最终产物分散体的样品在环境温度和压力下在暗处存储多于16个月的时间， 液体的透明度没有改变并且颗粒的流体动力学直径和多分散度也没有改变。
[0080] 在缺血性卒中的鼠模型中评估经稳定化的纳米铈氧化物
[0081] 对由 Estevez, AY 等，Neuroprotective mechanisms of cerium oxide nanoparticles in a mouse hippocampal brain slice model of ischemia,Free Radic. Biol.Med. (2011)51 (6) :1155-63(doi :10. 1016/j.radbiomed. 2011. 06. 006)所述的局部 缺血体外小鼠海马脑切片模型进行修改，评估了含铈纳米颗粒（例如，纳米铈氧化物）降低 氧化应激的能力。
[0082] 通过快速断头处死成年（2至5月龄）⑶1小鼠，快速摘除其脑并放置在经冷冻的 基于胆碱的切片溶液（315m0sm)中，所述溶液包含24mM胆碱碳酸氢盐、135mM氯化胆碱、 1禮犬尿酸、〇.51111〇3(：1 2、1.41111恥孑04、1〇1111葡萄糖、111111((：1和2〇11111%(：1 2。使用1^化& VT1200 振动切片机（Leica Microsystems，Wetzlar，Germany)将横向海马切片（400 μπι 厚）沿卩彖-尾（rostral-to-caudal)轴（-1. 2mm至-2. 8mm前囱）切割，并使其在对照人工 脑脊髓液（aCSF) (pH 7. 4,300m0sm)中恢复1小时，所述人工脑脊髓液包含124mM NaCl、3mM KCl、2.4mM CaCl2、1.3mM MgS04、1.24mM K3P04、26mM NaHCO3UOmM 葡萄糖并用 5% C02、95% O2气体进行鼓泡。将海马切片放置于培养皿中，并在37°C下在具有5% CO 2的NuAire湿润 孵育箱（NuAire，Plymouth，MN，USA)中存储长达48小时。
[0083] 通过在37 °C下将脑切片放置在低血糖、酸性和缺氧的aCSF (葡萄糖和pH分别降至 2mM和6. 8,并且溶液用84% N2、15% 0)2和1 % 0 2进行鼓泡）中放置30分钟来诱导局部缺 血的氧化应激。添加蔗糖以将溶液的渗量保持在约295m0sm。
[0084] 在缺血事件发生时，在1 μ g/lml aCSF或培养基的递送体积（相当于5. 8 μ Μ)中 以匹配剂量施用如以上实施例1至5所述制备的含铈纳米颗粒的水性分散体，并且在整个 实验的剩余时间中保留在培养基中。对照切片接受相等体积的载剂对照。对于如本文中所 述制备的铈氧化物纳米颗粒，使用多种递送载剂都取得了相似的成功，所述载剂包括单独 的蒸馏水、盐溶液、柠檬酸钠溶液、PBS及其组合。
[0085] 在暴露于氧化应激（缺血情况）30分钟之后，活的脑切片（测试和对照）通过 将其放置于包含培养基和Millipore插入物（Millipore，Billerica，MA，USA)的35_ 培养皿中而在器官型培养物中孵育24小时。培养基包含50%极限必需培养基（Hyclone Scientific，Logan UT，USA)、25%马血清、25% Hank平衡盐溶液（补充有 28mM葡萄糖、20mM HEPES 和 4mM NaHCO3)、50U/ml 青霉素和 50 μ 1/ml 链霉素 ，pH 7. 2。
[0086] 在氧化损伤24小时之后使用荧光成像技术测定了细胞死亡的程度。除了单独施 用载剂之外，在测试条件（即，施用含铈纳米颗粒）下所研究的每组脑切片与在各方面都进 行相同处理的相似组对照脑切片相匹配。因此，在每个研究日，使取自年龄匹配且性别匹配 的同窝仔畜的解剖学上匹配的两组脑切片经历测试条件（施用含铈纳米颗粒）或对照（单 独施用载剂）。在荧光成像测量期间，光强度、图像捕获持续时间和图像收集时间对于测试 条件和载剂对照脑切片是相同的。结果表示为在实验程序中同一时间点成像的测试条件下 荧光与匹配对照切片中荧光的比值。
[0087] 在氧化损伤24小时之后，将成对的（对照和测试）脑切片在包含0· 81 μ M活体 排泄染料§ΤΓ()ΧΚ Green(Invitrogen，Carlbad，CA，USA)的培养基中孵育20分钟，并 且随后在培养基中清洗15至20分钟以除去未掺入的染料。Green是结合于 DNA和RNA的荧光染料。然而，其在完整的活细胞中通过细胞膜从细胞核中被排除。因此， 其充当活体染料只对死亡细胞或垂死细胞（其中细胞膜变得可渗透使得染料可进入细胞 内部）染色。在染色和清洗之后，将脑切片转移至配备有荧光显微镜附件和150-W氙光源 (Optiquip，Highland Mills，NY，USA)的Nikon TE 2000_U(Nikon Instruments，Melville， NY，USA)显微镜的台上。将对照aCSF溶液负载到60-ml注射器中，经95 % 02/5 % CO2平衡并 使用伺服控制的（servo-controlled)注射器加热部件、回热加热器（stage heater)和同 轴灌注加热器（in-line perfusion heater) (Warner Instruments，Hamden，CT，USA)加热 至37°C。以lml/分钟的速率向脑切片连续地灌注经加热的经95 % 02/5 % CO2平衡的aCSF。5 分钟之后，使用4XPlan Flour物镜（Nikon Instruments)在相同条件下（即，光强度、曝光 时间、相机采集参数）收集每个对照和测试脑切片的海马形成图像。通过在480 ±40nm短暂 地（620ms)激发组织；使用 505nm 的长通二色镜（Chroma technology，Bennington，VT，USA) 过滤来自探针的发射荧光（535±50nm);强化并用冷却的C⑶增益EM照相机（Hamamatsu CCD EM C9100 ;Bridgewater，NJ，USA)测量SYTOXii' Green 荧光。获得了数字图像并使 用 Compix SimplePCI 6. 5 软件（C 成像系统，Cranberry Township，PA，USA)进行处理。
[0088] 由SYTOX? Green装载得到的光强度反映出所计算面积中死亡或垂死细胞的 数目。使用Compix SimplePCI 6. 5软件自动地进行光强度测量，从而消除了选择目标区域 时的实验者偏差。
[0089] 死亡细胞的降低报道为：对于取自年龄匹配且性别匹配的同窝仔畜脑并在同一天 切片并暴露于缺血性氧化应激并且在缺血性损伤后24小时进行荧光成像的解剖学上匹配 的海马部分，测试条件（即经纳米铈氧化物处理）与对照（未处理）的阿蒙角区域（起始层 (oriens layer)、放身寸层和腔隙分子层（stratum radiatum and lacunosum moleculare) 的SYTOXk Green荧光的光强度之比。
[0090] 使用5. 8 μ M的处理浓度在缺血性卒中的小鼠海马脑切片模型中评估含铈纳米颗 粒，所述纳米颗粒如实施例1至5所述用单独的柠檬酸稳定剂，以及用包含DCTA、NTA、EGTA 或DTPA之一和柠檬酸的生物相容性稳定剂的混合物来制备。下表1中给出了作为纳米颗 粒稳定剂的函数的细胞死亡降低（相对于对照降低的百分比）（通常称为节制（sparing)) 的结果。
[0091] 表 1
[0093] 上表1中示出的结果表明，当用柠檬酸（CA)与NTA、EGTA或DTPA的组合制备含铈 纳米颗粒时，节制（即，细胞死亡的大大降低）发生改善。
[0094] 虽然已参照多个具体实施方案对本发明进行了描述，但是应理解，在所述的发明 构思的精神和范围内可做出很多改变。因此，意味着本发明不限于所述的实施方案，而是具 有由权利要求限定的全部范围。
【主权项】
1. 制备纳米颗粒的分散体的方法，其包括： a. 形成包含三价铈离子、柠檬酸、稳定剂、氧化剂和水的反应混合物，其中所述稳定剂 选自次氨基三乙酸、乙二醇四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸；以及 b. 在所述反应混合物中形成含铈纳米颗粒的分散体。2. 权利要求1所述的方法，其还包括加热或冷却所述反应混合物。3. 权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物的温度低于或等于水的沸腾温度。4. 权利要求1所述的方法，其中所述含铈纳米颗粒包含铈的氧化物。5. 权利要求1所述的方法，其中所述含铈纳米颗粒是结晶的。6. 权利要求5所述的方法，其中所述纳米颗粒的特征在于立方萤石晶体结构。7. 权利要求1所述的方法，其中所述氧化剂包含过氧化氢。8. 权利要求1所述的方法，其中所述含铈纳米颗粒是基本上非聚集的。9. 权利要求1所述的方法，其中所述含铈纳米颗粒的分散体在大于约12个月中针对颗 粒聚集和沉降是稳定的。10. 权利要求1所述的方法，其中所述含铈纳米颗粒的分散体的ζ电位为约_15mV至 约-30mV。11. 权利要求1所述的方法，其中所述含铈纳米颗粒的特征在于小于约10纳米的流体 动力学直径。12. 权利要求1所述的方法，其中所述含铈纳米颗粒的分散体用作药物组合物以预防 或治疗疾病或氧化应激相关事件。13. 权利要求12所述的方法，所述疾病或氧化应激相关事件为缺血性卒中、多发性硬 化、肌萎缩性侧索硬化或缺血再灌注损伤。14. 通过权利要求1所述的方法制备的纳米颗粒。15. 纳米颗粒，其包含铺、柠檬酸和稳定剂，所述稳定剂选自次氨基三乙酸、乙二醇四乙 酸和二亚乙基三胺五乙酸。
【专利摘要】描述了用于制备具有生物相容性稳定剂的含铈纳米颗粒的方法，其中提供了包含三价铈离子、柠檬酸、稳定剂(螯合剂)和氧化剂的水性反应混合物，所述稳定剂选自次氨基三乙酸、乙二醇四乙酸和二亚乙基三胺五乙酸；随后进行加热步骤以有效地形成纳米颗粒。这些生物相容性纳米颗粒可用于治疗氧化应激相关疾病和事件，例如缺血性卒中。
【IPC分类】A61K33/24, C01F17/00
【公开号】CN105408257
【申请号】CN201480030435
【发明人】大卫·华莱士·桑福德, 布拉德福德·迈克尔·斯塔德勒
【申请人】丝润有限责任公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2014年4月25日
【公告号】CA2910212A1, EP2989054A2, US20140322333, WO2014176487A2, WO2014176487A3