用于治疗氧化应激的螯合纳米铈氧化物的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求于2013年4月25日提交的临时申请序列号61/854, 507， "STABILIZED NANOCERIA FOR THE TREATMENT OF OXIDATIVE STRESS" 的优先权，其公开内 容通过引用整体并入本文。
技术领域
[0003] 本发明一般地涉及纳米医学领域的改进。特别地，本发明涉及用生物相容性材料 制备的含铈纳米颗粒；制备所述纳米颗粒的方法；以及所述纳米颗粒用于治疗疾病（例如 神经退行性疾病）或者治疗因氧化应激（由例如缺血性卒中引起）而产生的并发症的用 途。
【背景技术】
[0004] 氧化应激在许多人类疾病（特别是神经退行性疾病）的发病机制中发挥主要作 用。因此，使用可降低特定自由基物质的抗氧化剂进行治疗在理论上可防止组织损伤并改 善存活和神经结果二者。生理环境中的自由基通常可分类为活性氧簇（reactive oxygen species，R0S)或活性氮簇（reactive nitrogen species，RNS)。自由基是具有高度反应性 的化学物类并且易于在亚细胞水平上与蛋白质、脂类和核酸反应，从而导致产生氧化应激 的多种疾病和事件（例如缺血性卒中）的进展。
[0005] 在纳米医学中使用纳米铺氧化物（nanoceria)的起源可追溯至Bailey和 Rzigalinski的开创性工作，其中观察到将超细铺氧化物颗粒施用于培养的脑细胞大大增 强了细胞存活能力，如 Rzigalinski 在 Nanoparticles and Cell Longevity，Technology in Cancer Research&Treatment 4(6)，651_659(2005)中所描述的。更特别地，当使用通 过反胶束微乳化技术合成的2至10纳米（nm)大小的铈氧化物纳米颗粒处理体外大鼠脑细 胞培养物时，其显示出存活约3至4倍长，如Rzigalinski等人于2003年9月4日提交的 美国专利7, 534, 453中所公开的。铈氧化物纳米颗粒为暴露于由过氧化氢或紫外线暴露所 产生的致死剂量自由基的培养的脑细胞提供了相当大的保护。此外，有报道称铈氧化物纳 米颗粒在鼠体内是相对惰性的，具有较低毒性（例如，尾静脉注射不产生毒性作用）。虽然 没有报道在体内的医学益处，但是假设了用这些铈氧化物（ceria)纳米颗粒进行治疗的益 处，包括降低与伤口、植入物、关节炎、关节病、血管病、组织老化、卒中和创伤性脑损伤相关 的炎症。
[0006] 然而，Rzigalinski等随后在WO 2007/002662中公开了这些特定纳米铺氧化物颗 粒的许多问题。通过这种反胶束微乳化技术产生的纳米铈氧化物具有若干问题：（1)粒径 没有良好地控制在所报道的2至10纳米（nm)范围中，使得批次之间的可变性较高；（2)用 于最终产物加工的表面活性剂尾料如二（乙基己基）磺基琥珀酸钠（也称为多库酯钠或 (AOT))导致了毒性反应；（3)当将这些纳米颗粒放置在生物介质中时，表面活性剂尾料量 的无法控制产生了聚集的问题，导致效力和可递送性降低；以及（4)铈的价态（+3/+4)随时 间不稳定。因此，通过反胶束微乳化技术产生的铈氧化物纳米颗粒在批次之间是高度可变 的，并且对哺乳动物细胞显示出比期望毒性更高的毒性。
[0007] 作为替代方案，Rzigalinski等在WO 2007/002662中描述了由至少三个商业来源 获得的通过高温技术合成的纳米铈氧化物的生物学效力。报道称，铈氧化物纳米颗粒的这 些新来源提供了批次之间活性的优异可再现性。还报道了在不考虑来源的情况下，具有小 尺寸、窄尺寸分布和低聚集速率的铈氧化物颗粒是最有利的。就尺寸而言，该公开内容具体 地教导了在颗粒进入细胞内部的实施方案中，进入细胞内的颗粒的优选尺寸范围为约Ilnrn 至约50nm，如约20nm。在颗粒从细胞外对细胞发挥其作用的一些实施方案中，这些细胞外 颗粒的优选尺寸范围为约Ilnm至约500nm〇
[0008] 这些发明人（Rzigalinski等）还报道了对于递送，纳米颗粒的非聚集形式是有利 的。为了实现该目标，他们报道可在超高纯水中或在用超高纯水制备的生理盐水中超声处 理按重量计约10%的原液。然而，如其他人已注意到的，我们观察到，通过高温技术合成的 纳米铈氧化物（例如，从商业来源获得）的超声处理水性分散体是高度不稳定的并且迅速 沉降（即，在几分钟内），造成施用来自这些来源的纳米铈氧化物的水性分散体时具有显著 的可变性。
[0009] Hardas 等，Toxicological Sciences 116 (2)，562-576 (2010)报道了纳米铺氧化 物的水性分散体的生物分布和毒理效应，所述纳米铈氧化物的水性分散体通过Masui等， J. Mater. Sci. Lett. 21，489-491 (2002)的直接两步热液制备法来制备，其中包括柠檬酸钠 作为生物相容性稳定剂。高分辨率TEM表明，这种形式的纳米铈氧化物具有边缘尖锐的结 晶多面体颗粒形态以及4nm至6nm的窄尺寸分布。报道称，在7. 35的生理pH下，这些经柠 檬酸盐稳定的铈氧化物纳米颗粒分散体稳定超过2个月。因此，在施用前不需要进行超声 处理。
[0010] 然而，相当出乎意料地，他们报道，与先前研究的商业来源的纳米铈氧化物 (Aldrich Chemical Co. (Cat. #639648))相比，这种形式的经梓檬酸盐稳定的纳米铺氧化 物更具毒性，在脑中没有见到，并且对海马和小脑产生很小的氧化应激作用。
[0011] DiFrancesco等在共同转让的于2007年9月4日提交的PCT/US2007/077545， "METHOD OF PREPARING CERIUM DIOXIDE NANOPARTICLES" 中描述了在生物相容性稳定剂 (如柠檬酸（citric acid，CA)、乳酸、酒石酸、葡萄糖酸、乙二胺四乙酸（EDTA)及其组合） 的存在下，在低pH(< 4. 5)下三价铈离子被过氧化氢氧化。具体地，稳定剂乳酸和乳酸与 Η)ΤΑ的组合显示出直接产生了平均粒径为3至Snm的纳米铈氧化物的稳定分散体。
[0012] Reed等在共同转让的于2013年3月15日提交的US2013/0337083，"NAN0CERIA FOR THE TREATMENT OF OXIDATIVE STRESS" 中描述了对于经用柠檬酸（CA)和 EDTA 制备 的纳米铺氧化物处理的小鼠，海马细胞节制（sparing)的协同提高，其中CA/EDTA的摩尔 比为3. 0至0. 1。在慢性进行性多发性硬化、复发缓解型多发性硬化（relapse-remitting multiple sclerosis多发性硬化症）、肌萎缩性侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis)和缺血再灌注损伤的鼠模型中，产生了疾病进展的改善和运动行为测试的改 进。
[0013] 如先前所述，已报道了用于制备含铈纳米颗粒的生物相容性分散体，并且特别是 经柠檬酸和柠檬酸盐离子稳定化的那些分散体的多种方法。然而，仍需要进一步改善经柠 檬酸稳定化的含铈纳米颗粒分散体用于例如治疗氧化应激效应相关疾病和事件（如缺血 性卒中）的自由基清除能力。
[0014] 发明概述
[0015] 根据本发明的一个方面，提供了制备纳米颗粒的分散体的方法，其包括：形成包 含三价铈离子、柠檬酸、稳定剂、氧化剂和水的反应混合物，所述稳定剂选自次氨基三乙酸 (nitrilotriacetic acid)、乙二酉享四乙酉爱（ethylene glycol tetracetic acid)和二亚乙 基三胺五乙酸（diethylenetriaminepentaacetic acid);任选地加热或冷却所述反应混合 物，从而在所述反应混合物中形成含铈纳米颗粒的分散体。
[0016] 在本发明的第二方面中，提供了治疗氧化应激相关疾病或事件（如缺血性卒中） 的方法，其包括：在疾病或事件发生之前、期间或之后施用含铈纳米颗粒，所述含铈纳米颗 粒在柠檬酸和稳定剂的混合物存在下制备，所述稳定剂选自次氨基三乙酸、乙二醇四乙酸 和二亚乙基三胺五乙酸。
[0017] 在本发明的第三方面中，提供了包含铈、柠檬酸和稳定剂的纳米颗粒，所述稳定剂 选自次氨基三乙酸、乙二醇四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸。
[0018] 发明详述
[0019] 应理解，没有具体示出或描述的元件可采用本领域技术人员公知的多种形式。本 发明由权利要求限定。
[0020] 在本申请中，术语纳米颗粒包括平均直径小于IOOnm的颗粒。为了本公开内容的 目的，除非另有说明，否则纳米颗粒的直径是指其流体动力学直径，其是通过动态光散射技 术测定的直径并且包括分子吸附物和颗粒附随的溶剂化壳。或者，可通过分析透射电子显 微镜照片（transmission electron micrograph，TEM)来评估几何粒径。
[0021] 在本申请中，多种含铈材料名义上描述为"铈氧化物"或"铈二氧化物"。化学领域 的技术人员应理解，这些材料中存在的实际氧化阴离子可包括氧化物阴离子或氢氧根阴离 子或其混合物，如水合氧化物相（例如，羟基氧化物）。此外，已知物质的组合物可由多价阳 离子的固体溶液构成，并且被称为非化学计量的固体。因此，对于由多种氧化态的金属阳离 子构成的氧化相，应理解主体相（bulk phase)中存在的氧化物阴离子总量将通过存在的多 种氧化态的金属阳离子（例如Ce3+和Ce4+)的具体量来确定，使得电荷中性得以保持。对于 名义上描述为金属二氧化物的非化学剂量相来说，其具体为化学式MO 2 δ，其中δ (delta) 的值可变化。对于铈氧化物CeO2 δ，δ (delta)的值范围通常为约0.0至约0.5,前者表示 铈（IV)氧化物CeO2，后者表示铈（III)氧化物CeOu(或者表示为Ce 2O3)。或者，δ (delta) 的值表示相对于铈（IV)氧化物（CeO2)存在的氧空位的量。对于存在的每个氧二价阴离子 空位，存在两个三价铈离子（Ce 3+)，以保持电荷中性。
[0022] 在本发明的一个方面中，提供了制备纳米颗粒分散体的方法，其包括：形成包含三 价铈离子、柠檬酸、稳定剂（螯合剂）、氧化剂的反应混合物，所述稳定剂选自次氨基三乙 酸、乙二醇四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸；任选地加热或冷却所述反应混合物，从而在反应 混合物中形成含铈纳米颗粒的分散体。
[0023] 根据至少一个