一种多孔二氧化铈纳米棒复合结构及基于该结构的酶溶液的制备方法和酶联免疫分析应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于纳米材料技术领域，涉及多孔二氧化铈纳米棒及其应用，具体涉及一 种多孔二氧化铈纳米棒复合结构及基于该结构的酶溶液的制备方法和酶联免疫分析应用。
【背景技术】
[0002] 酶联免疫分析（Elisa)是一种被广泛认可的强有力的检测蛋白的方法。该方法具 有高灵敏度及标准的操作程序，通常使用辣根过氧化物酶（HRP)标记的免疫试剂产生信号 来检测目标分子。尽管具有方法多样及灵敏度较高等优点，但其也有一些缺点。比如需要 复杂且昂贵的提取工艺、蛋白酶的温度及PH稳定性差，反应过程对温度依赖性强等缺点。 过去的十年里，研宄者都希望出现一种易于大量制备并且易于储运，反应条件要求不高的 Elisa模拟酶，同时该体系具有足够的灵敏度和准确性。
[0003] 纳米粒子参与的Elisa有以下几种方式：纳米颗粒修饰生物大分子后可以为传统 的Elisa体系提供更强大的检测能力。在直接的目视化分析中（许多的胶体金法试纸条）， 纳米粒子本身可以作为显色物参与检测，这种检测体系的主要机制是纳米粒子的尺寸发生 变化（主要是团聚）带来颜色的变化（Nat Protoc. 2013S印；8 (9) : 1759-64.)。基于这一 理念，前列腺特异抗原（prostate specific antigen, PSA)和HIV-I衣壳抗原p24在全血 样本中的检测限可低至2pg(Nat Nanotechnol. 2012Dec ;7(12) :821-4.)。此外，鉴于纳米 粒子具有很高的比表面积，相对于传统的体系中的微孔板可以提供更多的抗原/抗体结合 位点，具有增强检测信号的作用（Chem Commun. 2012N〇V 11 ;48 (87): 10784-6)，可以大大提 高检测限。最重要的是，许多种纳米颗粒自身具有过氧化物模拟酶活性，可以直接取代传统 Elisa反应中的HRP酶，近年来越来越多的研宄者进入到这一领域开展研宄，以期望克服传 统Elisa体系成本昂贵，保存条件相对较高的缺点。
[0004] 近些年来，Fe304、Ti02、Co 3O4和Au/rGO等纳米颗粒相继发现具有过氧化物模拟 酶活性，可以取代传统Elisa中的HRP，实现对目标分子的高灵敏度检测。如利用Fe 3O4的 过氧化物模拟酶活性开发出的多种Elisa检测体系，可以实现对乙型肝炎病毒表面抗原 和肌钙蛋白的检测（Nat Nanotechnol. 2007S印；2(9) :577-83)。Co3O4纳米颗粒发挥其 过氧化物模拟酶活性取代传统的Elisa体系中HRP酶的作用，实现了对肿瘤组织中血管 内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF)的检测（ACS Appl Mater Interfaces. 2014Febl2 ;6 (3) : 1959-70)。前面所研宄的材料都存在模拟酶催化能力受温度 影响比较大的缺点，这给实际应用带来很大困难。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种多孔二氧化铈纳 米棒复合结构及基于该结构的酶溶液的制备方法和酶联免疫应用，该氧化铈纳米棒复合结 构制备的模拟酶溶液对抗体或抗原的检测响应范围宽、灵敏度高，检测限能够达到IOpgAiL 的水平，制备方法简单易行，Elisa检测方法易操作、环境适应性好、不受环境温度影响。
[0006] 本发明是通过以下技术方案来实现：
[0007] -种多孔二氧化铺纳米棒-抗原或抗体复合结构，由二氧化铺纳米棒及包被于其 外表面的抗原或抗体组成；该复合结构中每0. 1~IOmg的二氧化铈纳米棒加入的抗原或抗 体的量为〇· 5~20 μ g。
[0008] 所述二氧化铈纳米棒为圆柱状，且表面密布介孔。
[0009] 所述抗体为兔抗人IgG、羊抗鼠 IgG、羊抗兔IgG和小鼠白介素抗体中的一种或几 种；所述的抗原为人乳腺癌的特异性抗原CA15-3、卵巢癌抗原CA125、胃癌抗原CA72-4或前 列腺癌抗原PSA。
[0010] 一种二氧化铈纳米棒模拟酶溶液的制备方法，先将二氧化铈纳米棒、抗原或抗体 及包被缓冲液，混合均匀后，恒温孵育；然后离心去除游离的抗原或抗体，制得抗原或抗体 包覆后的二氧化铺纳米棒；最后经重悬处理，制得二氧化铺纳米棒模拟酶溶液。
[0011] 一种二氧化铈纳米棒模拟酶溶液的制备方法，将1~IOrng的二氧化铈纳米棒和 0. 5~20 μ g抗原或抗体分散到10~50mL包被缓冲液中，混合均匀后，恒温孵育；然后在 10000~12000rpm下离心并清洗处理，制得抗原或抗体包覆后的二氧化铺纳米棒，最后经 重悬处理，制得二氧化铈纳米棒模拟酶溶液。
[0012] 所述包被缓冲液为含有BSA的缓冲溶液，该缓冲溶液选用三羟甲基氨基甲烷缓冲 液、磷酸缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中的一种或几种。
[0013] 恒温孵育是在25~38°C下进行，孵育时间为6~12h。
[0014] 本发明制得的二氧化铈纳米棒模拟酶溶液在酶联免疫分析中的应用。
[0015] 采用本发明制得的二氧化铈纳米棒模拟溶液检测抗体或抗原的方法，包括以下步 骤：
[0016] 1)将75~200 μ L的二氧化铈纳米棒模拟酶溶液加入抗原或抗体包被的微孔板 中，在4~44°C孵育30~120min后用缓冲溶液进行清洗；
[0017] 2)然后加入含有显色底物的磷酸-柠檬酸缓冲溶液反应10~45min，磷酸-柠檬 酸缓冲溶液的pH值为3~6 ;
[0018] 3)最后加入终止液终止反应，并使用酶标仪监测其吸光度的变化。
[0019] 所述显色底物为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺、2, 2' -联氨-双（3 -乙基苯并噻唑 啉-6磺酸）二胺盐或邻苯二胺；所述终止液为硫酸溶液或十二烷基磺酸钠溶液。
[0020] 与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
[0021] 本发明公开的多孔二氧化铈纳米棒-抗原或抗体复合结构中含有两部分结构：作 为催化场所的二氧化铈纳米棒外表面和作为免疫结合位点的抗体或抗原，其包被于二氧化 铈纳米棒外表面。该复合结构由于二氧化铈纳米棒的比表面积大，为免疫反应提供更多的 结合位点，因此信号的放大，增强灵敏度；可以实现结合位点与催化位点的互不干扰，共存 的抗原或抗体蛋白对纳米结构的催化活性没有明显的影响。表面的Ce 3+具有类似于HRP酶 的过氧化物模拟酶活性，能够替代传统的HRP酶实现Elisa检测，并且具有更好的反应稳定 性，易于储运。
[0022] 本发明还公开二氧化铈纳米棒模拟酶溶液的制备方法，使用的纳米颗粒成本低 廉、易于制备和储运、反应环境适应性好、不受环境温度影响，同时具有极高的灵敏度和准 确性。该氧化铈纳米棒模拟酶溶液对抗体或抗原的检测响应范围宽、灵敏度高，检测限能够 达到10pg/mL的水平。
【附图说明】
[0023] 图1是本发明实施例1所制备的二氧化铈纳米棒的透射电子显微镜照片；
[0024] 图2为本发明实施例1所制备的二氧化铈纳米棒的比表面积和Ce3+比例数据图；
[0025] 图3为本发明实施例2中二氧化铈纳米棒作为过氧化物模拟酶的反应动力学分析 即底物浓度与催化氧化反应速度的关系；
[0026] 其中，A、B分别为以TMB为底物时，HRP酶和二氧化铈纳米棒模拟酶的反应动力学 曲线；C、D分别为以H 2O2为底物时，HRP酶和二氧化铈纳米棒模拟酶的反应动力学曲线；
[0027] 图4-1为本发明实施例3中经过不同温度处理后的二氧化铈纳米棒的相对反应活 性；
[0028] 图4-2为本发明实施例3中经过不同pH值处理后的二氧化铈纳米棒的相对反应 活性；
[0029] 图4-3为本发明实施例4中在不同的反应温度下二氧化铈纳米棒的相对反应活 性；
[0030] 图5为本发明实施例6中二氧化铈纳米棒参与Elisa反应的流程示意图；
[0031] 图6为本发明检测体系检测灵敏度的待测抗原和吸光度之间指数关系图；
[0032] 图7为本发明检测体系对待测物的专一性分析柱状分析图。
【具体实施方式】
[0033] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理 解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本 发明的范围。对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂厂商购买得到的。
[0034] 为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：
[0035] 第一点，本发明提供一种多孔二氧化铈纳米棒-抗原或抗体复合结构，由二氧化 铈纳米棒及包被于其外表面的抗原或抗体组成，二氧化铈纳米棒为圆柱状，且表面密布介 孔；该复合结构中每〇. 1~IOmg的二氧化铈纳米棒加入的抗原或抗体的量为0. 5~20 μ g。
[0036] 本发明的多孔二氧化铈纳米棒-抗原或抗体复合结构含有两部分结构：作为催化 场所的二氧化铈纳米棒外表面和作为免疫结合位点的抗体或抗原，其包被于所述圆柱状二 氧化铈纳米棒外表面。上述结构的复合结构由于圆柱状二氧化铈纳米棒的比表面积大，为 免疫反应提供更多的结合位点，因此信号的放大，增强灵敏度；表面的Ce 3+具有类似于HRP 酶的过氧化物模拟酶活性，能够替代传统的HRP酶实现Elisa检测，并且具有更好的反应稳 定性，易于储运。当使用二氧化铈纳米棒时，可以实现结合位点与催化位点的互不干扰，共 存的抗原或抗体蛋白对纳米结构的催化活性没有明显的影响。
[0037] 第二点，本发明提供一种二氧化铈纳米棒模拟酶溶液的制备方法，包括：
[0038] 先将二氧化铈纳米棒、抗原或抗体及包被缓冲液，混合均匀后，恒温孵育；然后离 心去除游离的抗原或抗体，制得抗原或抗体包覆后的二氧化铈纳米棒；最后经重悬处理，制 得二氧化铈纳米棒模拟酶溶液。
[0039] 其中，可以用去离子水或包被缓冲液重悬沉淀。重悬所得的二氧化铈纳米棒模拟 酶溶液中的二氧化铺纳米棒浓度为〇· l_l〇mg/mL，如0· 2mg/mL、0. 3mg/mL、0. 5mg/mL、Img/ mL、5mg/mL 或 10mg/mL，更优选为 lmg/mL〇
[0040] 优选地，所述步骤中包被缓冲液选自含牛血清蛋白（BSA)的缓冲溶液；其中，缓冲 溶液可以是三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris)、磷酸缓冲液（PBS)和羟乙基哌嗪乙硫磺酸 (HEPES)缓冲液中的一种或者多种，更优选为三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris)。
[0041] 优选地，所述步骤中恒温孵育的温度为37°C，当然也可以是其它适合温度，比如 25。〇、30。〇、35。〇、40。〇、35-39。〇或 33-38。〇等。
[0042] 优选地，所述步骤中恒温孵育的时间为6