025] 图1为lldhTxB2单克隆抗体的效价测定图； 图2为不同稀释下的样本数值的线性图； 图3为三个lldhTxB2质控在12个月内的稳定性测试图； 图4为lldhTxB2基线样本与服用阿司匹林的患者样本的比较柱状图；圆柱表示25% 到75%之间的数值，每个圆柱内部的水平线表示本组的中值，点表示落在90%和10%界限 之外的样本数值，用黑点来强调； 图5为服用阿司匹林者与未使用阿司匹林者尿液lldhTxB2浓度数值的频率比较图； 图6为血小板活化中环氧酶作用途径图。
【具体实施方式】
[0026] lldhTxB2单克隆抗体的制备 1、抗原制备 lldhTxB2 (C2Q H32O6，分子量为368. 5,购自SIGMA公司）与钥孔铜蓝蛋白（KLH，购自 SIGMA公司）连接成lldhTxB2-KLH。用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸 化物（EDC或EDAC，购自SIGMA公司），将lldhTxB2的羧基交联到KLH的氨基上。
[0027] 2、动物免疫 准备SPF级6周龄雌性Balb/c品系小鼠（中国科学院北京实验动物中心）4只，首次 免疫，用lldhTxB2-KLH与弗氏完全佐剂的两后腿股四头肌多点注射。每只小鼠注射50 μ g 抗原。第二次，用lldhTxB2-KLH与弗氏不完全佐剂的抗原乳浊液免疫，每隔三周免疫一次， 共免疫三次。第三次免疫后十天，眼眶取血，离心制备血清，储存于_20°C备用。做细胞融合 前3天，加强免疫小鼠一次，免疫方法同前，仅用抗原，不加免疫佐剂。
[0028] 3、杂交瘤细胞建株 3. 1细胞准备 A，骨髓瘤细胞的准备：收集经8-氮鸟嘌呤（8-氮鸟嘌呤购自Invitrogen)筛选过的骨 髓瘤细胞SP2/0,将显微镜下观察细胞活性良好的对数增殖期的细胞洗涤后计数，细胞悬浮 在DMEM(购自Invitrogen)培养液中备用。
[0029] B，饲养层细胞的准备：融合前一天，将5mlDMEM培养液注入小鼠腹腔，轻轻晃动后 抽出腹腔液，离心，计数，调整细胞浓度为IX l〇5/ml，接种到96孔培养板内，50 μ 1/孔。
[0030] C，脾脏细胞的准备：解剖小鼠，取脾脏，用机械法分散脾细胞，经滤网过滤得脾细 胞悬液，DMEM培养液洗涤后计数。
[0031] 3. 2细胞融合 取I X 107SP2/0细胞与5 X 107脾细胞（按1:5比例）混合于50ml离心管中，加入DMEM 无血清培养液，离心，1500rpm，3min，弃上清。振松沉淀细胞，逐滴加入50%(v/v)PEG (分子 量1500) lml，边加边摇晃，Imin内加完。静置90秒，让PEG继续作用。然后在2. 5min内逐 滴加入37°C预温的无血清DMEM培养液IOml，静置5min，终止PEG的作用。融合后细胞悬液 离心，lOOOrpm，3min。弃上清，沉淀细胞轻轻打匀，加入25ml完全培养液（DMEM+10%FBS)，接 种于加有饲养层细胞的96孔板内，50μ1/孔，置37°C，5%C02培养箱内培养。第二天，加 入含2 XNGALT (Sigma-Aldrich)的完全培养液，100 μ 1/孔，杀死未融合的骨髓瘤细胞。
[0032] 3. 3杂交瘤细胞筛选 A，ELISA检测方法的建立：lldhTxB2-KLH，KLH用0. 05Μ ρΗ7. 4磷酸盐缓冲液稀释成 5-1(^8/1111，包被到96孔微孔板（(：〇11^1^)内，10(^1/孔，4°〇，过夜。用稀释液（含10%(￥/ v)FBS的PBS，pH7. 4)封闭37°C，2小时。检测抗体时，平行加入待测孔内杂交瘤细胞培养上 清（100μΙ/孔）到lldhTxB2-KLH，KLH分别包被的板孔里。同时设置阳性、阴性对照，阳性 对照为稀释过的免疫后小鼠血清，阴性对照为新鲜DMEM培养液，在37°C孵育2小时。洗板 后加入辣根过氧化物酶（HRP)标记的羊抗小鼠 IgG抗体（50 μ 1/孔），37°C孵育1小时后， 洗板，用TMB底物（Sigma-Aldrich)显色（IOOul/孔），反应10min后，加入2M HCL终止反 应（50 μ 1/孔）。在ELISA读板仪（Thermo Scientific)上，测定各待测孔样品在波长在 450nm下的吸光度（OD)值。对lldhTxB2-KLH抗原阳性，对KLH抗原为阴性的杂交瘤细胞进 行克隆化。
[0033] B，杂交瘤细胞克隆化： 选择抗体阳性且OD值高的孔用有限稀释法对其中的杂交瘤细胞进行克隆化，一般稀 释到0. 8个细胞/孔。待细胞培养至20%板底面积时，吸取细胞培养上清用ELISA方法再 次筛选抗体阳性孔。若连续3次克隆，每次克隆率小于2/3和阳性率都为100% ;这样获得的 细胞即为单克隆。IX 106细胞在IOml培养上清培养3日后，取上清进行ELISA检测，以OD 值较高的孔为指标进行筛选，结果共获得5株杂交瘤细胞系，各株杂交瘤细胞的滴度见表 1，从中选择本发明的1个杂交瘤细胞系，命名为lG-2f-3c，其分泌的单克隆抗体属于IgGl， κ型（Bio-Rad抗体亚型鉴定试剂盒）。
[0034] 表1，各株杂交瘤细胞的培养上清抗体滴度
【主权项】
1. 一种阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：由试剂R1、试剂R2和lldhTxB2参考标 准品组成；所述试剂Rl由1'1^8、似(：1、854、了￥6611-20、？￡6和似％组成；所述试剂1?2由1'1^8、 似〇1、834、了￥6611-20、似队、蔗糖和11(11^182抗体致敏胶乳纳米微球组成 ；所述11(11^182参 考标准品由 11dhTxB2 标准品、Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA和NaN3组成。
2. 如权利要求1所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述试剂Rl由10-100 mMTris、50-200mMNaCl、0.05-lwt%BSA、0.01-0.1wt%Tween-20、0.5-3wt%PEG和 0.06-0.15wt%NaN3组成；所述试剂R2 由 10-100mMTris、50-200mMNaCl、0. 05-1wt%BSA、0.01-0.1wt%Tween-20、0.06-0.15wt%NaN3、l-10wt% 蔗糖和 0.1-lwt%lldhTxB2 抗 体致敏胶乳纳米微球组成；所述lldhTxB2参考标准品由600-80000pg/mLlldhTxB2标准 品、10-100mMTris、50-200mMNaCl、0. 05-1wt%BSA、0. 01-0.lwt%Tween-20、0.5-5mM EDTA和 0. 06-0. 15wt%NaN3组成。
3. 如权利要求I所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述试剂Rl中PEG的 数均分子量为5000-8000。
4. 如权利要求1所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述试剂R1、试剂R2 和lldhTxB2参考标准品的pH均为7-8。
5. 如权利要求1所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述lldhTxB2抗体致 敏胶乳纳米微球为交联有lldhTxB2抗体的粒径为50-300nm的聚苯乙稀胶乳纳米微球。
6. 如权利要求1或5所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述IldhTxB2抗 体致敏胶乳纳米微球的制备步骤如下： 1) 用MES缓冲液将表面带有用于交联lldhTxB2抗体功能基团的、直径50-300nm的聚 苯乙烯胶乳纳米微球稀释至终浓度为0. 5-3wt%，加入20-90mMEDAC，混合均匀，室温震荡 反应20-80分钟； 2) 离心步骤1)混合液，弃上清液，用MES缓冲液清洗两次，最终胶乳纳米微球重悬于 MES缓冲液至终浓度为0. 3-3wt%，超声，进行分散，得微球分散液； 3) 用MES缓冲液稀释lldhTxB2抗体至l-3mg/ml，与步骤2)中微球分散液等体积混合， 于室温反应2-4小时； 4) 将步骤3)反应液离心，用Tris缓冲液重悬微球，室温下，反应1-3小时； 5) 离心步骤4)反应液，弃上清液，用Tris缓冲液清洗胶乳纳米微球3次，即获得 lldhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球。
7. 如权利要求6所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：所述用于交联 lldhTxB2抗体的功能基团为羧基。
8. 如权利要求6所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：步骤1)至步骤3)中 所述MES缓冲液为酸碱度pH6. 0的50mMMES缓冲液；其中所述MES缓冲液的配置步骤为， 将10. 6625g的MES溶于500mL去离子水中，再采用lmol/L的标准氢氧化钠溶液调整酸碱 度至pH=6,最后转移至1000 mL容量瓶，标定至标准体积1000mL，即可得到酸碱度pH6. 0的 50mMMES缓冲液。
9. 如权利要求6所述的阿司匹林耐药性监测试剂，其特征在于：步骤4)以及步骤5) 中所述Tris缓冲液为pH7. 4并且含0. 5%BSA、0. 1%Tween-20的50mMTris缓冲液；所述 Tris缓冲液的配置的配置步骤为：将6. 057gTris溶于500mL去离子水中，再采用lmol/L
【专利摘要】本发明公开了一种阿司匹林耐药性监测试剂，属于生物监测领域。本发明的监测试剂由试剂R1、试剂R2和11dhTxB2参考标准品组成；试剂R1由Tris、NaCl、BSA、Tween-20、PEG和NaN3组成；试剂R2由Tris、NaCl、BSA、Tween-20、NaN3、蔗糖和11dhTxB2抗体致敏胶乳纳米微球组成；11dhTxB2参考标准品由11dhTxB2、Tris、NaCl、BSA、Tween-20、EDTA和NaN3组成。本发明试剂检测精度高、线性范围广且稳定性高。另外，将抗体包被于微球表面，抗体与样本中的抗原结合时，形成抗原-抗体-胶乳微粒复合物，增加了浊度变化，提高了检测灵敏度。
【IPC分类】G01N33-546
【公开号】CN104792982
【申请号】CN201510103262
【发明人】李胜华, 张立民, 史建军
【申请人】山东盛百灵医药科技有限公司
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月10日