一种阿司匹林耐药性监测试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物监测领域，特别涉及一种阿司匹林耐药性监测试剂。
【背景技术】
[0002] 冠状动脉，脑血管，外周动脉的粥样血栓在全球人类发病率和死亡率上位于前列， 并且不断增长，其中关键的原因之一就是粥样硬化血栓成分为活化和聚集的血小板。因此 抗血小板治疗成为治疗此种紊乱的核心方式。一项研宄表明在高危脉管患者中，阿司匹林 的治疗可降低34%非致命的心肌梗塞，25%的非致命心绞痛，18%所有原因的死亡率。
[0003] 阿司匹林（aspirin, Acetylsalicylic Acid, ASA)作为解热、镇痛和抗炎药物在 临床上应用已经有100多年的历史了，而作为抗血小板聚集药物是从上世纪50年代开始。 近年来，各项试验结果逐渐阐明了 ASA抗栓的机制：血小板上的环氧化酶（COX-1)可作用于 花生四烯酸，细胞中的花生四烯酸以磷脂的形式存在于细胞膜中。多种刺激因素可激活磷 脂酶A，使花生四烯酸从膜磷脂中释放出来。游离的花生四烯酸在（COX)的作用下转变成前 列腺素 G2 (PGG2)和前列腺素 H2 (PGH2)。在体内有两种同工酶：C0X-1与C0X-2,两者都 作用于花生四烯酸产生相同的代谢产物PGG2和PGH2。C0X-1是结构酶，正常生理情况下即 存在，主要介导生理性前列腺素类物质形成。C0X-2是诱导酶，在炎性细胞因子的刺激下大 量生成，主要存在于炎症部位，促使炎性前列腺素类物质的合成，可引起炎症反应、发热和 疼痛。血小板内有血栓素 A2 (TXA2)合成酶，可将COX的代谢产物PGH2转变为TXA2,有强 烈的促血小板聚集作用。血管内皮细胞含有前列环素（PGI2)合成酶，能将COX的代谢产物 PGH2转变为PGI2,它是至今发现的活性最强的内源性血小板抑制剂，能抑制ADP、胶原等诱 导的血小板聚集和释放。血小板产生TXA2的与内皮细胞产生PGI2的之间的动态平衡是机 体调控血栓形成的重要机制。
[0004] 阿司匹林可使COX丝氨酸位点乙酰化从而阻断催化位点与底物的结合，导致COX 永久失活，血小板生成TXA2受到抑制。血小板没有细胞核不能重新合成酶，血小板的COX 一旦失活就不能重新生成，因此阿司匹林对血小板的抑制是永久性的，直到血小板重新生 成。血小板的寿命约7~10天，每天约有10%的血小板重新生成，每天1次的阿司匹林足 以维持对血小板TxA2生成的抑制。内皮细胞是有核细胞，失去活性的可在数小时内重新合 成。总体来说阿司匹林可充分抑制血小板具有促栓活性的TxA2的合成，而对内皮细胞具有 抗栓活性的PGI2影响不大。因此小剂量的阿司匹林发挥的是抗栓作用。血小板活化中环 氧酶作用途径如图6所示。 阿司匹林是广泛使用的防止心血管疾病的辅助处方，因为它可以抑制血栓素 A2 (TxA2)的生成。但最近的研宄显示并非所有的个体对于阿司匹林的反应都是一致的。大约 30%的个体服药者对阿司匹林耐药，也就是常说的不起作用，因此监控阿司匹林疗效变得更 加关键和重要。
[0005] 直接测定患者对阿司匹林的反应是指测定TxA2的循环水平，不幸的是，TxA2在血 液中的寿命很短，这样分析TxA2就非常困难，但是它会在酶的作用下分解成很多代谢物包 括lldhTxB2和11-去氢-2, 3-dinor血栓素 B2(lldh2, 3DTxB2)，它们被肾脏吸收，排泄在 尿液里。lldhTxB2在尿液中非常稳定，是TxB2在尿液中最丰富的代谢物，lldhTxB2是一种 生物非活性物质，是TxA2的下游代谢产物，其半衰期较长，它在尿液中排出，相对不受来自 体内血小板活性和其他分析前变量的影响。这些性能使尿lldhTxB2成为一个良好的、可靠 的生物标志物，来评估血小板活性。此外，纯化的lldhTxB2在室温下很稳定，如果在冷冻下 存储可保存更长的时间。
[0006] 因此研宄用于检测尿液中的lldhTxB2免疫的检测试剂，用于测定阿司匹林耐药 监测是临床所需要解决的问题。
【发明内容】
[0007] 为了解决以上问题，本发明提供了一种使用方便、成本低、检测速度快、检测灵敏 度高、检测精度高、线性范围广且稳定性高的阿司匹林耐药性监测试剂。
[0008] 本发明的技术方案为： 一种阿司匹林耐药性监测试剂，由试剂R1、试剂R2和lldhTxB2参考标准品组成；所述 试剂 Rl 由 Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG 和 NaN3组成；所述试剂 R2 由 Tris、NaCl、BSA、 Tween-20、NaN3、蔗糖和lldhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；所述lldhTxB2参考标准品 由 lldhTxB2 标准品、Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA 和 NaN3组成。
[0009] 其中，BSA作为稳定剂，同时具有避免非特异性反应的作用；Tween-20起到避免非 特异性反应的作用；NaN 3为防腐剂；Rl中PEG作为促凝剂。
[0010] 优选的，所述试剂 Rl 由 10-100 mM Tris、50-200 mM NaCl、0. 05-1 wt% BSA、 0· 01-0. lwt% Tween-20、0. 5-3wt% PEG 和 0· 06-0. 15 wt%NaN3组成；所述试剂 R2 由 10-100 mM Tris、50-200 mM NaCl、0. 05-1 wt% BSA、0. 01-0. lwt% Tween-20、0.06-0.15wt% NaN3、 l-10wt%蔗糖和0. 1-lwt% lldhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；所述lldhTxB2参考标 准品由 600-80000pg/mL lldhTxB2 标准品、10-100 mM Tris、50-200 mM NaCl、0. 05-1 wt% BSA、0. 01-0. lwt% Tween-20、0. 5-5mM EDTA 和 0· 06-0. 15wt% NaN3组成。
[0011] 优选的，所述试剂Rl中PEG的数均分子量为5000-8000。
[0012] 作为优选，所述试剂R1、试剂R2和lldhTxB2参考标准品的pH均为7-8。
[0013] 优选的，所述lldhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球为交联有lldhTxB2抗体的粒径为 50_300nm的聚苯乙稀胶乳纳米微球。
[0014] 作为优选方案，所述lldhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球的制备步骤如下： 1) 用MES缓冲液将表面带有用于交联lldhTxB2抗体功能基团的、直径50-300nm的聚 苯乙烯胶乳纳米微球稀释至终浓度为0. 5-3 wt %，加入20-90mM EDAC，混合均匀，室温震荡 反应20-80分钟； 2) 离心步骤1)混合液，弃上清液，用MES缓冲液清洗两次，最终胶乳纳米微球重悬于 MES缓冲液至终浓度为0. 3-3wt%，超声，进行分散，得微球分散液； 3) 用MES缓冲液稀释lldhTxB2抗体至l-3mg/ml，与步骤2)中微球分散液等体积混合， 于室温反应2-4小时； 4) 将步骤3)反应液离心，用Tris缓冲液重悬微球，室温下，反应1-3小时； 5) 离心步骤4)反应液，弃上清液，用Tris缓冲液清洗胶乳纳米微球3次，即获得 lldhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球。
[0015] 其中步骤3)使得lldhTxB2抗体上的氨基与聚苯乙烯胶乳纳米微球上的羧基交 联。步骤4)的作用在于封闭聚苯乙烯胶乳纳米微球上未与抗体交联的羧基。
[0016] 进一步的，所述用于交联lldhTxB2抗体的功能基团为羧基。
[0017] 作为优选方案，步骤1)至步骤3)中所述MES缓冲液为酸碱度pH6. 0的50mM MES 缓冲液；其中所述MES缓冲液的配置步骤为，将10. 6625g的MES溶于500mL去离子水中，再 采用lmol/L的标准氢氧化钠溶液调整酸碱度至pH=6,最后转移至1000 mL容量瓶，标定至标 准体积lOOOmL，即可得到酸碱度pH6. 0的50mM MES缓冲液。
[0018] 作为优选，步骤4)以及步骤5)中所述Tris缓冲液为pH7. 4并且含0. 5% BSA、0. 1% Tween-20的50mM Tris缓冲液；所述Tris缓冲液的配置的配置步骤为：将6. 057g Tris溶 于500mL去离子水中，再采用lmol/L的标准HCL溶液调整酸碱度至适当范围，如pH=7,最后 转移至1000 mL容量瓶，标定至标准体积lOOOmL，即可得到50mM Tris缓冲液。
[0019] 本发明采用化学交联方法，将具有高特异性、高亲和力的lldhTxB2抗体偶联至聚 苯乙烯胶乳纳米微球表面的羧基官能团上，当此微球与样本混合时，在促凝剂PEG的作用 下，抗体与样本中的抗原发生特异性结合，形成抗原-抗体-胶乳微粒复合物，产生一定的 浊度变化。在一定范围内，反应液吸光度值与样本中lldhTxB2含量成正比关系。通过测定 一系列已知浓度的lldhTxB2参考标准品与Rl试剂和R2试剂反应后的吸光度，绘制标准曲 线，便可根据待测样本的吸光度值测得lldhTxB2含量。
[0020] 本发明的有益效果为： 本发明在免疫比浊法的基础上引入具有一定粒径的纳米微球，将抗体包被于微球表 面，当抗体与样本中的抗原结合时，形成抗原-抗体-胶乳微粒复合物，增加了浊度变化，从 而提高了检测反应的灵敏度。
[0021] 另一方面，本发明采用化学偶联的技术，将抗体固定包被在微球表面，通过增加抗 体结构的稳定性以提高试剂的稳定性。
[0022] 本发明通过计算与试验，寻找到合适的微球、交联剂、试剂保存液以及保存液中各 组分与抗体的比例等，在提高检测灵敏度的同时，降低反应的非特异性。
[0023] 本发明试剂成本低、使用方便、检测灵敏度高、检测精度高、线性范围广、稳定性高 且特异性强。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0