1971)通过12.5%分离胶，5%浓缩胶进行凝胶电泳。
用电吸印法(Towbin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.76，350-4354，1979)将蛋白吸印到硝化纤维滤膜(0.45μm，BioRad)上后，将滤膜放入含3%明胶的PBS液中，于37℃预温育1小时。然后将该滤膜和单克隆抗体一起温育，该抗体(monoclonal 6 obtained form H.Thomas，Royal Free Hospital，London，England)直接针对人衍生抗原HBsAg的变性和减弱抗性的抗原决定簇。将滤膜与下列物质逐个温育，以测定抗体的结合生物素化的羊抗鼠Ig(RPN1021，Amersham，用含1%明胶的PBS稀释250倍)，链亲合素-生物素化的辣根过氧化物复合物(RPN1051，Amersham，用含1%明胶的PBS稀释400倍)，最后是50ml PBS溶液，用30ml H2O2和含4-氯-1-萘酚(BioRad)的HRP显色剂30mg甲醇溶液10ml配成。每次温育后，滤膜都要用含0.1%吐温20的PBS液洗，然后再进行下一步温育。
免疫吸印显示的4条与S蛋白(p23)相关的蛋白带，用单克隆抗体法测定出这四种蛋白的分子量约为33Kd，30Kd，28Kd和25Kd。S-相关物质多数是在33Kd蛋白带中，其迁移速度比Stibbe和Gerlich(Virology，123，436-442，1982)所描述的gp33蛋白要稍快些。最小的蛋白带迁移速度比酵母合成的S蛋白(p23)要快。
实例21四种S-相关蛋白(33Kd，30Kd，28Kd和25Kd)聚集成颗粒带有pRIT12660(实例16)质粒的酵母细胞粗提取物制备方法同实例19或加入等重量抽提缓冲液(200mMTris，3MNaCl，10mMEDTA，10mM乙二醇双-β-氨基乙醚-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)，4mMPMSF，10%异丙醇)，用Dynomill细胞磨将酵母细胞磨碎的方法得到细胞粗提取物，于30000xg离心45分钟。
用大家熟悉的起滤法，CsCl平衡离心法和羟磷灰石层析法从细胞粗提取物中部分纯化出pRIT12660指导合成的蛋白颗粒。用Western吸印分析法测出的4条S-相关蛋白带随这些纯化步骤的进行而得到纯化。对平衡离心后AUSRIA阳性CsCl部分进行的免疫吸印分析(如实例20所述)表明，4种S-相关蛋白带在每部分都以同样的比例出现。
因此，这类物质以均匀的形式分布在整个梯度峰部分。
实例2233Kd和30Kd蛋白携带着聚人血清清蛋白受体人血清清蛋白(Sigma，A8763)用戊二醛(Merck，A-12179)处理后聚合，按Pontisso等人的方法(J.Virol.Methods，6，151-159，，973)纯化。用Western吸印法测定这4种S-相关蛋白对PHSA的反应性。pRIT12660指导合成的颗粒(实例21)经部分纯化后，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后按实例20方法转移到硝化纤维滤膜上。将滤膜与下列物质逐个进行温育，PHSA(15μg/ml，用1%明胶的PBS液配成)，兔抗人清蛋白抗血清(Behringuerker，ORCB 04/05，用含1%明胶的PBS液稀释250倍)，生物毒化的驴抗兔Ig(Amersham RPN 1004，用含1%明胶的PBS液稀释250倍)，链亲合素-生物素化的竦根过氧化物酶(Amersham RPN 1051，用含1%明胶的PBS液稀释400倍)，最后是实例20所述H2O2和4-氯-1-萘酚。
两条最大的S-相关蛋白带(33Kd和30Kd)和PHSA反应，两条最小的蛋白带(28Kd和25Kd)不和PHSA反应。
实例2333Kd和30Kd蛋白带有对PreS2-S蛋白的PreS2区有特异性的序列合成一段有26个氨基酸残基的肽链，其23个残基与Pre S2-S蛋白N-末端26个氨基酸残基的23个相对应(NH2-Met-Glu-Trp-Asn-Ser-THr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Asp-Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Leu-Pro-Alu-Gly-Cys-COOH)，用C-末端与
血蓝蛋白(Peninsula Laboratories)的关键点偶联起来。在兔子皮下免疫注射100μg Freund氏完全佐剂结合物(相当于20μg肽)，8天和15天后再用100μg Freund氏完全佐剂结合物强化，在28天，69天，149天用100μg PBS结合物强化。抗体效价提高后，每隔一定时间取血样，将血清和固定在固相的合成肽链一起温育，从而测定血清稀度。用碘化蛋白A(New England Nuclear)检测与固相肽链结合的抗体。选择抗肽效价高于或等于1/5120的血清用于免疫吸印试验。试验所用血清要稀释100倍，或部分纯化出IgG后。用Na2SO4(每毫升血清加120mg)沉淀法部分纯化出IgG，溶于PBS中，再用14%Na2SO4沉淀。将IgG溶液过PD10柱(Pharmacia)脱盐。
用生物素化的驴抗兔Ig，链亲合素-生物素化的竦根过氧化物酶和H2O2加4-氯-1-萘酚测定免疫吸印滤膜上的这些抗体对S-相关蛋白的反应性。方法同实例22。
pRIT12660指导合成的蛋白颗粒(实例21)经部分纯化后用SDS聚丙烯凝胶电泳分离，再按实例20方法将蛋白转移到硝化纤维滤膜上。从带有pRIT12363质粒的酵母中纯化出的颗粒中分离出的S-蛋白(p23)也进行凝胶电泳。免疫吸印表明，二个最大的S-相广蛋白带(33Kd和30Kd)与抗肽抗体反应，而二个最小的(28Kd和25Kd)却不反应。S-蛋白(p23)不与抗肽抗体反应。
实例24自然感染患者的人抗乙型肝炎抗体识别33Kd和30KdPreS2-S蛋白上的抗原决定簇，这个决定簇不存在于S蛋白上。
按实例20描述的免疫吸印方法，检测了从乙型肝炎抗体阳性患者(Belgian Red Cross，100-150 IU/ml，Lot 85A08)收集的γ球蛋白对四个S相关蛋白的反应性。pRIT12660编码的颗粒部分纯化制备物(实例21)用SDS溶解，蛋白质经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到硝酸纤维素膜片上。转移后，膜片与抗乙型肝炎γ球蛋白(含1%明胶的PBS稀释10倍)温育。按实例20描述的方法，依次与生物素化的绵羊抗人免疫球蛋白Ig(Amersham RPN 1003，用含1%明胶的PBS稀释至1/250)、链亲和素-生物素化的竦根过氧化物酶温育，最后与H2O2和4-氯-1-萘酶温育，检测了抗体的结合。
两个最大的S相关蛋白带(33Kd和30Kd带)与人的抗体反应，两个最小的S相关蛋白带(28Kd和25Kd带)没有反应。pRIT12363转化的酵母细胞内颗粒上的S蛋白(p23)与这些人的抗体没有反应。这些结果表明从感染着获得的γ球蛋白专一性地识别在变性和还原的PreS2-S蛋白上的抗原决定簇，这个决定簇在变性和还原的S蛋白上并不存在。已经知道人血清和酵母来源的S蛋白上的抗原决定簇主要是构象性的。
实例10A33Kd蛋白种类中带有含甘露糖的寡糖结构按实例20描述的方法，pRIT12660转化的10S44Ccir°细胞部分纯化颗粒制备物的PreS2-S蛋白经电泳分离，转移到硝酸纤维素膜片上。由pRIT12363转化酵母菌纯化的颗粒S蛋白和来自感染者血清的HBsAg颗粒S蛋白也进行电泳。感染者血清由联邦德国、哥延根大学医学微生物W.H.Gerlich博士提供。
按实例20描述的方法，硝酸纤维素膜片的一半与50μg/ml刀豆蛋白A(Calbiochem，A级)在10mM Tris(pH7.5含150mM NaCl，1mM CaCl，1mM MnCl20.05%吐温20)中温育，再与30μg/ml辣根过氧化物酶在10mM Tris(pH7.5，含150mM NaCl，0.05%吐温20)中温育，最后与H2O2及4-氯-1-萘酚温育。
每次温育之间，膜片用pH7.5，含150mMNaCl，0.05%吐温20的10mMTris漂洗(Hawkes，AnalBiochem，123，143-146，1982;Clegg，AnalBiochem，127，389-394，1982)。硝酸纤维素膜片的另一半与单克隆抗体6温育，按实例20描述的方法处理。
33Kd蛋白带与刀豆球蛋白A-过氧化物酶试剂反应，而30Kd，28Kd及25Kd蛋白带都没有反应。来源于pRIT12363转化细胞的S蛋白也没有反应。当有0.1Mα-甲基甘露糖苷存在时，刀豆球蛋白与33Kd蛋白的结合消失。
实例26一个寡糖结构是N-型糖苷联接在天冬酰胺上pRIT12660和pRIT12377(实例17)转化的细胞生长在选择性培养基上(对于DC5 cir°用YNB+80μg/ml组氨酸，对于10S44C cir°用YNB)。长到OD620nm＝0.2时，加衣霉素(Calbiochem)至终浓度为10μg/ml，培养物在30℃温育30分钟，然后按每毫升20μCi加入35S-甲硫氨酸(1000Ci/mmol)(New England Nuclear)再温育15分钟。衣霉素处理和未处理的细胞培养物(标记过的)各2ml，小离心机上离心，收集细胞再悬浮于40μl 1%SDS中，加入0.3g玻璃珠(直径0.45-0.50mm)，用Vortex混合器振荡2分钟，分散细胞。
免疫沉淀基本按Julius等人(Cell，36，309-318，1984)方法进行。胞溶产物在100℃加热3分钟，用0.5毫升含1%TritonX100，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS的PBS稀释，在100℃下再加热1分钟。
煮沸过的抽提物中加入25μl10%预洗过的免疫沉淀素(Formalin固定的葡萄球菌A细胞，BethesdaResearchLaboratories)的上清液，在0℃下温育30分钟。混合物在小离心机上离心5分钟，上清液加入2.5微升对S蛋白专一的单克隆抗体6(参见实例20)，这个混合物在0℃下温育1小时。另加入25微升免疫沉淀素，在0℃下温育30分钟。免疫复合物经离心收集(小离心机上离心5分钟)，再依次用含2摩尔/升脲的PBS，1%巯基乙醇的PBS，最后用PBS洗。这样洗过的复合物重新悬浮在实例20描述的电泳样品缓冲液中。
带有105cpm的样品进行浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(参见实例20)，电泳后凝胶用含10%乙酸的40%甲醇固定，用荧光检测放大剂(Amplify，Amersham)处理，真空下干燥在滤纸上，在-70℃下用柯达X-Omat S胶片曝光。
这里表明pRIT12660转化的细胞，不存在衣霉素时，含成33Kd蛋白;存在衣霉素时，合成30Kd蛋白。而在pRIT12377转化细胞的相应样品中、两种蛋白带都不存在。
这些结果表明在酵母细胞株PC5cir中，表达了33Kd的PreS2-S蛋白，这个蛋白带有一个与天冬酰胺N-型糖苷联接的寡糖部分。很可能只有一个寡糖链与33Kd形式的PreS2-S蛋白连接，它比核心糖化物稍大一些。
实例27这个寡糖结构是富含甘露糖类型的。
pRIT12660转化细胞的粗提液，或者从这些粗提液得到的部分纯化的PreS2-S颗粒制备物(实例21)，用内切-N-乙酰葡萄糖胺酶(EndoH;EC.3.2.1.96)处理，这个酶来自褶皱链霉菌(Streptomycesplicatus)，从NewEnglandNuclear获得。
在0.1%SDS溶液中，部分纯化的颗粒(50μl450μg蛋白/ml)在100℃煮沸3分钟，用pH5，100mM柠檬酸钠稀释10倍。240μl混合物中加入2.4μlEndoH(74μg/ml)。加入或末加过EndoH的样品均在37℃温育4小时。EndoH处理和未处理的样品，均按实例20描述的方法，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和免疫吸印分析，后者用对S蛋白专一的单克隆抗体检测，结果表明有EndoH处理时，33Kd的蛋白带消失，而出现31Kd的蛋白带，这个31Kd的蛋白带仍能与前面描述过的刀豆球蛋白一过氧化物酶试剂反应，其它带(30Kd，28Kd和25Kd)的位置在EndoH处理下并不改变位置。延长温育时间和增加EndoH浓度的结果相同。这表明连接在33Kd蛋白上的寡糖结构是富含甘露糖类型的，它的大小和核心糖化物相当。
实例28包含PreS2-S蛋白颗粒的纯化洗过的酵母，经研磨得到包含PreS2-S蛋白的酵母粗提物。研磨是在细胞磨中，用与抽提液等重量的缓冲液来进行的。缓冲液为pH8.1，50mM磷酸钠(含有4mMEDTA，1.0%吐温20，4mMPMSF和10%异丙醇)，或为pH9.0，200mMTris-HCl缓冲液(含有3.0MNaCl，10mMEDTA，10mMEGTA即乙二醇双乙胺-N，N′-四乙酸，1%吐温20，4mMPMSF和10%异丙醇。
将均匀物质的pH相应地调至8.0或9.0，再在30000xg下离心45分钟。
500ml酵母粗提液的pH调至pH7.2，加入10g胶状硅(Aerosil380Degussa)，胶状上清在4℃下搅拌过夜，再低速离心。Aerosil小球，用150ml0.15MNaCl分三次洗。在37℃下，再用250ml含2%吐温20的10mM焦磷酸缓冲液在3小时内一次洗脱，得到微黄色，稍发乳光的解吸溶液。这个溶液加到50ml的苯基硼酸化的琼脂糖层析柱(Amicon)上，(用pH9.0，10mM焦磷酸缓冲液平衡)、上样流速为15ml/小时。
进一步用2倍柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱，再反方向用pH7.2，含100mM山梨醇糖的50mMTris洗脱，流速为15ml/小时。收集洗脱收峰组分，将pH调至8.1后加到-DEAE-Fractogel(TSK层析柱上(用pH8.1，50mMTris平衡过)，用含有75mMNaCl的相同缓冲液的颗粒洗脱下来。这个步骤以后，残留的核酸被除去(每20μg蛋白质中少于1μg核酸)，结果如表Ⅵ所示。
表Ⅵ包含PreS2-S蛋白颗粒的两步纯化S相关蛋白(mg)蛋白质脂类多糖组分毫升(放射免疫测定法)(mg)(mg)(mg)粗提液50011.31460052867850Aerosil解吸物2705.96385554249PBA柱流出液3152.83＊365360267PBA柱洗脱液702.82.952.5＊没有充分糖基化的蛋白质保留在层析柱上。
按这个实例28得到的pRIT12660转化细胞抽提液，再经过氯化铯离心纯化的物质，醋酸双氧铀染色后用于电镜检查。检查结果表明存在直径约19微米的分散颗粒，这些杂种颗粒中，每100μg蛋白质包含5-20μg吐温20。
实例29扁豆素琼脂糖的亲和层析这个实例中，扁豆素琼脂糖(Pharmacia)的亲和层析取代了苯基硼酸琼脂糖层析步骤。
按实例28方法得到的50mlAerosil解吸物，加到5ml扁豆素琼脂糖层析柱上，层析柱用平衡缓冲液如含0.14MNaCl，0.3%吐温20的10mMTris缓冲液(pH7.2)平衡过，层析柱再用2倍柱床体积的平衡缓冲液如Tris缓冲液(pH7.2)洗涤，在平衡缓冲液中加入对扁豆素专一的糖添加物如0.5Mα-甲基甘露糖苷，这种缓冲液洗脱结果如表Ⅶ所示。
表Ⅶ在纯化包含PreS2-S蛋白颗粒过程中，扁豆素琼脂糖亲和层析的应用体积S相关蛋目(μg)组分(ml)(放射免疫测定)总蛋白质粗提物10021703gAerosil解吸物501700138mg扁豆素琼脂糖柱的流出液50428-扁豆素琼脂糖柱的洗脱液12.59251.26mg电镜检查表明这里得到的纯化杂种颗粒中，每100μg蛋白质包含5-50μg吐温20。
实例30PreS2-S颗粒的免疫原性在两种鼠系Bal b/c(H2-d)和NMR1(H2-Q)中研究了pRIT12660(实例16)转化细胞抽提液中制备的颗粒的免疫原性。这些颗粒在注射前用Al(OH)3吸附，腹腔注射老鼠(5只/组)，剂量为0.3μg放射免疫测定反应物质。免疫后一个月，鼠放血，同组鼠的血清收集在一起，收集的血清用AUSAB试剂盒(Abbott Labs)，参照世界卫生组织方法，测定了抗S蛋白抗体的效价，再根据Hollinger公式(Hollinger et al.)in Szmuness et-al.，des.Viral Hepatitis，PhilledlphiaFranklin Institute Press，451-466，1982)转化成mIu/ml单位。抗Pre S2抗体用固相测定法(放射免疫测定)检测，测定中，实例23提供的合成的Pre S2肽吸附在塑料上，结合的抗体用125Ⅰ标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G检测。结果表明在表Ⅷ上，表明在两种鼠系中，pRIT12660转化细胞的颗粒诱导抗S蛋白和抗Pre S2肽的抗体，在NMR1中抗Pre S2肽抗体的效价比在Bal b/c中高。这种颗粒诱导的抗S蛋白的效价比更高剂量的pRIT12363转化细胞颗粒诱导的抗S蛋白效价高出2-3倍，后者中没有Pre S2序列。Pre S2决定簇增强了S决定簇的反应。当合成的Pre S2肽和缺乏Pre S2的颗粒一起注射时，这种增强作用并不出现。并且，仅有合成的Pre S2肽也不能诱发抗Pre S2抗体。
这种结果暗示获得抗PreS2反应需要同一个颗粒上的PreS2决定簇与S决定簇的联合，而且这种联合导致抗S蛋白反应的加强。
涉及这里的与PreS2-S颗粒相关的免疫原性的研究结果总结在表Ⅷ上。
表ⅧPreS2-S颗粒的免疫原性抗S蛋白抗抗PreS2肽抗S相关抗体的效价(2)体的效价(3)原的剂量＊(1) mIU/ml mIU/ml注射的制备物(μg)(1)Balb/cNMRlBalb/cNMRl酵母来源的S颗粒1.7140471902(由pRIT12363编码)酵母来源的S颗粒1.55748116304(由pRIT12363编码)+0.08ug合成的PreS2肽0.08ug合成的PreS2肽-2104酵母来源的PreS2-S颗粒0.3334424188120(由pRIT12660编码)(1)用AUSRIA试剂盒(AbbottLabs)测定。以伦敦国家生物学标准研究所schild博士提供的、国际上推荐的参考制备物为标准。
(2)用AUSAB试剂盒(AbbottLabs)测定。按世界卫生组织的标准。
(3)用固相放射免疫测定法测定，合成的PreS2肽吸附在塑料上。
效价指能给出有意义的抗体结合的稀释度，(为阴性对照血清值的2.5倍)。
酵母中完整的PreS1-PreS2-S蛋白编码序列表达的实例实例31酵母中表达PreS1-PreS2-S蛋白的质粒pRIT12845的构建。
第一步，TDH3启动子区域与PreS1N端编码区融合，后者来自乙型肝炎病毒的基因组。出发质粒为pRIT12792，它携带的一个495bpNcoⅠ-XbaⅠ片段，包括了除最后一个天冬酰胺密码外的全部PreS1-PreS2编码序列。NcoⅠ位点与乙型肝炎病毒PreS1序列中163位氨基酸ATG密码重叠，NcoⅠ-XbaⅠ片段的序列如图4A所示。
与质粒pPRIT12792基本相似的质粒pRIT12793(5940bp)来自美国典型菌保藏中心，按1986年9月5日布达佩斯协议规则，登记号为ATCC67193。来自质粒pRIT12793的一个495bPNocⅠ-XbaⅠ片段，能使PreS1-PreS2编码序列完全恢复。这个片段与图4A所示的序列相差一个核苷酸，这个片段的3′末端序列为ACGAACTAATAATCTAGA，下面划线标明的是差异的核苷酸。在下面的实例中，可以用pRIT12793代替pRIT12792。pRIT12792和pRIT12793中包含有NcoⅠ-XbaⅠ片段，它是用体外DNA操作方法，从乙型肝炎病毒(血清型adw)的PreS1-PreS2区域中获得，乙型肝炎病毒先克隆在质粒pRIT10616中，质粒pRIT10616从美国典型菌种保藏中心获得，登记号为ATCC39131。
52μg的pRIT12792，先用NcoⅠ和XbaⅠ限制性内切酶消化，再用绿豆核酸酶处理以消除5′端延伸。将600ng(Zpmol)处理并纯化的495bp的NcoⅠ-XbaⅠ片段与170ng(0.02pmol)pRIT12314载体连接，载体已用BamHⅠ和SmaⅠ切开并用绿豆核酸酶处理过。质粒pRIT12314包括了啤酒酵母完整的2微米片段和一个表达框架，表达框架中，一个BamHⅠ-SmaⅠ-EcoRⅠ接头将TDH3启动子和ARG3终止区域隔开。
前面实例10(B)上有pRIT12314构建过程的更详细描述。按Cohen等人(引文见前)方法，将上述连接混合物转化大肠杆菌MM294，用氨苄青霉素抗性平板筛选得到六个转化子，其中的质粒上PreS1-PreS2片段以正确的方向插入者命名为pRIT12843(a…f)(图18)。
第二步，将S基因6的编码区域插入到上述质粒pRIT12843(a…f)中，重新构建了PreS1-PreS2-S完整基因。
这可按下列方法进行质粒pRIT12843(a…f)用BamHⅠ和SalⅠ酶切消化。BamHⅠ位点在在PreS2区域的起始位置上，SalⅠ位点在来自于pBR327的ARG3终止子后面。从质粒pRIT12843(a…f)纯化出最大的BamHⅠ-SalⅠ片段(10，400bp)，从pRIT12660(实例16)中得到BamHⅠ-SalⅠ小片段，80μg前者(0.012μmol)与300ng后者(0.11pmol)连接。pRIT12660的BamHⅠ-SalⅠ小片段(4800bp)包含了一部分PreS2-S编码序列，它后面跟有ARG3终止子序列和酵母的Leu2序列。连接后，按Cohen等人(引文见前)方法，用各种质粒pRIT12843(a…f)转化大肠杆菌MM294，得到一系列氨苄青霉素抗性的克隆。这些克隆包含的质粒命名为pRIT12845(a…f)。pRIT12845(a…f)制备流程图如图18所示。按Ito等人(引文见前)方法，用质粒pRIT12845(a…f)分别转化啤酒酵母10S44Ccir°细胞株，用商品AUSRIA试剂盒检测细胞粗提物，筛选了酵母转化单克隆的培养物。细胞粗提物是通过将再悬浮于含0.5%吐温20，2mMPMSF和5%异丙醇的pBS中细胞破碎而制备的。六种用pRIT12845(a…f)分别转化的转化子中，各取一个检测。在六个被检的转化子中，有五个呈AUSRIA阳性反应。
为了确定用AUSRIA检测的S相关抗原性蛋白的大小，将上面描述的样品按实例20方法进行免疫吸印分析。在5个AUSRIA阳性的转化子中，有四个的S相关蛋白约39Kd，一个转化子(抽提物a)的S相关蛋白约23Kd，抽提液e中有39Kd蛋白表达的酵母转化子，其质粒定为pRIT12845，参见图18。
实例32PreS1-PreS2-S蛋白装配成颗粒，颗粒带有多聚人血蛋白的受体，在颗粒表面有PreS1的抗原决定簇。
用pRIT12845、pRIT12660或pRIT12377转化酵母菌10S44Ccir°，用pRIT12363转化酵母株DC5cir°，这些细胞的粗提物按实例19的方法制备。总蛋白质浓度，HBsAg相关抗原性及多聚人血清蛋白受体的测定按实例19的方法进行)。结果表明pRIT12843和pRIT12660(参见实例10)转化的10S44C.cir°细胞抽提液中，有强烈的多聚人血清蛋白结合活力，而在pRIT12377转化的10S44Ccir°细胞及pRIT12363转化的DC5cir°细胞抽提液中，不存在这种结合活力。
pRIT12845转化的10S44C cir°细胞粗提物进行氯化铯平衡离心(实例12描述)，用AUSRIA测定法测定氯化铯组分的HBsAg相关抗原性;表明抗原带在rho＝1.2g/cm3左右，氯化铯组分的免疫吸引分析证实了这一点。按实例12描述的方法，用ELISA测定法测定了氯化铯组分的Pre S1抗体结合活力。抗原结合到固相的HBsAg抗体上后，再与单克隆抗体MA18/7实例31)温育，然后按实例12所述方法，用生物素化的抗鼠免疫球蛋白，链抗生蛋白-生物素化的辣根过氧化物酶复合物及色原检测。
在氯化铯梯度上，发现PreS1专一性抗性体结合活力与HBsAg相关抗原性共平衡。这些结果表明pRIT12845转化的10S44Ccir°细胞产生的PreS1-PreS2-S蛋白装配成颗粒，与血清来源的22nmHBsAg颗粒一样。这些颗粒在表面暴露了PreS1专一性顺序作为多聚人血清蛋白的受体。从这些颗粒在AUSRIA试验中的活力水平以及PreS1-PreS2-S蛋白在免疫吸印分析中的反应强度，可以得出这样的结论在颗粒中，由于PreS1顺序的存在，颗粒的S蛋白决定簇被部分破坏。
实例33pRIT12845转化的酵母中表达了两个带有PreS1、PreS2和S蛋白抗原决定簇的蛋白，分子量约为38Kd和45Kd。
在pRIT12845转化的细胞中表达的HBsAg相关蛋白的单体，按实例20描述的方法分析。
比较了转化细胞蛋白质和人血清中纯化的HBsAg颗粒(血清型ad)的蛋白质迁移率和免疫反应性。(后者由联邦德国哥廷根大学医学微生物系W.H.Gerlich提供)。
蛋白质分析的三个免疫反应试剂-识别S蛋白抗原决定簇的单克隆抗体(由H.Thomas提供，见实例20)。
-合成的PreS2肽所诱导的多价抗血清(实例23描述)-对PreS1肽抗原决定簇专一的单克隆抗体MA18/7，由Heermann等人描述(J.Virol.52，396-402，1984)。
免疫吸印分析表明pRIT12845转化的10S44C细胞的蛋白质中，有两个对上面描述过的三种免疫反应试剂都有反应。这两个蛋白质分子量约为38Kd和45Kd，分子量测定以Heermann等人(J.Virol;52，396-402，1984)测血清HBsAg蛋白的迁移为基础。pRIT12845编码的38KdPreS1-PreS2-S蛋白比HBsAg颗粒的PPreS1-PreS2-S蛋白迁移稍快，人血清的HBsAg颗粒(ad血清型)上的P39蛋白质中PreS区域设想为119个氨基酸(Heermann等J.Virol.52，296-402，1984)而pRIT12845编码的PreS1区域为108个氨基酸。
上面的结果表明;pRIT12845转化的酵母细胞表达了两个蛋白质;分子量大约为38Kd和45Kd，它们带有PreS1，PreS2及S蛋白质的抗原决定簇。
实例3445Kd的PreS1-PreS2-S蛋白的种类中带有富含甘露糖类型的N-型糖苷键联接的寡糖链。
pRIT12845转化的细胞在等重的10mM磷酸钠缓冲液(PH7.4，含2%SDS，8mMEDTA)中，用等重的玻璃珠(直径为0.45-0.50mm)，在Vertex型混合器上搅拌分散。
离心后，上清液在100℃加热4分钟。
用40ml的25mM柠檬酸钠(PH5.0)稀释10μl煮沸过的上清液，再加入2μlEndoH(74μg/ml)(参见实例27)。加了和未加EndoH的样品在37℃温育2.5小时。
按实例20描述过的方法，将EndoH处理和未处理的样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫吸印分析。
印迹用单克隆抗体6(S蛋白专-)和MA18/7(PreS1肽专一)分析(参见实例33)。
用单克隆抗体6和MA18/7进行的免疫吸印分析表明;在EndoH处理时，45Kd的带消失而出现41Kd的带。38Kd带的迁移率不受EndoH处理的影响。
这些结果表明，45Kd的PreS1-PreS2-S蛋白以种类中带有一条富含甘露糖的N-型糖苷键联连结构的寡糖链。
实例3538Kd的PreS1-PreS2-S蛋白以亚胺键形式共价连接十四烷酸。
pRIT12845，pRIT12660或pRIT12377转化的酵母10S44Ccir°细胞株在YNB培养物中生长至0.D620nm为0.4。
20ml细胞培养物用1mCi的3H标记的十四烷酸(New England Nuclear)标记60分钟，然后离心收集。细胞用凉水洗涤，再悬浮在100ml 5mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.4，含3mMDTT，1% SDS，1mMPMSF)中，加入100mg玻璃珠，用Vortex型混合器剧烈搅拌六次，每次30秒钟，使细胞破裂，每次搅拌之间用冰浴冷却。在Eppendorf离心机5414上离心1分钟，除去碎片(Towler and Glaser，Proc，Natl Acad Sci 83，2812-2816，1986)，在室温下，20μl抽提物用7μl新配制的4M羟胺(pH10，含20mM甘氨酸)处理3.5小时。
羟胺处理及未处理的样品按实例26描述过的方法，进行SDS-聚丙烯酰胺电泳和荧光检测。没用羟胺处理的样品也按实例20描述的方法，用单克隆抗体6(识别S蛋白抗原决定簇)进行免疫吸印分析。
免疫吸印分析结果和实例20及实例33的结果相同。
荧光检测表明一个标记的38Kd蛋白带只存在于pRIT12845转化细胞的细胞抽提液中。这种标记对羟胺是稳定的，说明3H-十四烷酸的标记是以亚胺键形式存在的。pRIT12660转化细胞的抽提物中没有特异标记蛋白的检出。
这些结果表明38Kd的PreS1-S2-S蛋白上存在以亚胺键形式共价连接的十四烷酸。一般来说十四烷酸通过与氨基末端甘氨酸形成亚胺键而与蛋白质共价连接。这就表明起始的甲硫氨酸已经从PreS1-PreS2-S蛋白中除去，而位于第二位的甘氨酸残基就可以与十四烷酸起酰化反应。
实例36利用PreS1载体插入功能性DNA编码序列起始物为质粒pRIT12793 DNA(见前述实例31)。pRIT12793的一个495bp的NcoⅠ-XbaⅠ片段上包含了Pre S1-Pre S2编码序列。pRIT12793质粒DNA用NcoⅠ酶切后用T4DNA聚合酶补齐粘性末端，再用XbaⅠ内切酶消化，这个NcoⅠ/T4DNA聚合酶/XbaⅠ片段聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化后插入到经SmaⅠ和XbaⅠ酶消化的载体pUC12上，克隆载体pUC12可以从Amersham(Little Chalfont，Bucks，Unitted Kingdom)和pharmacia(Piscataway，NJ)购买。图5B表示质粒pRITX的构建过程。在质粒pRITX的Pre S1-Pre S2区域中，有一个单一NcoⅠ位点与Pre S1区域的ATG起始密码子重叠，有一个XbaⅠ位点在Pre S2肽C末端编码序列的TAA终止下游附近;有一个单一BstX位点靠近Pre S1肽N末端的编码区域。
有经验的人会知道，包含有PreS1-S2序列的载体pRITX或类似衍生载体上，通过在PreS1区的BstX位点的插入，能进一步引入功能性的DNA编码序列，以产生同框架融合的有意义肽段。
并且，功能性的DNA编码序列可以通过BstX与BamHI，或与EcoRI核酸内切酶的联合酶解pRITX或其衍生物而引入。功能性DNA编码序列在这些位点之间的插入，除去了大部分的PreS1编码区和PreS2末端的部分序列。这种融合将是PreS1-引入的功能DNA编码序列-PreS2区域类型的。一旦这种融合产生，它们可以重组到其它的质粒上，这些质粒包含PreS1-PreS2-S的剩余序列，和在大肠杆菌及啤酒酵母中保持和复制的必需序列，如在实例16A所示。
实例37HTLVⅢ病毒蛋白与PreS2-S序列中PreS2区域的肽融合产生新的杂种颗粒HBVPreS2-S编码序列中PreS2区域也可以用来插入或融合其它病毒抗原的肽段序列，这些病毒包括引起人类爱滋病的反转录病毒如已知的HIV，HTLV-Ⅲ或LAV病毒。
HIV病毒基因组的克隆已由RatnerL.等人(Nature，313，277-2841985)和ShawG等人(Science，226，1165-1171，1984)描述。从这个基因组的克隆中，可以得到各种亚片段作为功能性的DNA编码序列，它对应的有意义的肽区域融合到PreS2-S序列上形成新的杂种颗粒，这种颗粒带有HIV病毒蛋白质的抗原决定簇。这种杂种颗粒可以作为预防HIV感染的人用疫苗的基础。
下面例举的是许多有意义肽区的一部分。
a.C7肽这个肽区是紧靠着外壳蛋白前体排列位点的45个氨基酸延伸。由starcich.B.R.等人(Cell45，637-648，1986)定义。
b.肽121这个肽区是一些反转录病毒穿膜的外壳蛋白中相对保守的氨基酸顺序(参见CiancioloG.J.et，al(Scieme，230，453-455，1985)。这个顺序被认为参与了反转录病毒诱导的免疫抑制病理过程(Snyderman，R.andCiancislo，G.J.ImmunolToday，5.240，1984)。
C.Dressman肽是一个合成肽段，相当于HIV外壳糖蛋白前体的735-752位氨基酸顺序Kennedy，R.C.等人(Science，231，1556-15591986)用它来免疫兔子，兔的抗血清用于研究诱导的抗体对HIV外壳蛋白质的识别。结果表明这个区域能够诱导对天然糖蛋白的免疫应答。
A.从HTLV-Ⅲ中分离的C7肽DNA序列与PRIT10911PreS2-S区的融合。
起始物是质粒pBH10-R2，包含从BH10分离的HIV克隆的基因组。这个质粒由R.C.GallaNationalInstitutesofHealth，Bethesda，M.D)提供。一个从pBH10-R2中切下的病毒DNA来源的3108bpSalⅠ-XhoⅠ片段，克隆到pUC18中SalⅠ和XhoⅠ位点之间，得到质粒pRIT12901。这个SalⅠ-XhoⅠ位点之间，得到质粒pRIT12901。这个SalⅠ-XhoⅠ片段的限制性酶切图谱如图IB所示。质粒pUC18由NorranderJ.等人(Gene26，101-106，1983)描述，可从PharmaciaInc，Piscataway，N.J.购买。
为了产生这种融合，pPIT12901质粒DNA用BglⅡ和MboⅡ核酸内切酶消化，经丙烯酰胺凝胶电泳分离，电洗脱得到一117bp片段(参见图IB)。这个DNA片段用绿豆核酸酶处理除去单链延伸，再与pRIT10911质粒DNA连接(参见前面实例5)。pRIT10911先用BamHI核酸内切酶消化并用绿豆核酸酶处理过。从这个连接混和物中分离出质粒pRIT12893。在pRIT12893中，pRIT12901的BglⅡ-MboⅡ的117bp片段插入到pRIT10911上。测定了TDH3启动子和HTLV-Ⅲ的117bpBglⅡ-MboⅡ片段(绿豆核酸酶处理并插入pRIT12893上)融合联接区的核苷酸序列，发现这个片段BglⅡ位点末端多余的10个核苷酸被切除。联结区序列是5′ATGGAGGAGGAGATATGAGGGA3′这里，第一个划线的AGT密码子在来自pRIT10911质粒的TDH3启动子区域，第2个划线ATG密码在C7肽片段的内部。第2个ATG密码子与一个TGA终止密码重叠，这个终止密码与第一个ATG密码子阅读框相同。pRIT12893上融合区域3′末端DNA序列的测定表明MboⅡ-绿豆核酸酶处理的HTLV-Ⅲ片段的末端与pRIT10911上的PreS2序列的同框架融合的序列是正确的，如图2B所示。
再用HindⅢ核酸内切酶消化pRIT12893质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，电洗脱后得到-3250bp片段。这个3250bpHindⅢ片段再插入质粒YEp13的HindⅢ位点，得到质粒pRIT12894，这个质粒的DNA按Ito等人(引文在前面实例10方法转化到亮氨酸缺陷的酵母细胞株DC5和10S44C上。
pRIT12894的C7-PreS2-S融合DNA在酵母中转录，翻译，从TDH3的ATG密码子起始，到TGA密码子(上面的序列中划了线的)终止，将合成一个小的5肽，从第2个AGT密码子(在C7肽序列内部)起始将合成C7-PreS2-S融合肽。这个融合肽仅包含C7肽的38个氨基酸，而在完整的BglⅡ-MboⅡ-绿豆核酸酶处理的C7序列中包含45个氨基酸序列。值得重视的是从相同的连接混合物(与pRIT12893相同)恢复的其它质粒，能够测出来，并测定序列以确定它们是否带有完整的融合片段。
B.相当于肽121的DNA序列与pRIT10911的PreS2-S区的融合。
为了产生这种融合，用HhaⅠ和HindⅢ内切酶消化pRIT12901的DNA(见前面A部分)，得到一个230bp的片段，如图1B所示。这个片段经丙烯酰胺凝胶电泳强化，电洗脱后用T4DNA聚合酶补齐单链并延伸，这样处理和纯化的片段接到事先用BamHI消化并用绿豆核酸酶处理的pRIT10911 DNA上，从连接混合物中得到质粒pRIT12897。pRIT12897上，HIV DNA的230bp片段以正确阅读框插入pRIT10911上的Pre S2序列，形成融合物，如图3B所示。然后用HindⅢ内一切酶消化pRIT12897质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱后得到一个3365bp片段，它包含TDH3启动子，HIV-Pre S2-S融合物和ARG3终止子。这个3365bp片段连接到事先用HindⅢ消化过的质粒YEp13上，形成质粒pRIT12898，然后按Ito等人(引文在前面实例10上)方法，用质粒pRIT112898转化亮氨酸缺陷的酵母细胞株DC5和10S44C上。
C.相当于Dreesman肽的DNA序列与pRIT10911的Pres2区的融合。
按常规方法合成两条单键，再退火合成得到一个60bp的DNA片段，序列如下5′GATCTCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGA3′3′AGCTGTCCGGGCTTCCTTATCTTCTTCTTCCACCTCTCTCT5′5′GACAGAGACAGATCCCCG3′3′CTGTCTCTGTCTAGGGGCCTAC5′
这个片没有BglⅡ的5′及BamHⅠ的3′单链延伸，大约200ng的双链片段与300ng的BamHI酶消化的pRIT10911质粒DNA混合并连接。从这个连接混合物中鉴定并得到了质粒pRIT12899，在pRIT12899上，60bp的片段从BamHI位点插入pRIT10911，产生了一个同阅读框架的融合物，如图4B所示。用HindⅢ酶消化pRIT12899质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳纯化，电洗脱得到一个3200bpHindⅢ片段，这个HindⅢ片段插入YEp13的HindⅢ位点，产生质粒pRIT12900，然后接Ito等人方法，用pRIT12900质粒DNA转化亮氨酸缺陷的酵母细胞株DC5和10S44C。
实例38pRIT12894和pRIT12898编码的融合蛋白的表达。
质粒YEp13，pRIT12363，pRIT10912，pRIT12894或pRIT12898转化的酵母细胞株DC5或10S44C分别生长在缺乏亮氨酸的液体培养基(YNB+80μg/ml组氨酸或仅有YNB)。细胞蛋白质按实例11描述的方法进行免疫吸印分析，用识别对变性和还原有抗性的人HBsAg上的抗原决定簇的单克隆抗体作为第一抗体(单克隆抗体6由英国伦敦皇家免费医院的H.Thomas提供)。质粒pRIT10912在前面实例5已经描述，pRIT12894和pRIT12898在前面实例37已经描述。pRIT12363带有HBV的S基团，融合到来自插入到一个酵母载体质粒的pRIT12377(实例10，前面部分B)，即pRIT12322(实例8)的2800bpHindⅢ片段上的TDH3启动子。在TDH3启动子控制下，产生HBsAg。
免疫吸印分析表明用pRIT12894转化的酵母细胞株DC5或10S44C的总细胞蛋白中，有一个S相关蛋白，分子量约为32Kd。用pRIT12898转化时，S相关蛋白约为45Kd，而pRIT10912转化DC5时，S相关蛋白分子量约为29Kd。
质粒pRIT12363，pRIT10912或pRIT12894转化的酵母细胞株DC5的粗提液按实例12描述的方法制备。蛋白质浓度和AUSRIA活力也按实例12描述的方法测定。这些粗提液按上面描述的方法进行免疫吸印分析。
这些粗提物经氯化铯平衡离心(按实例12描述的方法)，用AUSRIA测定法测定氯化铯各组分的HBsAg相关抗原性，结果表明抗原带在rho＝1.2g/cm3左右。这一点也被氯化铯各组分的免疫吸印分析所证实。
这些结果表明pRIT12894转化的酵母细胞株DC5产生的32Kd融合蛋白质，装配成与人血清来源22nmHBsAg一样的颗粒。从用AUSRIA试剂盒测定的这些颗粒的活力水平以及在免疫吸印分析中32Kd蛋白的反应强度，可以得到结论C7肽顺序的存在，引起了颗粒上S蛋白决定簇的部分妨碍和破坏。
从这些结果可以得到结论将pRIT12894或pRIT12898转化到酵母细胞株DC5或10S44C上，相应地专一性合成32Kd和45Kd蛋白，它们都带有S蛋白抗原决定簇。
有经验的人会知道，从pRIT12894和pRIT12898和pRIT12900转化的酵母细胞培养物中，可以用常规的方法抽提和纯化带有HIV病毒肽段抗原决定簇的杂种颗粒。这种纯化的颗粒可以加上佐剂如氯氧化铝或磷酸铝制备成人用疫苗。推荐的剂量为1-1000μg蛋白，可用常规试验确定。这里例举的发明，包括了带有有意义的HIV抗原决深簇的杂种颗粒，它来自于HIV病毒蛋白其它肽区序列与HBVPreS2-S区编码序列的融合，这一点也是可以理解的。
权利要求
1.一种制备转化的真核宿主细胞的方法，该方法包括用一载体转化真核宿主细胞，这种载体是一重组的DNA分子与一调节区相连接构成，调节区包含有一功能性的DNA编码序列，这一序列同相位的与HBV的Pre S2-S蛋白的Pre S2-S区的蛋白相融合。这里的功能性的DNA编码序列还可编码疟原虫(Plasmodium)的环状体蛋白，或HIV包膜基因序列如HIV C7蛋白，HIV肽121蛋白或HIV Dreesman肽。
2.权利要求1的方法，其中宿主是酵母细胞。
3.权利要求2的方法，其中宿主属于酵母属(genus Saccharomyces)
4.权利要求3的方法，其中宿主属于啤酒酵母属(Saccharomyces cerevisiae)或卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)。
5.权利要求4的方法，其中宿主是DC5、DC5 cir°，10S44C或10S44C Cir°菌株。
6.一制备带有乙型肝炎表面扩原蛋白(HBsAg)杂种颗粒的方法，该杂种颗粒包含和/或存在有由功能性DNA编码序列编码的一种肽，该方法包括用适当的培养基培养用载体已转化的真核宿主细胞和从细胞裂解物或这种宿主培养物的提取物中分离此颗粒物质，其中所述载体是一重组的DNA分子与一含有功能性DNA编码序列同相位与HBV的Pre S2-S蛋白序列中的Pre S2区部分相融合的调节区相连接构成，这里的功能性DNA编码序列还可编码疟原虫的环状体蛋白，或HIV的包膜基因序列。如HIV C7蛋白，HIV肽121蛋白，或HIV Dreesman肽。
7.制备转化的宿主细胞的方法，包括用HBV的Pre S1蛋白编码区转化宿主细胞。HBV的Pre S1蛋白编码如下的氨基酸顺序-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln Ala
8.权利要求7的方法，其中该编码是由重组的DNA载体构成。
9.权利要求7的方法，其中宿主是酵母细胞。
10.权利要求9的方法，其中宿主属于酵母属。
11.一种制备蛋白的方法，该蛋白是由权利要求7所述的Pre S1蛋白编码区编码的，该方法包括用适当的培养基培养用该区转化的宿主细胞和从细胞裂解物或这种宿主培养物的提取物中分离此蛋白质。
12.一种制备转化的宿主细胞的方法。它包括用HBV的Pre S2蛋白编码区或HBV Pre S2-S蛋白编码区转化宿主细胞，其中Pre S2蛋白部分编码如下的氨基酸顺序Thr-55 -50 orMet-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp--40 -30Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser--20Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser--10Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn
13.权利要求12的方法，其中该编码区是由重组DNA载体组成。
14.一种制备由权利要求12的Pre S2或Pre S2-S蛋白编码区编码的蛋白的方法，它包括用适当的培养基培养用该编码区转化的宿主细胞和从细胞裂解物或这种宿主培养物的提取物中分离此蛋白质。
15.一种制备由权利要求12所述的Pre S2-S蛋白编码区编码的颗粒的方法，它包括用适当的培养基培养用该编码区转化的宿主细胞和从细胞裂解物或这种宿主培养物的提取物中分离此蛋白质。
16.一种制备转化的酵母细胞的方法，它包括用由Pre SlPre S2-S蛋白编码顺序与一调节区相连接的重组DNA载体来转化酵母宿主细胞。
17.一种制备由Pre S1-Pre S2-S蛋白编码序列编码蛋白的方法，它包括用适当的培养基培养用Pre S1-Pre S2-S蛋白编码序列与一调节区相连接的重组DNA载体转化的酵母细胞和从细胞裂解物或这种宿主培养物的提取物中分离蛋白质。
18.一种制备含有由Pre S1-Pre S2-S蛋白编码序列编码的多肽组成的颗粒的方法，它包括用适当的培养基培养用由Pre S1-Pre S2-S蛋白编码序列与一调节区相连接组成的重组DNA载体转化的酵母细胞和从细胞裂解物或这种宿主培养物的提取物中分离此颗粒。
19.一种制备转化的酵母细胞的方法，它包括用由如下的Pre S1-S2蛋白编码序列与一调节区相连结构成的重组DNA载体转化酵母宿主细胞。Pre S1区-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Ieu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln AlaPre S2区-55ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAAMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GlnGCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTGAla Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly LeuTAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGATyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser GlyACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCTThr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala SerCAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHis Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GlyGAC CCT GTG ACG AACAsp Pro Val Thr Asn
20.一种制备由权利要求19所述Pre S1-Pre S2蛋白编码区编码的蛋白的方法。
21.一由一功能性的DNA编码序列同相位的与HBV的Pre S2-S蛋白质编码序列的Pre S2区部分相连接组成的重组DNA分子。其中功能性的DNA编码区含有Pre S2编码序列，Pre S1编码序列或完整的Pre S1-Pre S2编码序列，疟原虫的环状体蛋白质编码序列，或HIV的编码序列，如HIV的包膜(蛋白)基因序列如HIV的C7蛋白质编码区，HIV肽121编码区或称HIV Dreesman肽编码区。
22.一由一重组DNA分子与一调节区相连接构成的重组载体。其中DNA分子含有一功能性的DNA编码序列，且这一编码序列同相位的与HBV Pre S2-S蛋白编码序列中的Pre S2区部分相融合，而调节区中含有TDH3启动子。
23.一由一重组DNA分子与一调节区相连接组成的重组载体。其中DNA分子含有一功能性的DNA编码序列，这一编码序列同相位的与HBV的Pre S2-S蛋白编码区中的Pre S2区部分相融合。其中功能性的DNA编码序列含有Pre S2编码序列，Pre S1编码序列或完整的Pre S1-Pre S2编码序列，疟原虫的环状体蛋白编码序列，或HIV的编码序列如HIV的包膜(蛋白)基因序列，如HIV C7蛋白，HIV肽121蛋白或称HIVDreesman肽。
24.含有一个192碱基对的Sau 3A酶切片段的权利要求23的载体，这一片段编码恶性疟原虫(P.faliciparum)的环状体(CS)蛋白中的16个四肽重复序列，上述片段可以从包含有恶性疟原虫环状体蛋白编码序列的WR201质粒中的StuⅠ-RSaⅠ片段用Sau 3A酶解再减去前头52个碱基对衍生而来。
25.包含额外环状体蛋白DNA的Sau 3A酶解片段的权利要求24的载体。
26.一包含与一调节区相连接的重组DNA分子的重组载体。其中DNA分子含有一功能性的DNA编码序列，并与HBV的Pre S2-S蛋白编码序列中的Pre S2区部分同相位相连。其中功能性DNA编码序列含有全部的或部分的Pre S2蛋白编码序列。
27.权利要求26的载体中的功能性的DNA编码序列具有如下的氨基酸编码序列PRE-S2区-55ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAAMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GlnGCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTGAla Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly LeuTAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGATyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser GlyACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCTThr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala SerCAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHis Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GlyGAC CCT GTG ACG AACAsp Pro Val Thr Asn.
28.权利要求26的载体中的功能性DNA编码序列包含全部或部分Pre S1-Pre S2蛋白编码序列。
29.权利要求28的载体中的功能性DNA编码序列编码如下的氨基酸序列PRE-S1区-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln AlaPRE-S2区-55ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAAMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GlnGCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTGAla Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly LeuTAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGATyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser GlyACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCTThr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala SerCAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHis Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GlyGAC CCT GTG ACG AACAsp Pro Val Thr Asn.
30.一用重组载体转化的真核生物宿主细胞，其中所说的载体是指权利要求25的载体。
31.权利要求30所说的宿主是一酵母细胞。
32.制备含有乙型肝炎表面扩原(HBsAg)蛋白的杂种颗粒的方法，杂种蛋白中包含有或存在有功能性DNA编码序列所编码的肽，制备方法包括用适当的培养基培养用载体已转化的真核宿主细胞和从细胞裂解物或这种宿主培养物的提取物中分离颗粒物质，其中所说的载体是指权利要求25的载体。
33.用权利要求32的方法制备的一种颗粒。
34.包含有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白的杂种免疫颗粒，其中所说的颗粒中含有或存在有功能性DNA所编码的肽。
35.由权利要求34所述的颗粒组成的疫苗，这种疫苗含有一定量的胶粒，具有免疫保护作用。
36.由权利要求34所述颗粒和多价吸附剂组成的一种胶粒。
37.由权利要求36所述的胶粒组成的疫苗，这种疫苗含有一定量的胶粒，具有免疫保护作用。
38.HBV的Pre S1蛋白编码区编码如下的氨基酸序列-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln Ala
39.一由权利要求38所述的Pre S1蛋白编码区与一调节区相连接而组成的重组DNA载体。
40.一含有权利要求38所述的Pre S1蛋白编码区的转化宿主细胞。
41.由权利要求38所述的Pre S1蛋白编码区编码的蛋白质。
42.由权利要求38所述的Pre S1蛋白编码区编码的一定量蛋白组成的具有免疫保护作用的疫苗。
43.HBV的Pre S2蛋白编码区或HBV Pre S2-S蛋白编码区，其中Pre S2部分编码如下的氨基酸序列Thr-55 -50 orMet-Gln-Trp-Asn-Ser-Thr-Ala-Phe-His-Gln-Ala-Leu-Gln-Asp--40 -30Pro-Arg-Val-Arg-Gly-Leu-Tyr-Phe-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Ser--20Gly-Thr-Val-Asn-Pro-Ala-Pro-Asn-Ile-Ala-Ser-His-Ile-Ser--10Ser-Ser-Ser-Ala-Arg-Thr-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Asn
44.一由权利要求43所述的Pre S2或Pre S2-S蛋白编码区与一调节区相连接构成的重组DNA载体。
45.一包含权利要求43所述的Pre S2或Pre S2-S蛋白编码区的转化宿主细胞。
46.由权利要求43所述的Pre S2或Pre S2-S蛋白编码区编码的蛋白。
47.由权利要求43所述的Pre S2或Pre S2-S蛋白编码区编码的一定量蛋白组成的具有免疫保护作用的疫苗。
48.一由权利要求43所述的Pre S2-S蛋白编码区编码的蛋白组成的颗粒。
49.由权利要求43所述的Pre S2-S蛋白编码区编码的、一定量颗粒组成的具有免疫保护作用的疫苗。
50.一种由权利要求48所述的颗粒和多价吸附剂组成的胶团。
51.由权利要求50所述的一定量的胶团组成的具有免疫保护作用的疫苗。
52.一由Pre S1-Pre S2-S蛋白编码序列与一调节区相连接构成的重组DNA载体。其中Pre S1-Pre S2部分编码下列氨基酸序列PRE-S1区-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln AlaPRE-S2区-55ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAAMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GlnGCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTGAla Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly LeuTAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGATyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser GlyACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCTThr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala SerCAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHis Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GlyGAC CCT GTG ACG AACAsp Pro Val Thr Asn
53.一被权利要求52所述的载体转化的酵母宿主细胞。
54.由权利要求52的载体上的Pre S1-Pre S2-S序列编码制备的蛋白。
55.由权利要求54所述的一定量的蛋白组成的具有免疫保护作用的疫苗。
56.一由Pre S1-Pre S2-S蛋白编码区编码的蛋白组成的颗粒。
57.由权利要求56所述的一定量颗粒组成的具有免疫保护作用的疫苗。
58.一由权利要求56所述的颗粒和多价吸附剂组成的胶团。
59.由权利要求58所述的一定量胶团组成的具有免疫保护作用的疫苗。
60.Pre S1-Pre S2蛋白编码序列含有如下的氨基酸序列Pre S1区-163ATG GGG ACG AAT CTT TCT GTT CCC AAC CCT CTGMet Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro LeuGGA TTC TTT CCC GAT CAT CAG TTG GAC CCTGly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp ProGCA TTC GGA GCC AAC TCA AAC AAT CCA GATAla Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro AspTGG GAC TTC AAC CCC ATC AAG GAC CAC TGGTrp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His TrpCCA GCA GCC AAC CAG GTA GGA GTG GGA GCAPro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly AlaTTC GGG CCA GGG CTC ACC CCT CCA CAC GGCPhe Gly Pro Gly Ieu Thr Pro Pro His GlyGGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAGGly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala GlnGGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCTGly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile ProCCT CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGAPro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyAGG CAG CCT ACT CCC ATC TCT CCA CCT CTAArg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro LeuAGA GAC AGT CAT CCT CAG GCCArg Asp Ser His Pro Gln AlaPre S2区-55ATG CAG TGG AAT TCC ACT GCC TTC CAC CAAMet Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His GlnGCT CTG CAG GAT CCC AGA GTC AGG GGT CTGAla Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly LeuTAT TTT CCT GCT GGT GGC TCC AGT TCA GGATyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser GlyACA GTA AAC CCT GCT CCG AAT ATT GCC TCTThr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala SerCAC ATA TCG TCA AGC TCC GCG AGG ACT GGGHis Ile Ser Ser Ser Ser Ala Arg Thr GlyGAC CCT GTG ACG AACAsp Pro Val Thr Asn
61.一由权利要求60所述的Pre S1-Pre S2蛋白编码序列与一调节区相连接构成的重组DNA载体。
62.一被权利要求61所述载体转化的酵母宿主细胞。
63.由权利要求60所述的Pre S1-Pre S2蛋白编码区编码的蛋白。
64.一种由权利要求60所述的由Pre S1-Pre S2蛋白编码区编码的一定量的蛋白组成的具有免疫保护作用的疫苗。
65.一由Pre S1功能性的DNA编码序列-Pre S2-S蛋白质编码序列与一表达控制序列相连接构成的重组DNA载体。
66.一被权利要求65所述的载体转化的酵母宿主细胞。
67.由权利要求66所述宿主表达的蛋白质。
68.由权利要求67所述的一定量的蛋白组成的具有免疫保护作用的疫苗。
全文摘要
本发明涉及乙型肝炎病毒抗原和含有这些抗原的杂种抗原，以及利用DNA重组技术将上述抗原的编码基因克隆到酵母中。上述抗原对制备疫苗，如乙型肝炎病毒疫苗或疟疾疫苗，是很有价值的。
文档编号C12N1/16GK1031395SQ8810048
公开日1989年3月1日 申请日期1988年1月30日 优先权日1987年1月30日
发明者特里萨·卡贝桑, 米歇尔·德怀尔德, 杂杰尔·哈福德 申请人:史密斯克兰-Rit公司