制备、分离及超低温保存子宫内膜/月经细胞的制作方法

专利名称：制备、分离及超低温保存子宫内膜/月经细胞的制作方法
技术领域：
本案主张美国临时申请案2007年3月I日申请的第60/904，836，2007年3月20日申请的第60/918，961号，2007年9月17日申请的第60/994，166号，2007年10月9日申请的第60/998，255号，2008年I月22日申请的第61/011，881号及2008年2月29日申请的第—号的优先权，前述姆一案的名称为"Procurement, Isolation, and Cryopreservationof Endometrial/Menstrual Cells"其整体内容系以引用方式并入本文。本发明通常涉及关于获得月经干细胞(MSC)的方法、制程及系统。本发明尤其涉及关于取得及处理月经期间所获得的血液、体液及组织以分离及收集月经干细胞群的方法、制程及系统，这些月经干细胞可经超低温保存或经由各种培养及选择步骤进ー步处理以获得为超低温保存或为治疗或药妆用途作准备的MSC。本发明还涉及关于包含至少ー个月经干细胞的相关组合物。
背景技术：
干细胞固有地具有经由控制细胞与细胞接触及内在信号而经历活体内细胞分裂及细胞分化的能力。已显示干细胞能藉由经局部环境因子刺激来控制细胞接触及内在信号而活体外分裂及分化成多种细胞。应了解，干细胞可获自若干来源，包括多种成人组织(诸如骨髄)以及胚胎组织。某些干细胞表达为c-kit受体、青灰因子(Steel factor)受体及干细胞因子受体的抗原因子CD117。c-kit的基因编码干细胞因子(SCF)的酪胺酸激酶生长因子，其亦称为肥大细胞生长因子且为血细胞生成、黑素生成及生育力所必需。应了解，⑶117在造血干细胞、肥大细胞、生殖细胞、黑素细胞、某些基底上皮细胞、乳房的腔室上皮细胞及胃肠道的Cajal间质细胞中表达。⑶117在生殖细胞确立、維持及功能方面具有关键作用。研究指示在胚胎性腺中，CD117及其相应配位体SCF为原胚生殖细胞存活及増殖所必需。另外，研究指示CD117及其相应配位体SCF为响应促性腺激素产生配子所必需。换言之，与配位体SCF组合的CD117为睾丸生殖细胞、精原细胞的存活和増殖以及为卵母细胞的生长和成熟所必需。研究还指示⑶117为活体外原始造血细胞増殖的有效生长因子。干细胞的治疗应用以骨髓的早期实验起始。近一个世纪前，医师将骨髓经ロ投于患有贫血及白血病的患者。尽管该疗法并不成功，但实验室研究者最终证实可以将取自其它小鼠的骨髓输注至具有缺陷性骨髄的小鼠的血流中而使其恢复健康。这促使医师推测将骨髓自一人移植至另一人(同种异体移植)是否可行。来自骨髓及脐带的干细胞已广泛地主要用于造血移植以治疗多种疾病。自利用骨髄的第一干细胞移植出发，已鉴别出干细胞的其它来源，包括羊水、胎盘、脐带、带内膜、花顿氏胶(Wharton' s Jelly)、脂肪及上皮细胞。
当研究者遇到由细胞的身体排斥反应(稍后表征为移植物抗宿主疾病(GVHD))所引起的疾病及/或死亡时，人类免疫系统的作用，亦即防卫本身免受感染及外来物质的身体固有机制，成为早期移植中的关键考虑因素。直至发现人类组织兼容性抗原与人类免疫系统之间的关系之后才以较大規模尝试在人类中进行骨髄移植。体内大多数细胞表面上所发现的这些蛋白质被称为人类白血球抗原或HLA抗原。身体免疫系统使用这些HLA抗原以鉴别哪些细胞属于体内且哪些不属干。每当免疫系统不识别细胞上的抗原时，其即产生抗体及破坏细胞的其它物质。身体寻找且破坏的对象为致感染细菌、病毒、肿瘤细胞及外来对象(诸如碎片)。以此方式，免疫系统防卫身体抵抗可进入体内且引起损害的物质。视治疗所靶向的疾病病况而定，利用个体自身干细胞的自体移植可具有由准确HLA匹配效益所产生的某些潜在优势。供体与受体的HL A抗原匹配愈接近，所捐赠骨髄的T细胞(免疫系统细胞)将反抗患者身体的可能性愈小。
来源于骨髓的成人干细胞的移植已成功用于治疗人类疾病，诸如范康尼氏贫血(Fanconi / s Anemia)、再生障碍性贫血、急性及慢性白血病、脊髓增生性病症、骨髄发育不良症候群、淋巴增生性病症及其它恶性疾病。骨髄成人干细胞的替代性来源包括外周血液祖细胞、脐带血及自这些来源收集的间质干细胞。然而，存在与成人干细胞的治疗用途相关的若干缺点。已显示成人干细胞具有有限功效，诸如在培养中的若干继代后生长缓慢及多能性损失。胚胎干细胞已证实増殖潜力使其适合于细胞疗法。然而，已显示人类胚胎干细胞产生畸胎瘤。另外，自胚胎收集干细胞部分由于在收集过程中破坏生长中的胚胎而受到伦
通关注。已鉴别干细胞的其它来源，其克服至少ー些与成人及胚胎干细胞相关的问题。ー种来源为含有人类成人干细胞的脐带血。脐带血已出于若干原因而证实为干细胞的可行来源。脐带血相对容易在分娩小孩期间取得且经处理以供超低温保存。脐带血提供能细胞分裂及分化成多种细胞类型的干细胞的合适来源。来源于脐带血的干细胞已在临床背景下使用以作为骨髓替代者来治疗若干已知人类病症及疾病。详言之，来源于脐带血的干细胞已成功用于造血移植、造血重建及治疗脊髓损伤。另外，已显示来源于脐带血的干细胞在动物模型中逆转中风及心肌梗塞的效应。已确定子宮内膜/月经干细胞(MSC)证实在培养物中与胚胎干细胞类似的増殖能力。MSC亦展现某些间质干细胞标记及某些胚胎干细胞标记，其证实活体外及活体内多能性能力的潜力。MSC用作干细胞来源出于若干原因系有益的。首先，MSC证实分化成特定细胞谱系的能力。其次，任何伦理关注或考虑因素系藉由收集另外视为废弃的MSC而得以缓和。最后，在月经周期期间取得MSC的制程对供体相对不赋予危险性。相信，不存在关于收集MSC抑或取得合适样本量的MSC的已知方法，及适用于获得表现某些间质干细胞标记及/或某些胚胎样抗原因子(尤其由MSC表现的细胞表面因子)的活的、最大产量MSC的相关处理及细胞收集方法。因此，目前需要收集合适量的存在于月经期间排出的体液、血液及组织中的MSC以为即期运送至实验室作准备的方法，该实验室处理月经体液、血液及组织以分离及超低温保存或处理MSC。目前亦需要处理月经体液、血液及组织以获得来源于月经血液、体液及组织的MSC的细胞制剂的方法。亦进ー步需要自月经流分离、选择及/或培养MSC以为超低温保存、进ー步处理或治疗用途作准备，诸如，可表现包含⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I类的细胞表面标记或细胞内标记中的至少ー者，而表现较低量或不表现细胞标记CD3及HLA II类中的至少ー者的细胞。其它细胞标记特征系以实施本发明的实施例的结果提供。更进一歩需要超低温保存获得及收集自月经血液、体液及组织的MSC或特异性MSC的群。

发明内容
目前需要易于收集、处理及超低温保存且具有治疗、药妆或其它用途的潜力的干细胞来源。本发明的方法、制程及组合物满足此需要。本发明提供获得月经干细胞的方法。在一实施例中，该方法包含自月经期间所收集的月经流分离月经干细胞的步骤。自月经流分离月经干细胞的步骤包含以离心、密度梯度离心、过滤或沉降的至少ー个步骤处理该月经流。分离月经干细胞的步骤亦可视情况包
含以包含至少ー种抗生素的溶液净化该等月经干细胞。在该实施例中，该方法包含处理分离自月经流的月经干细胞的另一步骤。处理分离自月经流样本的月经干细胞的步骤可包含至少ー个以下步骤针对某些细胞表面标记选择月经干细胞，或培养来自月经干细胞的处理后样本、所选样本或解冻样本的月经干细胞。在一实施例中，处理分离自月经流的月经干细胞的步骤包含针对至少ー种包含CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD 166 及 HLA I 类的细胞标
记选择月经干细胞的步骤。所选细胞可藉由培养月经干细胞来进ー步处理。可接着使所培养的月经干细胞经受针对至少ー种包含⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I类的细胞标记选择月经干细胞的又一步骤。可使所选月经干细胞经受培养该等月经干细胞的又ー步骤。在选择或培养月经干细胞的步骤之后的任ー时亥IJ，可使该等月经干细胞经受制备供超低温保存或供治疗或药妆用的月经干细胞的步骤。可接着将已准备超低温保存的月经干细胞超低温保存且稍后解冻以供使用。在另ー实施例中，处理自月经流分离的月经干细胞的步骤包含培养月经干细胞。可接着使所培养的月经干细胞经受针对某些细胞表面标记选择月经干细胞的步骤。可接着使所选月经干细胞经受培养该等月经干细胞的又ー步骤。可接着使进ー步培养的月经干细胞经受针对细胞标记选择月经干细胞的另ー步骤。在选择或培养月经干细胞的步骤之后的任ー时刻，可使该等月经干细胞经受制备供超低温保存或供治疗或药妆用的月经干细胞的步骤。可接着将已准备超低温保存的月经干细胞超低温保存且稍后解冻以供使用。在又一实施例中，处理自月经流分离的月经干细胞的步骤包含超低温保存月经干细胞的步骤。在另ー实施例中，处理月经干细胞的步骤包含制备包含月经干细胞及维持月经干细胞的生存力的细胞培养基的组合物的又一步骤。在又一实施例中，处理月经干细胞的步骤包含制备包含月经干细胞及药妆制剂的组合物的又一步骤。在又一实施例中，可将经超低温保存的月经干细胞解冻以为进一步处理作准备，该进ー步处理包含培养或选择月经干细胞的至少ー个步骤。或者，可将经超低温保存的月经干细胞解冻以为治疗或药妆用途作准备。
本发明亦提供自月经流收集月经干细胞的制程。在一实施例中，该制程包含在月经周期期间取得月经流，将该月经流输送至处理设施中，将月经干细胞自月经流分离成细胞制剂，及处理月经干细胞的细胞制剂。本发明亦提供自月经流收集月经干细胞的系统。在一实施例中，该系统包含一月经干细胞分离器，其中月经干细胞分离器将月经干细胞自月经流分离；一月经干细胞收集器，其中该月经干细胞收集器收集月经干细胞；及一月经干细胞处理器，其中该月经干细胞处理器制备供治疗用或供超低温保存的月经干细胞。本发明提供超低温保存月经干细胞的方法。在一实施例中，该方法包含以下步骤自月经期间所收集的月经流分离月经干细胞，收集自月经流分离的月经干细胞，及超低温保存自月经流分离的月经干细胞。包括自月经流分离月经干细胞的步骤的超低温保存月经干细胞的方法包含由离心、密度梯度离心、过滤或沉降的至少ー个步骤处理月经流。分离月经干细胞的步骤亦可视 情况包含以包含至少ー种抗生素的溶液净化该等月经干细胞。该方法可包含在至少ー个超低温保存或进ー步细胞培养的步骤之前的至少ー个针对细胞标记选择月经干细胞的步骤。该方法可包含至少又ー培养所选月经干细胞的步骤。包括收集自月经流分离的月经干细胞的步骤的超低温保存月经干细胞的方法包含至少ー个培养月经干细胞的步骤。该方法可包含至少ー个自细胞培养物选择月经干细胞的步骤。本发明提供藉由包含以下步骤的制程所获得的月经干细胞的群自月经期间所收集的月经流分离月经干细胞及收集自月经流分离的月经干细胞。本发明提供富集自月经流所收集的月经干细胞群的制程。在一实施例中，该制程包含自月经期间所收集的月经流分离月经干细胞及收集自月经流分离的月经干细胞的步骤。该制程包含至少ー个针对包含 CD9、CD 10、CD 13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、⑶105、⑶166及HLA I类的群的至少ー个细胞标记选择月经干细胞的步骤。该制程可包含至少ー个培养月经干细胞的步骤。该制程可包含至少ー个选择月经干细胞的步骤及至少ー个培养所选月经干细胞的步骤。分离月经干细胞的步骤亦可视情况包含以包含至少ー种抗生素的溶液净化该等月经干细胞。在替代者中，该制程可包含至少ー个培养月经干细胞的步骤及至少ー个自细胞培养物选择月经干细胞的步骤。本发明提供富集月经干细胞群的制程。在一实施例中，该制程包含以下步骤自月经流分离月经干细胞，收集自月经流分离的月经干细胞及选择表现与MSC相关的细胞标记的月经干细胞。本发明提供包含细胞标记中的至少ー者的月经干细胞群，该等细胞标记包含⑶9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD 166 及 HLA I 类。本发明提供包含月经干细胞的细胞富集群，该等月经干细胞表现包含⑶9、⑶10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 类的细胞标记中的至少一者，且较低表现或不表现包含细胞标记⑶3及HLAII类中的至少ー者的细胞标记。本发明提供包含至少ー个月经干细胞及超低温保存剂的组合物。本发明提供包含至少ー个月经干细胞及细胞培养基的组合物。本发明提供包含至少ー个月经干细胞及药妆剂的组合物。
本发明提供包含至少ー个月经干细胞及维持细胞生存力的保存剂的组合物。本发明提供包含至少ー个月经干细胞及细胞培养基的组合物，其系于容器中以为该至少一个月经干细胞的治疗用途作准备。
根据本发明所收集的细胞可在治疗、药妆或再生医学或其它合适应用中使用。本发明提供以下方法及制程收集包含月经血液、体液、细胞及组织的月经流的至少ー个样本；藉由将月经流样本与收集培养基组合来制备供输送用的月经流；及将该月经流样本输送至处理设施中，在此处理月经流样本以分离、收集及处理供超低温保存或供治疗或药妆用的MSC。本发明亦提供以产生高产量的活MSC的方式分离、收集及浓缩MSC的方法及制程。
在一实施例中，选择月经干细胞的步骤可包括阳性选择表现与月经干细胞一起存在的细胞标记中的至少ー者的细胞。在一替代者中，选择月经干细胞的步骤可包含藉由移除表现不与月经干细胞一起存在的细胞标记的不合需要细胞来阴性选择细胞。阴性选择可包含选择表现(例如)CD45或不存在于月经干细胞上的其它细胞表面标记的细胞。在又一实施例中，选择月经干细胞的步骤可包含使用市售耗尽或浓缩套组，诸如来目 btem Cell i'echnologies, Inc.的 RosetteSep、Easybep、Robobep > btemSep 或SpinSep0在又一实施例中，选择月经干细胞的步骤可包含使用ALDEFLUOR (Aldagen, Inc.)选择月经干细胞以选择MSC且排除无完整细胞膜的死亡及/或濒死细胞。ALDEFLUOR 套组可用于选择对与月经干细胞一起存在的表面标记呈阳性的ALDHblr细胞、谱系-抗原阴性(LirT)细胞、群落形成细胞、长期培养起始细胞及N0D/SCID再生细胞。在又一实施例中，选择月经干细胞的步骤可包含使该等月经干细胞经受血清脱除历时约2周至约4周以浓缩表现相关MSC标记的MSC。一旦收集且培养细胞，即应消除造血干细胞。


图I为一般说明本发明的总体方法及制程的流程图；图2为展示收集及超低温保存月经干细胞的本发明的一实施例的流程图；图3为展示收集及超低温保存月经干细胞的本发明的另ー实施例的流程图；图4为展示收集及超低温保存月经干细胞的本发明的另ー实施例的流程图；图5为展示收集及超低温保存月经干细胞的本发明的又一实施例的流程图；图6为展示收集及超低温保存月经干细胞的本发明的又一实施例的流程图；图7为展示收集及超低温保存月经干细胞的本发明的又一实施例的流程图；图8为展示收集及超低温保存月经干细胞的本发明的又一实施例的流程图；图9为展示收集及超低温保存月经干细胞的本发明的另ー实施例的流程图；图10为展示收集及超低温保存月经干细胞的本发明的又一实施例的流程图；图11为展示收集月经干细胞及制备供治疗用的月经干细胞的本发明的一实施例的流程图；图12为展示收集月经干细胞及制备供治疗用的月经干细胞的本发明的又ー实施例的流程图；图13为展示收集月经干细胞及制备供治疗用的月经干细胞的本发明的又ー实施例的流程图；图14为展示收集月经干细胞及制备供治疗用的月经干细胞的本发明的又ー实施例的流程图；图15为展示收集月经干细胞及制备供治疗用的月经干细胞的本发明的又ー实施例的流程
图16为展示收集月经干细胞及制备供治疗用的月经干细胞的本发明的另ー实施例的流程图；图17为展示收集月经干细胞及制备供治疗用的月经干细胞的本发明的另ー实施例的流程图；图18为展示收集月经干细胞及制备供治疗用的月经干细胞的本发明的又ー实施例的流程图；图19为展示收集月经干细胞及制备供治疗用的月经干细胞的本发明的另ー实施例的流程图；图20为展示解冻超低温保存的月经干细胞以为治疗用途作准备的本发明的ー实施例的流程图；图21为展示制备供治疗用的经超低温保存的月经干细胞的本发明的另ー实施例的流程图；图22为展示制备供治疗用的经超低温保存的月经干细胞的本发明的另ー实施例的流程图；图23为展示制备供治疗用的经超低温保存的月经干细胞的本发明的又一实施例的流程图；图24为展示制备供治疗用的经超低温保存的月经干细胞的本发明的又一实施例的流程图；图25为展示制备供治疗用的经超低温保存的月经干细胞的本发明的又一实施例的流程图；图26为展示制备供治疗用的经超低温保存的月经干细胞的本发明的又一实施例的流程图；图27为展示制备供治疗用的经超低温保存的月经干细胞的本发明的另ー实施例的流程图；图28为展示制备供治疗用的经超低温保存的月经干细胞的本发明的又一实施例的流程图；图29a至图29j展示处理后样本及关于如下所述的M2-01的同型的流式细胞仪分析的結果。自M2-01收集约Iml细胞悬浮液形式的处理后样本且将其置于分析管中以供流式细胞仪分析。结果指示占TNC群O. 4%的⑶117+细胞的浓度、占TNC群17. 7%的⑶44+细胞的浓度、占TNC群3. 6%的⑶166+细胞的浓度、占TNC群8. 0%的⑶105+细胞的浓度、占TNC群6. 8%的⑶90+细胞的浓度、占TNC群O. I %的⑶29+细胞的浓度、占TNC群O. I %的⑶34+细胞的浓度，及如由7AAD所測定的95. 4%细胞生存力；
图30a至图30e展示关于经由本发明的CD117选择方法所获得的阳性溶离份中的细胞的流式细胞仪分析的結果。CD117选择的后，收集约Iml细胞悬浮液且将其置于分析管中以供流式细胞仪分析。结果指示占TNC群7. 2%的⑶117+细胞的浓度、占TNC群93. 6%的CD44+细胞的浓度及由7AAD所測定的95. 8%细胞生存力。结果系藉由根据本发明的流式细胞仪分析来运作处理样本且减去以与IgG抗体的同型一起运作的处理后样本所获得的背景计算值来计算；图31a至图31cc说明处理后样本及关于如下所述的M2-02C的同型的流式细胞仪分析的結果。收集约Iml细胞悬浮液形式的处理后样本且将其置于分析管中以供流式细胞仪分析。结果指示占TNC群O. 2%的⑶117+细胞的浓度、占TNC群I. 8%的⑶44+细胞的浓度、占TNC群O. 1%的⑶166+细胞的浓度、占TNC群I. I %的⑶105+细胞的浓度、占TNC群O. 4%的⑶90+细胞的浓度、占TNC群O. 5%的⑶29+细胞的浓度、占TNC群O. 0%的⑶34+细胞的浓度，及如由7AAD所測定的99. 5%细胞生存力；图32a至图32cc说明关于经由本发明的⑶117选择方法所获得的阳性溶离份中 的细胞的流式细胞仪分析的結果。收集约Iml细胞悬浮液形式的阳性溶离份且将其置于分析管中以供流式细胞仪分析。结果指示占TNC群18. 40%的CDl 17+细胞的浓度、占TNC群93. 0%的CD44+细胞的浓度、占TNC群89. 2%的CD166+细胞的浓度、占TNC群81. 4%的⑶105+细胞的浓度、占TNC群78. I %的⑶90+细胞的浓度、占TNC群73. 6%的⑶29+细胞的浓度、占TNC群O. 1%的⑶34+细胞的浓度及如由7AAD所測定的91. 9%细胞生存力。结果系藉由根据本发明的流式细胞仪分析来运作处理样本且减去以与IgG抗体的同型一起运作的处理后样本所获得的背景计算值来计算；图33a至图33r说明在如本文进ー步详述的培养、超低温保存、解冻及解冻后继代中的若干继代后关于M2-03E的细胞的流式细胞仪分析的結果。如藉此所示，流式细胞仪结果显示该等细胞表现 MHC I、CD44、CD29、CD90、SSEA-4、CD105、CD49f、CD9、CD166、CD166 及CXCR4且较低表现或不表现⑶133、MHC II、⑶34、⑶45及⑶38 ；图34a至图34f展示月经干细胞M2-03E对如图34a所示的CDl 17及如图34c所示的SSEA-4以及如图34e所示的⑶117与SSEA-4共定位呈阳性染色。阴性对照对如图34b所示的CDl 17、如图34d所示的SSEA-4或如图34f所示的CDl 17与SSEA-4共定位不呈阳性染色。图35a及图35b展示月经干细胞M2-03E快速生长且表现多能性标记。图35a展示月经干细胞M2-03E以约24小时至约36小时的倍增时间在超低温保存前培养中快速生长。此快速生长允许以八次倍增自50，000个细胞扩增至48，000, 000个细胞。如由RT-PCR所測定，图35b展示月经干细胞M2-03E以于培养中至多约12个继代的RNA水平表现0ct_4，L，梯带；水；ESC，胚胎干细胞；P12，第12代；图36a至图36g展示月经干细胞M2-03E分化成神经组织。月经干细胞经神经诱导以分化成表现如图36a至图36c所示的04及GalC的少突神经胶质细胞。月经干细胞亦表现如图36d所示的Map-2、如图36e所示的Tub_3及如图36f所示的波形蛋白(Vimentin)。分化细胞的RT-PCR结果展示通常对于神经细胞的RNA水平表现，RT-PCR L,梯带；W，水；B，脑对照；神经诱导的月经干细胞；图37a至图37d展示月经干细胞M2-03E分化成心脏组织。月经干细胞经8 μ M Aza处理且经图37b的免疫细胞化学所示展现肌动蛋白的强表现。如图37a所示的肌钙蛋白表现及如图37c所示的连接蛋白43 (connexin 43)表现系藉由用800 μ M SNAP处理细胞来刺激。RT-PCR确认如图37d所示的心脏分化，RT-PCR :L，梯带；W，水；H，心脏对照；心脏诱导；图38a至图38f展示月经干细胞M2-03E分化成中胚层型组织。与图38a所示的对照相比，如图38b所示诱导经针对脂肪空泡的油红O染色而指示分化成脂肪组织的细胞。与如图38c所示的对照相比，当如图38d所示诱导时细胞经艾尔逊蓝(alcian blue)染色而指示分化成成软骨组织。与图38e相比，如图38f所示细胞经茜素红S染色而指示钙沈积物存在；图39为展示在解冻后培养的第12代，M2-03E的月经干细胞表现端粒酶活性的图；hESC，人类胚胎干细胞；MEF，小鼠胚胎纤维母细胞；MenSCs P12 ；图40为展示以分成3组且在预设条件下收集的161个样本进行 研究的结果的图，其系为了分析与本发明的月经干细胞收集方法相关的变量。进行该研究以测定使用有及无抗生素的收集培养基及在有及无冰的情况下运送月经流样本的影响。图40展示总成核细胞计数分析平均在对于三组所收集的所有样本中收集的每个样本为约7，900，000个细胞；图41为展示图40所涉及的研究结果的图。图41展示处理后样本的细胞生存力平均在对于三组所收集的所有样本中为约74%的生存力；图42为展示图40所涉及的研究结果的图。图42展示对于三组所收集的所有样本的平均温度平均为约15°C ；图43为展示图40所涉及的研究结果的图。图43展示对于三组所收集的所有样本的平均样本体积平均为约Ilml，其包含约Iml月经流样本及约IOml收集培养基 '及图44为展示图40所涉及的研究结果的图。图44展示自收集至处理设施处接收所计算的平均样本龄期处于约小于5小时至大于140小时的范围内。
具体实施例方式本发明将藉由考虑本发明的实施例的以下详细描述连同如附随描述及图式中所述的特定例示性实施例而便于理解。应了解，本发明的图式及描述已经简化以出于清楚理解本发明的目的来说明相关要素。现參看图I至图44，本发明提供与自月经期间排出的血液、细胞、体液及组织(本掲示案中于本文中亦称作"月经流")分离且根据本发明的方法、制程及系统收集的月经干细胞的取得相关的方法、制程、系统及组合物。如贯穿本发明的掲示内容所用的短语"子宫内膜/月经细胞"、"子宮内膜/月经干细胞"、"月经干细胞"及"月经细胞"及术i吾"MSC"及"细胞"一般关于表现包括(但不限于)CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I类的细胞标记或细胞内标记中的至少ー者而表现较低量或不表现CD3及MHC II的自月经流收集的任意一或多个细胞而通篇使用。尽管术语"细胞"以单数含义使用，但其亦可以复数含义使用以指代本发明的ー个以上细胞。尽管细胞的上述特征系作为例示性特征提供，但月经干细胞的其它细胞表面特征系于本文中贯穿本发明的掲示内容提供(包括(但不限干)于此任何表及图式上所提供的特征)且提供关于本发明的月经干细胞的进一歩掲示内容。现尤其參看图36至图38，应了解，一些干细胞性质上具有多能性，此系归因于该等细胞分化成许多独特细胞类型的能力。多能性细胞具有经历分化成许多不同哺乳动物细胞类型的能力。详言之，如图36至图38中所说明，本发明的MSC亦表现分化成各种独特细胞谱系的能力，该等细胞谱系系诸如神经谱系、心脏谱系、成软骨谱系、成脂谱系及成骨谱系O相信本发明的MSC可能够分化成体内260个体细胞中的任一者。举例而言，细胞可至少能够分化成肝细胞、胰腺细胞、肌源细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、上皮细胞、神经细胞、角质细胞及心肌细胞。如共培养系统中所见，细胞亦可具有当与诸如肝细胞、胰腺细胞、肌源细胞、成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、上皮细胞、神经细胞、角质细胞及心肌细胞的其它预处理细胞一起培养时分化的能力。自分化获得的细胞及自共培养获得的细胞亦可具有用于置换或再生疗法、其它治疗应用、药妆、器官排斥疗法及其它应用的处理中的潜力。
详言之，MSC在治疗、药妆及其它应用中的潜在用途出于许多原因是有益的，这是由于MSC:(a)易于自其它方面视为生物废物的无争议来源获得，(b)在无需医学培训的情况下由供体有效收集，(C)高度増殖，(d)能分化成所要细胞类型，(e)能自体应用，⑴能同种异体应用，(g)能提供可用作多个疗法的潜在来源的单细胞株，(h)能与其它健康细胞潜在地共同培养，(i)能用作专用再生保健解决方案的来源，及(j)能经十年在规则周期上即期及多次收集。自其它来源获得的干细胞的用途已在用于以下病况的各种形式的再生医学中使用糖尿病、心肌梗塞、瓣膜/动脉置換、帕金森氏病(Parkinson' S)、阿兹海默氏病(Alzheimer' s)、MS、中风疗法、胰岛素再生、抗老化血清、烧伤/创伤愈合绷带、痤疮管理、白癫风、假发、牙齿再生、假乳/丰乳、肝硬化、阴茎増大、运动疗法、贫血、白血病、淋巴瘤、肺纤维化、铼刀型细胞贫血、骨骼置換、骨质疏松症、脊柱侧弯、类风湿性关节炎、脊髄损伤、膝/髋/肘置換、激素置换疗法、PMS/抑郁管理、自闭症、不孕疗法、视カ再生及晶状体置換。一般而言及在一实施例中，本发明提供自月经流获得及收集MSC的方法。在另ー实施例中，本发明提供自月经流收集MSC的系统。在另ー实施例中，本发明提供超低温保存自月经流所收集的MSC的方法。在其它实施例中，包含MSC群的产物可藉由自月经流获得及分离MSC的各种制程来收集。在其它实施例中，本发明提供MSC的富集群及富集自月经流获得的MSC群的制程。在其它实施例中，本发明提供包含MSC及其它试剂的各种组合物，诸如，包含MSC及超低温保存剂的组合物、包含MSC及至少ー种药妆剂的组合物、及包含MSC及保存剂的组合物。本发明的这些各个实施例在下文中进ー步详述。本发明的总体方法及制程的例示性图解于图I中说明。一般而言，各个步骤可用于取得月经流且处理该月经流以获得可经进ー步处理用于特定用途的MSC。详言之，可将MSC超低温保存，经由细胞选择或培养的单一或多个步骤富集，及/或准备供治疗或药妆使用。贯穿本发明的实施，可藉由诸如表征所收集的MSC的流式细胞仪及鉴别样本的任何可能污染的微生物分析的方法及制程对MSC及周围环境进行质量控制分析。图I所描绘的本发明的各个实施例系在图2至图28中以及本发明的工作实例的书面描述中进一歩详述。现參看图2，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图2，可以收集制程来收集月经流且接着将其转移至处理设施中，在此可处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可将MSC进ー步处理且与超低温保存剂组合以为超低温保存作准备且接着超低温保存。可接着将经超低温保存的MSC稍后解冻以供使用。现參看图3，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图3，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离且收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可由表现某些细胞标记的所选MSC来进ー步富集或浓缩MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可将经选择及甚至未经选择的MSC处理且与超低温保存剂组合以为超低温保存作准备且接着超低温保存。可接着将经超低温保存的MSC稍后解冻以供使用。现參看图4，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图4，可将月经流收
集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可由表现某些细胞标记的所选MSC来进ー步富集或浓缩MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可接着培养经选择及甚至未经选择的MSC以使该等MSC扩增。可接着将经培养的MSC与超低温保存剂组合以为超低温保存作准备且接着超低温保存。可接着将经超低温保存的MSC稍后解冻以供使用。现參看图5，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图5，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可由表现某些细胞标记的所选MSC来进ー步富集或收集MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可接着培养经选择及甚至未经选择的MSC以使该等MSC扩增。可接着针对特异性细胞表面标记来进ー步选择经培养的MSC以富集或收集特异性MSC。可将经选择及甚至未经选择的MSC与超低温保存剂组合以为超低温保存作准备且接着超低温保存。可接着将经超低温保存的MSC稍后解冻以供使用。现參看图6，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图6，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可由表现某些细胞标记的所选MSC来进ー步富集或收集MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可接着培养经选择及甚至未经选择的MSC以使该等MSC扩增。可接着针对特异性细胞表面标记来进ー步选择经培养的MSC以富集或收集特异性MSC。可接着进ー步培养经选择及甚至未经选择的MSC以扩增MSC数目。可接着将MSC与超低温保存剂组合以为超低温保存作准备且接着超低温保存。可接着将经超低温保存的MSC稍后解冻以供使用。现參看图7，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图7，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可培养MSC以扩增MSC数目。可将经培养的MSC处理且与超低温保存剂组合以为超低温保存作准备且接着超低温保存。可接着将经超低温保存的MSC稍后解冻以供使用。现參看图8，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图8，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可培养MSC以扩增MSC数目。可藉由选择表现某些细胞标记的MSC来富集或浓缩经培养的MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可接着将经选择及甚至未经选择的MSC分别与超低温保存剂组合以为超低温保存作准备且接着超低温保存。可接着将经超低温保存的MSC稍后解冻以供使用。现參看图9，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图9，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可培养MSC以扩增MSC数目。可藉由选择表现某些细胞标记的MSC来富集或浓缩经培养的MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可 接着培养经选择及甚至未经选择的MSC以使该等MSC扩增。可将MSC的经选择及甚至未经选择的培养物分别与超低温保存剂组合以为超低温保存作准备且接着超低温保存。可接着将经超低温保存的MSC稍后解冻以供使用。现參看图10，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图10，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可培养MSC以扩增MSC数目。可藉由选择表现某些细胞标记的MSC来富集或浓缩经培养的MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可接着培养经选择及甚至未经选择的MSC以使该等MSC扩增。可针对特异性细胞标记来进ー步选择MSC的经选择及未经选择的培养物。可接着将经选择及未经选择的细胞分别与超低温保存剂组合以为超低温保存作准备且接着超低温保存。可接着将经超低温保存的MSC稍后解冻以供治疗用。贯穿本发明的实施例的所有描述，短语"治疗用途"包括使用MSC用于任何类型的干细胞疗法且亦包括药妆用途。现參看图11，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图11，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可将MSC处理且与維持细胞生存力的细胞培养基组合以为治疗用途作准备。现參看图12，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图12，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可培养MSC以扩增MSC数目。培养后，可将MSC处理且与维持细胞生存力的细胞培养基组合以为治疗用途作准备。现參看图13，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图13，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可培养MSC以扩增MSC数目。可接着针对某些细胞标记来选择经培养的MSC。可接着将经选择及未经选择的MSC分别与维持细胞生存力的细胞培养基组合以为治疗用途作准备。现參看图14，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图14，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可培养MSC以扩增MSC数目。可接着针对某些细胞标记来选择经培养的MSC。可接着分别培养经选择及未经选择的MSC以扩增细胞数目。可接着将经培养的MSC分别与维持细胞生存力的细胞培养基组合以为治疗用途作准备。现參看图15，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图15，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可培养MSC以扩增MSC数目。可接着针对某些细胞标记来选择经培 养的MSC。可接着分别培养经选择及未经选择的MSC以扩增细胞数目。可接着针对某些细胞表面标记再次选择经分别培养的MSC。可接着将经选择及未经选择的MSC分别与维持细胞生存カ的细胞培养基组合以为治疗用途作准备。现參看图16，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图16，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可藉由选择表现某些细胞标记的MSC来富集或浓缩MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可接着将经选择及甚至未经选择的MSC分别与维持细胞生存力的细胞培养基组合以为治疗用途作准备。现參看图17，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图17，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可藉由选择表现某些细胞标记的MSC来富集或浓缩MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可接着分别培养经选择及甚至未经选择的MSC以扩增MSC数目。可接着将经培养的MSC与维持细胞生存力的细胞培养基组合以为治疗用途作准备。现參看图18，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图18，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可藉由选择表现某些细胞标记的MSC来富集或浓缩MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可接着分别培养经选择及甚至未经选择的MSC以扩增MSC数目。可接着针对特异性细胞标记来选择经培养的MSC。可接着将经选择及未经选择的MSC与維持细胞生存力的细胞培养基组合以为治疗用途作准备。现參看图19，本发明提供超低温保存MSC的方法及制程。根据图19，可将月经流收集且转移至处理设施中，在此可接着处理该月经流以分离及收集MSC。自月经流分离及收集MSC可经由用于使所收集的MSC数目最大化的离心、密度梯度离心、过滤或沉降方法来进行。一旦收集，即可藉由选择表现某些细胞标记的MSC来富集或浓缩MSC，该等细胞标记系诸如与MSC相关的细胞标记中的任意一或多者。可接着分别培养经选择及甚至未经选择的MSC以扩增MSC数目。可接着针对特异性细胞标记来选择经培养的MSC。可接着进ー步培养经选择及未经选择的MSC以扩增MSC数目。可接着将经培养的MSC与维持细胞生存力的细胞培养基组合以为治疗用途作准备。本发明的其它实施例系于图20至图28中提供且描述。该等其它实施例包括在根据本发明的先前所述实施例中的任一者或任何其它细胞收集及/或超低温保存方法或制程收集且超低温保存MSC的后处理MSC。现參看图20，本发明提供制备根据先前所述方法或制程中的任一者或任何其它细胞收集及/或超低温保存方法或制程收集且超低温保存的MSC的方法及制程。根据图20，将经超低温保存的MSC解冻且接着与细胞培养基组合以供治疗用。现參看图21，本发明提供制备根据先前所述方法或制程中的任一者或任何其它细胞收集及/或超低温保存方法或制程收集且超低温保存的MSC的方法及制程。根据图21， 将经超低温保存的MSC解冻且接着针对某些MSC细胞表面标记来选择。可接着将经选择及未经选择的细胞与细胞培养基组合以供治疗用。现參看图22，本发明提供制备根据先前所述方法或制程中的任一者或任何其它细胞收集及/或超低温保存方法或制程收集且超低温保存的MSC的方法及制程。根据图22，将经超低温保存的MSC解冻且接着针对某些MSC细胞表面标记来选择。可接着培养经选择及未经选择的细胞以扩增MSC数目。可接着将经培养的MSC与细胞培养基组合以供治疗用。现參看图23，本发明提供制备根据先前所述方法或制程中的任一者或任何其它细胞收集及/或超低温保存方法或制程收集且超低温保存的MSC的方法及制程。根据图23，将经超低温保存的MSC解冻且接着针对某些MSC细胞表面标记来选择。可接着培养经选择及未经选择的细胞以扩增MSC数目。可接着针对某些MSC细胞标记来选择经培养的MSC。可接着将经选择及未经选择的细胞与细胞培养基组合以供治疗用。现參看图24，本发明提供制备根据先前所述方法或制程中的任一者或任何其它细胞收集及/或超低温保存方法或制程收集且超低温保存的MSC的方法及制程。根据图24，可将经超低温保存的MSC解冻且接着针对某些MSC细胞表面标记来选择。可接着培养经选择及未经选择的细胞以扩增MSC数目。可接着针对某些MSC细胞标记来选择经培养的MSC。可接着培养经选择及未经选择的细胞以扩增MSC数目。可接着将经培养的MSC与细胞培养基组合以供治疗用。现參看图25，本发明提供制备根据先前所述方法或制程中的任一者或任何其它细胞收集及/或超低温保存方法或制程收集且超低温保存的MSC的方法及制程。根据图25，可将经超低温保存的MSC解冻且接着培养以扩增MSC数目。可接着将经培养的MSC与细胞培养基组合以供治疗用。现參看图26，本发明提供制备根据先前所述方法或制程中的任一者或任何其它细胞收集及/或超低温保存方法或制程收集且超低温保存的MSC的方法及制程。根据图26，可将经超低温保存的MSC解冻且接着培养以扩增MSC数目。可接着针对某些细胞标记来选择经培养的MSC。可接着将经选择及未经选择的MSC分别与细胞培养基组合以供治疗用。现參看图27，本发明提供制备根据先前所述方法或制程中的任一者或任何其它细胞收集及/或超低温保存方法或制程收集且超低温保存的MSC的方法及制程。根据图27，可将经超低温保存的MSC解冻且接着培养以扩增MSC数目。可接着针对某些细胞标记来选择经培养的MSC。可接着分别培养经选择及未经选择的MSC以扩增MSC数目。可接着将经培养的MSC与细胞培养基组合以供治疗用。现參看图28，本发明提供制备根据先前所述方法或制程中的任一者或任何其它细胞收集及/或超低温保存方法或制程收集且超低温保存的MSC的方法及制程。根据图28，可将经超低温保存的MSC解冻且接着培养以扩增MSC数目。可接着针对某些细胞标记来选择经培养的MSC。可接着分别培养经选择及未经选择的MSC以扩增MSC数目。可接着针对某些细胞表面标记来选择经培养的MSC。可接着将经选择及未经选择的MSC与细胞培养基组合以供治疗用。如图I至图28中所涉及的本发明的上述实施例系如下文所提供及描述而进一歩详述。根据本发明，包含月经干细胞及诸如超低温保存剂、细胞培养基或药妆剂的其它试剂 的组合物亦于下文提供且描述。收集及输送月经干细胞根据本发明的方法及制程，月经干细胞系藉由首先在月经期间使用具备收集套组的收集装置来收集包括月经干细胞的月经流而获得。月经流可在月经的任何时间收集，包括(但不限干)月经时期的重度日、中度日或轻度日。视情况，可自供体收集外周血液的样本以供比较传染病分析用。可出于收集用于处理出月经干细胞的月经流的至少ー个样本的目的向供体提供收集套组。举例而言，可提供月经干细胞收集套组以收集、处理及封装月经流的至少ー个样本以供运送。该收集套组可包含输送容器，诸如盒、袋或适合于(视情況)于低温下运送月经流的至少ー个样本的其它容器(例如Nanocool、Styrofoam或隔热容器)；收集装置，诸如Mooncup、Divacup、Instead杯或适合于收集月经流的至少ー个样本的任何其它卫生收集装置；至少ー个尺寸合适的无菌收集容器，诸如50ml管或其它合适尺寸的管；用于悬浮至少ー个月经流样本的收集培养基；至少ー个塑料拉链袋；至少一条吸收毛巾；至少ー个生物危害品袋；无菌4X4纱布；用于包覆至少ー个收集容器的封ロ膜；及消毒清洁小毛巾或抹布。在收集至少ー个包含月经干细胞的月经流样本之前，可对供体身份指定ー寄存编号，该编号可在本发明的实施中使用以鉴别由该供体所收集的任何样本。用于收集套组的收集培养基可包含DPBS与肝素的混合物。具有必要pH值的合适的相当组织培养基可替代DPBS使用。举例而言，肝素可以约1000単位/毫升的浓度提供。在一实施例中，收集培养基可包含具有200単位的处于约1000単位/毫升浓度下的肝素的约10毫升DPBS。收集套组的培养基可藉由将约0. 20毫升肝素以1000単位/毫升的浓度添加至约10毫升DPBS中来制备。可于收集样本前将此体积置于无菌收集容器中。在另ー实施例中，收集培养基可包含杜氏磷酸盐缓冲生理食盐水(Dulbecco' s PhosphateBuffer Saline,DPBS) (Mediatech或合适替代培养基的其它制造商)，其不含钙、镁或酚红；抗生素，其可包括盘尼西林(Penicillin)(约100单位/毫升)、链霉素(Streptomyocin)(约100微克/毫升)、两性霉素B (Amphotericin B)及/或其它合适的抗生素；及处于每毫升DPBS培养基或合适抗凝剂约10単位至约20単位的范围内的无保存剂肝素，该抗凝剂系诸如A⑶、CPD、CPDA或CPDA-1。收集培养基可使用无菌技术来制备。
可用消毒剂清洁阴道区域以为收集至少ー个包含月经干细胞的月经流样本作准备。在一实施例中，消毒剂可提供于小毛巾上。供体接着可根据收集装置的使用说明书将先前已用肥皂及水清洁的收集装置置于阴道内。须在供体的月经期间将该收集装置置于阴道内以收集月经流的至少ー个样本。在一实施例中，可在月经的重度日期间将收集装置置于阴道内。在一替代实施例中，可在月经的中度日或轻度日期间将收集装置置于阴道内。应将收集装置在阴道内維持一定时间以收集月经流的至少ー个样本。举例而言，可将收集装置在阴道内维持约3小时或更短时间。收集样本的额外时间可为必需的。在阴道内维持约3小时后，可接着移除含有月经流样本的收集装置。月经流样本可包含约O. Iml至约5ml体积的月经血液、组织、 体液及月经干细胞。可接着将月经流样本转移至无菌收集管中的收集培养基中。月经流样本向无菌容器中的转移可藉由将月经流样本自收集装置倾入容器中的培养基中来进行以为将月经流样本运送至处理设施作准备。该容器应加以封盖或以其它方式密封以防止月经流样本与收集培养基的溶液泄漏。密封件亦应防止空气进入收集容器内部。在一实施例中，可将具有相应密闭盖的容器用封ロ膜包覆且封装以供输送。可将ー个以上月经流样本收集，转移至容器且准备运送至处理设施。若收集ー个以上月经流样本，则可将于收集管中的收集培养基中的各所收集样本維持于冰箱中直至收集最后ー个样本为止。一旦收集所有月经流样本，即可接着封装该等样本以供运送。在一实施例中，月经干细胞可由在子宮内膜或子宫颈区域中所进行的帕帕尼科拉乌试验(Papanicolaou test)或任何活组织检查来制备。取得后在运送及于处理设施处处理的过程中，可将包含月经干细胞的月经流的至少ー个样本维持于低温下。可将容纳月经流与培养基的溶液的任何密封容器封装供运送以在运送至处理设施期间将各样本维持于约rc至约25°C的范围内的温度下。在一实施例中，在运送至处理设施期间可将各样本维持于约1°C至约15°C的温度范围内。在另ー实施例中，在取得后及在整个运送中，可将所收集的月经流样本维持于室温或周围空气温度下。含有包含月经干细胞及收集培养基的月经流样本的各收集容器可藉由将该收集容器置于以袋子拉链功能密封的大塑料拉链袋中而封装以供输送。可将封装有杀菌容器的大塑料袋置于第二个大拉链袋中且亦密封。可将两条吸收毛巾置于输送容器的底部。若正使用Nanocool装置，则不需要额外冰。泡沫砖或其它装置可用于冷却载运月经流样本的输送容器。可将充满湿冰的袋置于吸收毛巾之上。可将密封袋中的杀菌容器置于冰袋之下。可将其余吸收毛巾置于冰袋之上。将输送容器关闭，紧固且密封。其它合适的容器可用于容器的输送，只要该容器在运送期间将包含月经干细胞的月经流样本維持于约l°c与约25°C之间的温度下即可。举例而言，其它合适的容器包括(但不限于)由Therapak Corporation出售的冷却及隔热运送容器、任何类型的隔热容器或经设计用于运送的苯こ烯泡沫盒(Styrofoam box)。在运送的至少两个小时内可接触承运方以获取含有于收集培养基中的至少ー个月经流样本的输送容器。承运方可为AirNet或适合于输送生物材料的其它较佳快递或诸如FedEx或UPS的其它运送公司。输送容器应在收集后约5个小时至约125个小时内到达处理设施。在一实施例中，输送容器可在收集后约24个小时至约72个小时的间到达处理设施。在另一实施例中，输送容器可在约24个小时至约48个小时的间到达处理设施。输送容器不应储存于热环境中。
处理设施接收输送容器且为各供体样本的识别信息编目录以在处理包含月经干细胞的月经流样本期间使用。适当障壁及个人保护措施可在处理设施处处理包含月经干细胞的月经流的任何样本期间使用。一旦在处理设施处接收输送容器，即可将具有月经流样本的各容器自输送容器移除，置于冰盘中(或冰箱中)的冰上，且转移至生物安全柜(BSC)中的清洁室中以自月经流分离月经干细胞、收集月经干细胞且稍后处理以供使用及/或超低温保存。处理设施处的月经流处理由处理设施接收月经流样本且记录至处理设施系统中。一旦在处理设施处接收月经流样本，即可在整个处理期间将其維持于约1°C至约25°C的温度下。可在BSC及离心机中使用无菌技术处理各月经流样本。当在BSC中工作时以70% IPA频繁擦拭手套。在处理月经流样本之前于无菌条件下置放BSC中处理所需的所有其它材料，包括(但不限干)红色顶端管、针、注射器、红色顶端管的托架、BacT瓶、酒精垫、50ml锥形管、50ml锥形管的托架及移液器。在已对BSC消毒后设置所有无菌供应品。可将制程所使用的所有无菌供应品 置于盘或无菌铺巾中。无菌供应品可包括针、注射器及置于BSC中的其它材料，该等材料包括红色顶端管、红色顶端管的托架、血液培养瓶、酒精垫、50ml锥形收集管、50ml锥形收集管的托架、移液管及冰盘。基于制造商的说明书，将所有培养基及试剂较佳置于冰上且储存于约1°C至约15°C之间下，但亦可为约2°C至约8°C。缓冲生理食盐水培养基(DPBS)或合适的替代品可在月经干细胞分离过程期间使用。DPBS培养基包含具有约5ml至约IOml肝素(肝素钠1，000USP单位/毫升-AmericanPharmaceutical Partners)的约 100 毫升 DPBS。在处理设施处接收月经流样本的第一天，可对包含月经干细胞的各月经流试样进行第I阶段处理。首先，可对容纳月经流样本的收集容器外部进行消毒，接着离心。可使收集容器中的月经流样本经受离心、密度梯度离心、过滤及/或淀粉沉降。离心在一实施例中，在约4°C下月经流样本的离心可以约2000rpm进行历时约7分钟。离心后，可接着自离心机移除月经流样本的各试样。可对收集容器外部消毒，接着将收集管转移至BSC中以抽吸上清液。可使离心块再悬浮于约IOml DPBS或相当替代品中，且接着对其进行第2阶段处理。亦可根据如本文所述的可选净化步骤处理离心块。密度梯度离心在另ー实施例中，月经流样本的离心可使用密度梯度液进行。举例而言，密度梯度液可为淋巴细胞分离培养基(约20°C下密度I. 077-1. 083g/ml-Cellgro)或为可具有较高或较低密度的其它合适梯度液。使含有月经流样本、收集培养基及密度梯度液的锥形收集管经受离心。举例而言，可在约15°C至约30°C之间、较佳约20°C下将锥形收集管以约14，OOOrpm离心约30分钟而无需应用制动器以减缓离心机。作为密度梯度离心的结果，白血球层形成于上清液与密度梯度液的界面处。该白血球层含有包含自月经流样本获得的月经干细胞的所要细胞群。将白血球层上方的上清液抽吸至白血球层上方约5ml且摒弃。藉由使白血球层缓缓涡旋且在白血球层处用IOml移液管刮拭锥形管侧面来移除白血球层。应尽可能与白血球层一起收集最小体积的密度梯度液。可摒弃剩余密度梯度液及含有红血球的离心块。可在室温下以试剂及细胞进行密度梯度分离。若将细胞冷却，则分离不会提供最佳细胞回收。可将所收集的白血球层置于50ml锥形收集管中且用洗涤溶液使体积达到约30ml。可接着在约15°C至约30°C的间下使细胞悬浮液以约2000rpm离心历时约7分钟。离心后，可接着自离心机移除试样且可对收集容器外部消毒，接着将收集管转移至BSC中以抽吸上清液。可使离心块再悬浮于约IOml DPBS中且接着对其进行第2阶段处理。亦可根据如本文所述的可选净化步骤处理离心块。过滤在又一实施例中，可在无菌过滤器中使月经流样本经受过滤。该无菌过滤器可为约40微米、约70微米或约100微米。过滤可包含在约1°C至约30°C之间下使包含月经干细胞的月经流样本以约2000rpm离心约7分钟。离心后，可接着自离心机移除试样且可对收集容器外部消毒，接着将收集管转移 至BSC中以抽吸上清液。可使离心块再悬浮于约IOml DPBS中且接着对其进行第2阶段处理。亦可根据本文所述的可选净化步骤处理离心块。淀粉沉降在又一实施例中，可藉由淀粉沉降来处理月经流样本。在一实施例中，羟こ基淀粉可以I比5的比率使用，亦即，约I毫升淀粉比约5毫升月经流样本。可根据上述比率混合各月经流样本。可使混合物经受离心以有助于以约50g沉降约6分钟。亦可在有或无上述离心步骤的情况下使混合物沉降历时约30分钟或至多约两小吋。沉降后，移除包含月经干细胞的白血球层且使其经受离心以浓缩该等月经干细胞。离心包含在约1°C至约30°C之间下使悬浮于DPBS中的月经干细胞以约2000rpm离心约7分钟。离心后，可接着自离心机移除试样且对收集容器外部消毒，接着将收集管转移至BSC中以抽吸上清液。可使离心块再悬浮于约IOml DPBS中且接着对其进行第2阶段处理。亦可根据本文所述的可选净化步骤处理离心块。净化可使如根据离心、密度梯度离心、过滤或淀粉沉降之上述步骤中的任一者所收集的月经干细胞的样本经历可选净化过程。在首先计算样本的总体积后可移除离心块周围的过量流体。可使离心块再悬浮于约5ml浄化培养基中。浄化培养基可用于净化月经流样本。浄化培养基包含于合适培养基中的至少ー种抗生素。作为非限制性实例，抗生素可包含万古霉素(Vancomycin)、凯福隆(Claforan)、阿米卡星(Amikacin)、庆大霉素(Gentamycin)及两性霉素B中的至少ー者。合适的培养基可包含汉克斯平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution,HBSS)或其它培养基。若以干式提供，则抗生物可需要复水。在一实施例中，浄化培养基可包含以下浓度的抗生素50yg/ml万古霉素、250 μ g/ml凯福隆、100 μ g/ml阿米卡星、120 μ g/ml庆大霉素及2. 7 μ g/ml两性霉素B。抗生素的其它浓度水平可为合适的。举例而言，浄化培养基可藉由将约IOml HBSS添加至万古霉素的约Ig小瓶中以获得约100mg/ml的浓度而制成。将约Iml的100mg/ml浓度的万古霉素添加至约199mlHBSS中以获得约500 μ g/ml的浓度。将约Iml的约500 μ g/ml浓度的万古霉素添加至最终小瓶中用于制备净化培养基。将约2ml HBSS添加至约500毫克/小瓶的凯福隆中以获得约250mg/ml的浓度。将约Iml的约250m g/ml凯福隆溶液添加至约99mlHBSS中以获得约2500 μ g/ml的凯福隆浓度。将约Iml的约2500 μ g/ml浓度的凯福隆添加至浄化培养基的最終小瓶中。将约IOml HBSS添加至阿米卡星的约Ig小瓶中以获得约100mg/ml的浓度。将约Iml的约100毫克/小瓶浓度的阿米卡星添加至约99mlHBSS中以获得约1000 μ g/ml。将约Iml阿米卡星添加至最终小瓶中以制备净化培养基。将约IOml HBSS添加至庆大霉素的约Ig小瓶中以获得约100mg/ml的浓度。将约Iml的约100mg/ml浓度的庆大霉素添加至约99ml HBSS中以获得约1000 μ g/ml浓度。将约I. 2ml的约1000 μ g/ml庆大霉素溶液添加至最终小瓶中以制备净化培养基。将约2ml两性霉素B添加至约8ml无菌水中以制备约50 μ g/ml浓度的两性霉素B。约O. 540ml (27 μ g)两性霉素B系用以制备最终浓度的两性霉素B。对于抗生素溶液而言，净化培养基可于50ml无菌管中藉由添加约Iml的500 μ g/ml万古霉素、约Iml的2500 μ g/ml凯福隆、约Iml的1000 μ g/ml阿米卡星、约I. 2ml的1000 μ g/ml庆大霉素及约O. 540ml (27 μ g)两性霉素B以构成约4. 74ml培养基来制备。将1000单位/毫升的约O. 200ml肝素添加至抗生素溶液中且将约5. 06ml HBSS添加至抗生素溶液中以形成最終体积IOml的浄化培养基。可将培养基储存于约2°C至约8°C下直至使 用。可使离心块再悬浮于约5ml浄化培养基中。若凝块或其它巨分子存在，则细胞可需要过滤。若再悬浮的细胞因凝块或出于任何其它原因而需要过滤，则可使用100微米过滤器过滤样本。对于过滤而言，可使用100微米过滤器或更小尺寸过滤器(视悬浮液中的凝块尺寸而定)及无菌50ml锥形管过滤悬浮液。一旦悬浮液穿过过滤器，即可使用额外抗生素培养基洗涤该过滤器。为净化起见可培育净化培养基中的经过滤或未经过滤的细胞。在一实施例中，于清洁室中在冰箱中将净化培养基中的经过滤或未经过滤细胞在约2°C至约8°C下培育约20小时至约30小吋。培育期间，可将细胞置于旋转器上或以每小时约一次翻转历时培育的头5个小吋。净化过程结束时，接着对包含月经干细胞的细胞悬浮液进行第2阶段处理。在经受或不经受净化过程的情况下，包含月经干细胞的细胞悬浮液可根据第2阶段处理来处理。第2阶段处理包含使DPBS或浄化培养基中的细胞悬浮液经受离心。在一实施例中，在约4°C下细胞悬浮液的离心可以约2000rpm进行历时约7分钟。离心之后及转移至BSC之前，可对容纳月经干细胞的管外部消毒。一旦于BSC中，即可移除上清液，在管底部留下细胞离心块。可使细胞再悬浮于约10ml DPBS中，混合且在约4°C下以约2000rpm离心约7分钟。离心后，可将容器浄化，接着转移至BSC中。月经干细胞的细菌学分析可在处理中的此时进行。在BSC中，且使用无菌技木，可使用无菌注射器移除包含月经干细胞的离心块上方的约5ml上清液。可将约4ml上清液置于厌氧血液培养瓶中且可将约Iml上清液置于好氧血液培养瓶中。该等瓶可经组态以供BacT/Alert系统中使用。可接着根据制造商的说明书使用BacT/Alert系统培育该等瓶。BacT/ALERT血液培养瓶及系统系作为用于实施本发明的合适测试系统的ー实例而提供。可使用其它合适的自动或手动血液培养试样瓶及系统，只要其依照21C. F. R.部分610. 12或经验证效能与此CFR部分类似即可。可自离心块上方移除剩余上清液。使包含细胞的离心块再悬浮于DPBS中达到约5. Iml且混合。可将约ΙΟΟμ I细胞等分至管中以供处理后测试以获得细胞计数及生存力。可使用自动或手动血球计进行细胞计数。可使用锥虫蓝或其它方法进行细胞生存力分析。悬浮于DPBS中的剰余细胞可准备超低温保存、细胞培养、细胞选择或治疗或药妆使用。超低温保存对于超低温保存而言，可将悬浮于DPBS中的剰余细胞置于冰上历时至少约15分钟以为超低温保存作准备。该准备可包含将超低温保存培养基添加至月经干细胞中且接着利用控速冷冻器或其它合适的冷冻器系统(急降冷冻(dump-freeze)监控或冷冻容器(Nalgene))对混合物进行若干降温步骤以使该等月经干细胞的温度降至约_90°C的最终温度。合适的控速冷冻器包括(但不限于)Cryomed Thermo Forma控速冷冻器 7454 (Thermo Electron, Corp. )、Planar 控速冷冻器 Kryo 10/16 (TS Scientific) >Gordinier、Bio-Cool-FTS 系统及 Asymptote EF600、BIOSTORCBS 2100 系列。
可制备包含培养基及DMSO的超低温保存培养基。可将约3ml DPBS添加至诸如50ml锥形管的容器中。可将约Iml人类血清白蛋白(HSA)添加至约3ml DPBS中且接着在冰上冷却约10分钟。将约Iml经冷却的99% DMSO添加至HSA及DPBS中以制备最终超低温保存培养基。可接着将超低温保存培养基及细胞样本置于冰上历时约15分钟，随后将该超低温保存培养基添加至该细胞样本中。分批处理可用于将超低温保存培养基等分至细胞样本中。举例而言，可将约ΙΟΟμ I细胞悬浮液的单一等分试样与约3ml DPBSUml HSA及约Iml的99% DMSO组合。可将约200 μ I细胞悬浮液的约2份等分试样与约6ml DPBS、2mlHSA及约2ml的99% DMSO组合。可将细胞样本的约5份等分试样与约15ml DPBS、约5ml HSA及约5ml的99% DMSO组合。可将细胞样本的约10份等分试样与约30ml DPBS、约IOmlHSA 及约 IOml 的 99% DMSO 组合。在一替代实施例中，可使用其它超低温保存培养基。举例而言，具有超低温保存剂的超低温保存培养基可用于维持解冻后高细胞生存力成果，诸如CryoStor CSlO或CS5 (Biolife)、补充有丙ニ醇及蔗糖的胚胎超低温保存培养基(Vitrolife)、或SAGE培养基(Cooper Surgical)。甘油可与诸如DMSO的其它超低温保存剂一起使用，或可以于具有合适蛋白质的培养基中约10%的浓度单独使用。可将超低温保存培养基添加至细胞样本中。可将超低温保存培养基逐滴添加至悬浮于DPBS中的月经干细胞中直至所悬浮的月经干细胞与超低温保存培养基的总混合物的体积达到超低温保存细胞混合物的最終所要体积为止。可将最终超低温保存细胞培养基转移至2X5ml条形码冷冻四级瓶(cryoquat)中，其中Q C样本储存于5ml小瓶的盖中。使用移液器移除样本的约200 μ I等分试样且将其等分至Q C盖中。已填充盖后，将剩余4.8ml试样添加至5ml小瓶中。应将样本送至进行传染病及其它分析。应将冷冻小瓶置于CRY0MED冷冻器中且对其进行控速降温至处于或低于约_85°C的温度。应将经超低温保存的试样转移至贮仓中以储存于-150°C或更低温度下的液氮蒸气中。应对对传染病测试呈阳性的任何样本进行检疫。可将对传染病测试呈阴性的任何样本转移至不同永久储存仓。可在控速冷冻器中程序化以下降温步骤，首先降低超低温保存剂与月经干细胞的混合物。可使与超低温保存剂组合的月经干细胞经受控速降温以为最终储存于冷冻器中作准备。控速降温可经设计以维持细胞生存力。Cryo-Med冷冻器(Thermo Electron Corp.) >液氮缸及携帯型Cry0-Med冷冻器可用于控速降温以为最终储存于冷冻器中作准备。可在冷冻小瓶或冷冻袋中使细胞经受控速降温以达到约-90°C的温度。对于在冷冻袋中所收集的月经干细胞的样本而言，可使细胞经受以下控速降温概況在约4 °C下等待，I. (TC /分钟至-6. (TC (样本)，25. (TC /分钟至-50. (TC (腔室)，10. (TC / 分钟至-14. (TC (腔室)、I. (TC / 分钟至-45. (TC (腔室)、10. (TC / 分钟至-90. (TC (腔室)及结束(样本处于或低于-85. (TC )。对于在冷冻小瓶中所收集的月经干细胞的样本而言，可使细胞经受以下控速降温概况在4. (TC下等待，I. (TC /分钟至-3. (TC (腔室)，10. (TC /分钟至-20. (TC (腔室)，I. (TC /分钟至-40. (TC (腔室)，10. (TC /分钟至-90. (TC (腔室)及结束。一旦超低温保存剂与月经干细胞的混合物处于或低于约_85°C，即将超低温保存小瓶转移至低温储存单元中且在处于或低于约_135°C的温度下的液氮蒸气中储存，或另外可将小瓶储存于液氮的液相中。举例而言，合适的低温储存单元包括(但不限干)LN2冷冻 器 MVE 1830 (Chart Industries)。流式细胞仪分析月经干细胞的任何所收集样本可藉由锥虫蓝经由染料排除测试总细胞计数及细胞生存力。亦可分析月经干细胞的样本的表现细胞标记的细胞的存在。可藉由使用血球计、流式细胞仪或适合于获得细胞计数的其它方式(诸如ViCell (Beckman Coulter))的手动计数或适合于对呈现于显微镜影像上的细胞进行计数的软件来量化细胞的处理前样本、处理后样本及任何其它样本的总细胞计数及细胞生存力。可藉由流式细胞仪分析处理前细胞。若红血球存在，则可藉由将约36ml蒸馏水及约4ml的10溶胞溶液添加至50ml管中来制备IXNH4Cl溶胞溶液(StemKit)。可将每个委托者约ΙΟΟμ I处理前样本添加至两个管中以进行分析。一管用于⑶34+/生存力分析且第二管用于异纯系对照(isoclinic control) 可将约20 μ I CD45-FITC/CD34-PE添加至各管底部。应将约20 μ I 7-AAD生存力染料添加至管中。可使混合物涡旋且接着在免受光照下于约15°C至约30°C下培育至少20分钟。可接着将约Iml的IXNH4Cl溶胞溶液添加至各管中且使其涡旋。可将混合物在约15°C至约30°C下培育约20分钟。可将约100μ LStem-Count荧光球添加至各管中且使其涡旋。接着应将样本在流式细胞仪上运作以供分析。可藉由流式细胞仪分析处理后细胞。可自StemKit藉由将约36ml蒸馏水及4ml的10溶胞溶液添加至50ml管中来制备IXNH4Cl溶胞溶液。可将每个委托者约50 μ I处理后样本添加至两个管中以进行分析。一管用于⑶34+/生存力分析且第二管用于异纯系对照。可将约10 μ L 7-AAD生存力染料添加至各管中。可将约10 μ I⑶45-FITC/⑶34-ΡE添加至第一管中。可将约10 μ I⑶45-FITC/CTRL-PE添加至第二管中。可使混合物涡旋且接着在免受光照下于约15°C至约30°C下培育至少20分钟。可接着将约Iml的IXNH4Cl溶胞溶液添加至各管中且使其涡旋。可将混合物在约15°C至约30°C下培育约20分钟。可将约100 μ LStem-Count荧光球添加至各管中且使其涡旋。接着应将样本在流式细胞仪上运作以供分析。月经干细胞的新鲜样本及先前经超低温保存的月经干细胞的解冻样本亦可藉由流式细胞仪分析以分析细胞表面标记、细胞生存力及其它细胞特征。新鲜样本亦可于细胞溶解后根据以下方案来分析。经超低温保存的月经干细胞须根据本文所述的解冻过程来解冻。在细胞样本须解冻的状况下，细胞可需要在解冻后或在细胞培养后即刻进行流式细胞仪分析以评估某ー细胞继代。可将经超低温保存的样本在37°C水浴中搅动而不便细胞完全解冻。可将该等细胞转移至约Iml经冷却的洗涤培养基中且藉由翻转来混合。可将样本以约2000rpm离心约7分钟。可移除上清液且使细胞悬浮于约ΙΟΟμ I洗涤培养基(25% HSA，DNAse，肝素及HBSSw/Ca+与Mg+)中。可接着将再悬浮的细胞在Bl ood Bank Serofuge中离心约I分钟。可倾析上清液且使细胞再悬浮于约I. 2ml鞘流中且使其涡旋。可针对许多细胞表面标记来分析鞘流中的细胞。举例而言且并非限制性地，可将细胞于鞘流中的约100 μ I样本添加至含有下列试剂(各管中每ー试剂10 μ I或20 μ I体积)的各管中且接着使管涡旋以将如表A中所述的试剂与样本混合。表A :流式细胞仪负荷示意表
管[FITCPE I ECD Γ PC5
~IgGIgGIiGiiG
2HLA-I CD133 ' HLA-II 7AAD
3CD9CD54 ' CD45CDlO
4CD59CD63 ' CD34CD13
5CD49e CD81 '无CD49f
6CD44CDl17 '无CD38
7CD29CD105 ' CD41CD3
8CD19CD166 '无CD90
9NANOG SSEA3 '无7AAD
10CD14SSEA4 '无7AAD
11无CD56 '无7AAD在室温(15-30°C )下培育20分钟。免受光照。若运作含有RBC的新鲜样本，则添加500 μ I溶胞溶液且在室温下再培育10分钟且免受光照。若运作密度梯度液或经解冻样本，则不溶解。若不溶解样本，则在培育20分钟后用Iml洗涤培养基洗涤。离心I分钟且接着倾析上清液。若溶解样本，则将样本离心I分钟且倾析溶胞液。添加Iml洗涤培养基，涡旋，再次离心且接着再次倾析。将500 μ L鞘流添加至各管中，涡旋且在FC500流式细胞仪上运作。
在细胞标记分析之前，可对新鲜细胞样本或经解冻样本进行总细胞计数。可使用Kasumi-3对照细胞或其它对照细胞设置许多阳性对照用于流式细胞仪分析。用于细胞计数及细胞生存力分析的材料包括(但不限于)流式细胞仪，Isoflow鞘流，Coulter Clenz 清洁剂，及包括(但不限于)CD45-FITC/CD34-PE、CD45-FITC/ 异纯系对照-PE、7-AAD生存力染料、Stem-Count荧光球、10X浓缩氯化铵(NH4Cl)溶胞溶液及22%牛白蛋白溶液的试剂。參见Stem Kit CD34+HPC列举套组包装插页-03版(PNIM2390) ；Beckman Coulter Product Corrective Action, CXP 2. 0&2.I PanelInterruption-3/10/06, PCA-M-D-1013 ；14. 3StemLab，创建号 200706260856,3. 2. I 版。用于流式细胞仪的材料亦包括(但不限于)Isoflow鞘流；Coulter Clenz清洁剂；及使用前约 20-25 °C 的以下试剂CD 117-PE、CD29-FI TC、CD34-ECD、CD44-FI TC、CD45-ECD、CD90-PC5、CD105-PE、CD166-PE、IgG-FITC、IgG-PE、IgG-ECD、IgGl-PC5、HLA-I-FITC、CD133-PE、HLA-IIECD、CD9-FITC、CD54-PE、CD10-PC5、CD59-FITC、CD63-PE、CD13-PC5、CD49e_FITC、CD81-PE、CD49f-PC5、CD44-FITC、CD38-PC5、CD29-FITC、CD105-PE、CD41-ECD、CD3-PC5、CD19-FITC、NAN0G-FITC、SSEA3-PE、SSEA4-PE、CD14-FITC、CD56_PE、7_AAD 生存力染料、10 X 浓缩氯化
铵(NH4Cl)溶胞溶液、洗涤培养基(包含HBSS (具有Ca+与Mg+的汉克斯液)500ml、肝素5ml、人类血清白蛋白25% 50ml、DNASE-l安瓿)、Kasumi-3细胞株-CD117+细胞、定时器及涡旋式混合器。在一替代实施例中，细胞可藉由类似于先前所述的流式细胞仪方法的替代流式细胞仪方法来分析，该等先前所述的流式细胞仪方法包括使用对照及制备月经干细胞的新鮮样本、处理前样本、处理后样本或经解冻样本的方法。细胞标记亦可藉由免疫组织化学分析来评估。可在流式细胞仪的前分析各样本的总细胞计数。若样本含有> 3. 5X IO6个细胞，则可评估全板。若样本含有< 3. 5X IO6个细胞，则较少管可为必需的。若流动测试需在需要解冻的冷冻样本上进行，则在37°C水浴中搅动小瓶而不使细胞完全解冻。可根据对于先前所讨论的流式细胞仪分析法的方法来处理经解冻样本且视细胞数而定根据下表B将其添加至若干管中。表B :流式细胞仪负荷示意表
权利要求
1.一种用于获得月经干细胞的方法，该方法包含下列步骤 a)自月经流分离月经干细胞；及 b)处理该自月经流分离的月经干细胞。
2.如权利要求I所述的方法，其中自月经流分离月经干细胞的步骤包含以离心、密度梯度离心、过滤或沉淀中的至少一个方法处理该月经流。
3.如权利要求I所述的方法，其中处理自该月经流分离的月经干细胞的步骤包含针对至少一种包含下列的细胞标记选择月经干细胞⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 类。
4.如权利要求3所述的方法，其中处理月经干细胞的步骤包含培养月经干细胞的进一步步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其中处理月经干细胞的步骤包含针对至少一种包含下列的细胞标记选择月经干细胞的进一步步骤⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 类。
6.如权利要求5所述的方法，其中处理月经干细胞的步骤包含培养月经干细胞的进一步步骤。
7.如权利要求I所述的方法，其中处理分离自该月经流的月经干细胞的步骤包含培养月经干细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其中处理该月经干细胞的步骤包含选择月经干细胞的进一步步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其中处理月经干细胞的步骤包含培养月经干细胞的进一步步骤。
10.如权利要求9所述的方法，其中处理月经干细胞的步骤包含针对细胞标记选择月经干细胞的进一步步骤。
11.如权利要求I所述的方法，其中该方法包含超低温保存月经干细胞的进一步步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其中该方法包含解冻经超低温保存的月经干细胞及处理经解冻的月经干细胞的进一步步骤。
13.如权利要求I所述的方法，其中该方法包含制备包含月经干细胞及维持月经干细胞存活的细胞培养基的治疗组合物的进一步步骤。
14.如权利要求I所述的方法，其中该方法包含制备包含月经干细胞和药妆制剂的药妆组合物的进一步步骤。
15.一种自月经流收集月经干细胞的方法，该方法包含 a)在一月经周期期间取得月经流； b)将该月经流输送至一处理设施； c)将月经干细胞自月经流分离而成细胞制剂'及 d)处理该月经干细胞的细胞制剂。
16.一种自月经流收集月经干细胞的系统，该系统包含 a)一月经干细胞分离器，其中月经干细胞分离器将月经干细胞自月经流分离； b)一月经干细胞收集器，其中该月经干细胞收集器收集月经干细胞 '及 c)一月经干细胞处理器，其中该月经干细胞处理器制备供治疗用或供超低温保存的月经干细胞。
17.一种超低温保存月经干细胞的方法，该方法包含下列步骤 a)自月经期间所收集的月经流分离月经干细胞； b)收集自月经流分离的月经干细胞；及 c)超低温保存分离自该月经流的月经干细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其中自该月经流分离月经干细胞的步骤包含经由离心、密度梯度离心、过滤或沉降中的至少一种处理该月经流。
19.如权利要求17所述的方法，其中收集分离自月经流的月经干细胞的步骤包含至少一个针对细胞标记选择月经干细胞的步骤。
20.如权利要求19所述的方法，其中收集分离自月经流的月经干细胞的步骤包含至少一个培养所选择月经干细胞的步骤。
21.如权利要求17所述的方法，其中收集分离自月经流的月经干细胞的步骤包含至少一个培养月经干细胞的步骤。
22.如权利要求21所述的方法，其中收集分离自月经流的月经干细胞的步骤包含至少一个自细胞培养物选择月经干细胞的步骤。
23.一种月经干细胞群，其通过包含下列步骤的方法获得 a)从月经期间所收集的月经流中分离月经干细胞；及 b)收集分离自月经流的月经干细胞。
24.一种用于富集收集自月经流的月经干细胞群的方法，该方法包含下列步骤 a)从月经期间所收集的月经流中分离月经干细胞；及 b)收集分离自月经流的月经干细胞。
25.如权利要求24所述的方法，其中该方法包含至少一个针对下列细胞标记中的至少一者选择月经干细胞的步骤CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166 及 HLA I 类。
26.如权利要求24所述的方法，其中该方法包含至少一个培养月经干细胞的步骤。
27.如权利要求24所述的方法，其中该方法包含至少一个选择月经干细胞的步骤及至少一个培养所选择的月经干细胞的步骤。
28.如权利要求24所述的方法，其中该方法包含至少一个培养月经干细胞的步骤及至少一个自细胞培养物选择月经干细胞的步骤。
29.一种用于富集表达⑶117的月经干细胞群的方法，该方法包含下列步骤 a)自月经流分离月经干细胞； b)收集分离自月经流的月经干细胞；及 c)选择表达⑶117的月经干细胞。
30.一种月经干细胞群，其包含至少一种下列细胞标记⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD 166 及 HLA I 类。
31.一种经富集化的细胞群，其包含 a)表达至少一种包含下列的细胞标记⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及HLA I类的月经干细胞；及 b)较低表达或不表达包含CD3及HLAII类的细胞标记中的至少一者的月经干细胞。
32.—种组合物，其包含至少一个月经干细胞及超低温保存剂。
33.一种组合物，其包含至少一个月经干细胞及细胞培养基。
34.一种组合物，其包含至少一个月经干细胞及药妆剂。
35.一种组合物，其包含至少一个月经干细胞及维持细胞存活的保存剂。
36.一种组合物，其包含至少一个月经干细胞及细胞培养基，该组合物位于一容器中以为该至少一个月经干细胞的治疗用途作准备。
全文摘要
本发明提供包含月经干细胞(MSC)的组合物及关于获得其的方法、制程及系统。MSC系经由处理月经期间收集的月经流而得。可将MSC超低温保存，经各个培养及选择步骤处理以为超低温保存作准备，或经处理以供治疗或药妆用。可将经超低温保存的MSC解冻以为治疗及药妆用途作准备。MSC表现CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD49f、CD59、CD81、CD105、CD166及HLA I类且其CD3及HLA II类表现较少或不表现。
文档编号C12N5/071GK102851254SQ20121032254
公开日2013年1月2日 申请日期2008年3月3日 优先权日2007年3月1日
发明者默西迪丝·A·沃尔顿, 朱莉·G·阿利克逊 申请人:干细胞国际公司