二甲基补骨脂素在制备抗多药耐药性肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属制药技术领域，设及二甲基补骨脂素(DMFC)的新用途，即DMFC在制备抗 多药耐药性肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤化疗是治疗肿瘤的一种基本手段，但肿瘤化疗的效果会因为肿瘤细胞获得抗 药性而失败，多药耐药(multiple化ug resis1:ance，MDR)指肿瘤细胞对不同结构和作用机 理的多种药物产生交叉耐药性，是化疗失败的主要原因。MDR的产生机制复杂，其中一个原 因与细胞调亡过程有关，文献指出，促调亡蛋白Bim和抗调亡蛋白Bcl-2在肿瘤细胞调亡过 程中发挥重要作用，所WBim表达量的减少或者Bd-2表达量增加均会导致某些肿瘤细胞产 生多药耐药性。
[0003] 目前临床上使用的抗癌药物，阿霉素，表阿霉素，丝裂霉素，柔红霉素，紫杉醇，长 春新碱，顺销等，均为耐药肿瘤细胞所抗。肿瘤细胞获得的抗药性，并不针对一种抗癌药，而 是对多种抗癌药，即多药耐药，要增加多药耐药肿瘤细胞对药物的敏感性，办法之一就是促 进/抑制Bim/Bcl-2蛋白的功能，增加其蛋白表达量的比例，从而增强肿瘤细胞的调亡，因此 研制促进/抑制运些蛋白功能的药物对肿瘤的化疗有重要意义。
[0004] 本发明所述DMFC是香豆素 (coumarin)衍生物，由多种化合物进行多步反应修饰后 得到。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种二甲基补骨脂素在制备抗多药耐药性肿瘤药物中的应 用，具体是制备抗多药耐药性肝癌药物中的应用，是DMFC的一种新的用途，所述的二甲基补 骨脂素(DMFC)是经多步化学反应修饰所得的香豆素衍生物，分子式为Ci3Hi〇〇3,分子量214。 所述药物由DMFC与制剂允许的药物赋形剂或载体组成。DMFC的化学结构：
[0006]
[0007]本发明提供的药物，其制剂形式为液体制剂、固体制剂，主要包括颗粒剂、片剂、冲 剂、软胶丸、软胶囊、滴丸剂或注射剂。
[000引本发明提供的药物，制剂的给药形式主要包括口服给药或注射给药。
[0009] DMFC对多药耐药肝癌细胞R-HepG2(RD)的杀伤作用明显优于紫杉醇，阿霉素，顺销 等临床常用药，DMFC杀死多药耐药肝癌细胞的机理是促进促调亡蛋白Bim的增加并抑制抗 调亡蛋白Bcl-2从而诱导肝癌细胞调亡，目前临床上缺乏能逆转多药耐药性肿瘤的药物，因 此DMFC具有很好的制备抗多药耐药性肿瘤药物的应用前景。
【附图说明】
[0010] 图1:不同浓度DMF巧审制R-H邱G2(畑)体外增殖比较。
[0011 ] 图2:DMFC诱导畑细胞调亡的Annexin V-PI双染调亡比较图。
[001^ 图3:01。(：诱导畑细胞PARP蛋白剪切比较图。
[0013] 图4: DMFC诱导畑细胞caspase蛋白剪切比较图。
[0014] 图5: DMFC促进/抑制Bim/Bcl-2表达比较图。
[001引图6:DMFC促进Bax活化的免疫印迹比较图。
[0016] 图7:DMFC促进Bim从Mcl-l中替换Bak结果图。
[0017]图8:DMFC促进Bak活化的流式细胞检测比较图。
[001引图9:DMFC诱导畑细胞线粒体膜电位变化的JC-1染色比较图。
[0019] 图10 :DMFC诱导畑细胞线粒体中细胞色素 C释放比较图。
[0020] 图11 :DMF巧审制小鼠模型实体瘤效果图。
【具体实施方式】
[0021] W下将结合具体实施例与附图详细说明本发明，运些实例仅用于说明目的，而不 用于限制本发明范围。
[0022] 实施例一:DMFC化合物的获得 [002引实验方法
[0024] 1.合成：将20ml间二苯酪(70mM)和乙酷乙酸乙醋（70mM)的混合溶液在0°C逐滴加 入120ml的出S化(12M)溶液中，恢复室溫后揽拌12h。然后混合液倒入100ml冰水中，过滤收集 固体后再用冰水洗涂一次。再在甲醇中重结晶得到纯白色7-径基-4-甲基香豆素（11.12g， 90%)。室溫下，逐滴把将溶解于75ml丙酬和75ml二氯甲烧的K2C〇3(62mM)和氯丙酬(45mM， 4.16g)加入上述7-径基-4-甲基香豆素(31mM，5.46g)中并用力揽拌。加入完成后，用薄层色 谱法回流4她后冷却过滤，滤液减压蒸发后获得的残渣在甲醇中重结晶得到5.61g白色固 体。在氮气环境中，将上述固体5.3：3g溶解在140mWa0H( 1M)中回流2地，冷却后用2M的HC1处 理。得到的沉淀用冰水洗涂后在甲醇中重结晶即得到固体DMFC(4.04g)。
[00巧]2.实验结果:DMFC，分子式为打抽1〇〇3,所得DMFC的化学结构如下：
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[0027] 实施例二肝癌多药耐药细胞RD对临床抗肿瘤药的敏感性实验
[0028] 材料和方法：
[0029] 阿霉素 J顿销，紫杉醇，MTT均购自Sigma公司，Bel-2蛋白抗体购自Santa Cruz， Bim，细胞色素 C等蛋白抗体购自CSTdDMFC溶解在PBS中配成lOmg/ml母液，置于-20°C冰箱， 实验时用培养液稀释成所需浓度供用。
[0030] 肝癌细胞Η邱G2购自美国American Type Qilture Collection,耐药细胞R-H邱G2 (RD)的建立，系由化pG巧日抗癌药物阿霉素培养，存活下来的细胞继续添加较高浓度的阿霉 素继代培养，不断培养一段时间后，挑选抗药性克隆建系即R-HepG2。
[0031 ] 细胞培养在DMEM培养基（Invitrogene)，添加 5%小牛血清（Invitrogene)，2mM谷 氨酷胺，37 °C，10 % C〇2培养箱。
[0032] 四甲基偶氮挫盐(简称MTT法)检测药物对肿瘤细胞增殖的影响:选择对数生长期 细胞，X 1〇4的密度接种于96孔板中，置37°C，10%培养箱中培养4小时后加入不同浓度 的药物，每个浓度设复孔6个，培养48小时，吸出孔板中培养液，往每孔中加入浓度为Img/ml 的MTT5化1，放入培养箱中继续培养4小时，取出加过MTT的96孔板，每孔加入15化1的DMS0， 轻轻震荡孔板lOmin，待孔底部的结晶物完全溶解后，将孔板放入酶标仪中测波长在570nm 的各孔的光吸收值，记录结果，实验重复Ξ次，用IC50软件计算半数增殖抑制浓度IC50。
[0033] 实验结果见表1和附图1。
[0034] 表1为不同浓度的临床抗肿瘤药阿霉素，顺销和紫杉醇分别作用于RD，其半数增殖 抑制浓度IC50的比较。由表中可见，RD对Ξ种抗肿瘤药的作用，均表现出比DMFC更高的耐药 性。说明RD是来自化pG2的多药耐药细胞株，且对多种抗癌药物有耐受性，尤其抗阿霉素。
[0035] 图1中表示不同浓度DMFC处理RD细胞后细胞的存活情况，DMFC对RD的半数增殖抑 制浓度经计算为25.02μΜ。
[0036] 表1.RD对抗肿瘤药的敏感性
[0037]
[00；3 引
[0039] 实施例SDMFC对RD的体外增殖抑制机制
[0040] AnnexinV-PI双染实验：约3χ105个对数生长期的肝癌RD细胞与DMFC共同解育 4化，，膜酶消化收集细胞，PBS清洗一次，加入50化1的Annexin V-門TC结合缓冲液，含25μ1 的AnnexinV-FITC和5μ1的PI缓冲液，然后避光解育15min，用FACSCanto流式细胞仪 (Becton Dickinson)分析结果。
[0041 ] Western blot实验：3 X106个对数生长期的畑细胞与DMFC共同解育4她，用RIPA裂 解液裂解，14，OOOxg离屯、7min后，用化a壯ord测定蛋白浓度，在12 % SDS-PAGE胶上进行电 泳，胶上的斑点转移到PVDF膜上，然后与抗体在室溫下解育，清洗后再与二抗共同解育。最 后用E化试剂盒(Amersham)进行显色观察。
[0042] 实验结果见附图2、图3和图4。
[0043] 细胞调亡早期，细胞膜上的憐脂酷丝氨酸（PS)会从细胞膜内翻转到细胞膜外， AnnexinV可与其结合，而调亡细胞的细胞膜仍然保持完整，染料PI不能进入细胞进行染 色，因此通过AnnexinV-PI双染实验，可区分调亡与坏死细胞。细胞调亡最典型的特征之 一，是细胞在接受药物作用后，多聚ADP核糖聚合酶(PARP)会发生剪切，而负责细胞调亡过 程中重要作用的半脫氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶(Caspase)也有剪切发生。附图2,表 示畑细胞的AnnexinV-PI图，从左至右每一小图分别代表DMFC浓度0、20μΜ、40μΜ和80μΜ处 理，可W看出DMFC可诱导畑调亡，且畑的调亡程度随着DMFC的浓度增加而增力日，在四个浓度 下的调亡率分别是6.55%，9.15%，11.90%和24.26%。附图3表示PARP剪切的图中，DMFC处 理后通过western blot检测到剪切后的PARP(cleaved PARP)随着DMFC药物浓度的增加而 增加。附图4中可W看到经过DMFC处理的RD细胞内，caspase3，7，8，9蛋白的表达水平没有显 著变化，而其活性形式的剪切caspase(cleaved caspase3,7,8,9)有了显著的增加。
[0044] 实施例Ξ表明，DMF巧Φ制畑体外增殖是通过诱导畑产生调亡。
[0045] 实施例四DMFC诱导畑细胞产生调亡的途径
[0046] 实验材料和方法:实验材料同实施例二
[0047] 方法 1，weste;rn blot同实施例Ξ
[004引方法2，RD细胞中Bim和Bcl-2转录水平变化